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.,發(fā)酵車間培訓資料,生產二部 2017.06.12,.,第一部分 意識的培養(yǎng),我們的發(fā)酵屬于純培養(yǎng)，是由單一菌種接種以 后進行的培養(yǎng)，其中不可以有任何雜菌，否則會影 響發(fā)酵的成敗及產品的使用效果，所以為了確保每一批發(fā)酵的成功，在生產過程中菌種、發(fā)酵人員必須具備以下兩種意識： 無菌意識 由于微生物個體小、分布廣泛等特性，發(fā)酵染菌 的途徑有很多，而且如果染菌的話，我們無法及時 做出判斷，必須培養(yǎng)一段時間才能看出來，發(fā)現(xiàn)以 后的結果只能是重消、提前放罐或倒罐，造成不小的損失，所以生產過程中每一個環(huán)節(jié)都必須具備無菌意識，每一步操作都按照操作規(guī)程進行，抓住每一個細節(jié)，才能確保不會染菌。 無菌意識是每一個菌種、發(fā)酵、生測人員具有的意識。,.,2、安全意識 空氣壓力能達到0.25~0.3MPa；正常供氣壓力0.15-0.2MPa，（儀表用空氣注意減壓）；空氣溫度：50+5℃ 蒸汽壓力0.4-0.6MPa以上，防止壓力過高擊穿墊片、閥門等 設備用電；（本崗位熟練人員操作、防水...維修必須專業(yè)電工進行） 機械攪拌；（設備檢修必須切斷電源且有明顯的標識牌、高速離心設備注意平衡及緊鎖裝置） 酸堿、易燃易爆、粉塵：防護措施及應急措施。 ⑤ 進罐檢查：切點電源、明顯標識牌、有人值守 ⑥ 人員著裝 ⑦ 發(fā)酵罐：空消、實消等加熱狀態(tài)打開夾套排污閥，防止夾套或內壁損毀；移種、放罐升高壓力后，不能同時關閉進氣、排氣閥門，防止罐內產生負壓。,.,第二部分、發(fā)酵罐罐體管道結構介紹,空氣路：培養(yǎng)過程中向罐內通無菌空氣 蒸汽管路 物料管路：配料管路、補料管路 取樣路：培養(yǎng)過程中取樣監(jiān)控菌體生長情況 尾氣路：排氣（大排氣、小排氣） 出料路：移種、放罐 夾套進水路：冷凍水、循環(huán)水、熱水（蒸汽） 夾套回水路：冷凍水、循環(huán)水、熱水（蒸汽） 排污管路,.,.,各種圖形、顏色代表的意義,.,.,第三部分、發(fā)酵基本操作過程,.,第一：罐檢 目的：快速檢查發(fā)酵罐，確保發(fā)酵罐正常，可以上罐。 檢查項目： 閥門：所有閥門是否能正常使用、是否處于正確的位置。 壓力表：壓力表是否歸零。 PH和溶氧電極：電極是否拔出并正確保養(yǎng)。 罐體：罐內是否清洗干凈。 攪拌電機：點動電機，看電機運轉是否正常。 攪拌葉輪、消泡裝置是否緊固，有無松動等。 第二：空消 空消主要目的是在進罐生產前對設備清潔和殺滅其他微生物，防止因設備清潔不徹底或設備停用時間過久，微生物滋生，從而對生產造成影響。 1、放罐后及時清洗空消。 2、長期不用罐或更換品種、染菌罐需空消。 3、空消之后無菌空氣保壓待用。,.,空消操作流程,.,第三、電極標定 目的：為了確保電極準確測量，必須在使用前對電極進行標定。 注意事項： 新電極或放置很久的電極必須激活以后才可以進行標定和使用。PH電極用3moL/L的KCl溶液浸泡6小時激活，溶氧電極通電6小時激活。 PH電極標定的時候需要將接地電極放入盛放標準液的燒杯內。 接種以后設定好發(fā)酵參數(shù)，然后進行溶氧電極百分百標定。,.,電極標定參數(shù)：,.,第四：配料 增容： 實消過程中部分蒸汽會冷凝形成冷凝水進入 培養(yǎng)基中，從而導致培養(yǎng)基體積變大，變大的部分 即為增容。不同的地區(qū)，不同的氣候，不同的產品品種及原料增容量都會不同的，需要通過多次實消滅菌總結才能得到一個經(jīng)驗值。10-30% 領料：正確填寫領料單，從倉庫領料，并從領料單簽字確認。 溶料：按工藝要求順序溶解各種原料； 原料全部溶解，無雜質、無硬塊。 投料：確認電極已經(jīng)安裝上，出料一閥已經(jīng)關閉。 考慮增容和種子體積，定容到發(fā)酵消前體積。,.,第五：實消 發(fā)酵罐實消是對發(fā)酵培養(yǎng)基進行徹底的滅菌處理, 利用高溫過飽和蒸汽的強穿透能力使各種細菌、真菌蛋白質凝固而死亡。實消結束以后罐內是無菌的環(huán)境，需通入無菌空氣進行保壓直到培養(yǎng)結束。 實消操作流程預熱：打開夾套排污，用蒸汽進行預熱 當溫度達到90度以上停止預熱，關閉攪拌。升溫：三路進汽；當壓力升到0.05MP a時打開所有 和罐體連接的排汽閥門，消毒過程不得有消毒死角。保壓：調節(jié)三路進氣及排汽，常規(guī)滅菌保壓過程：溫度121 壓力0.12 30分鐘滅菌結束：保壓結束先關閉各小排氣及取樣、放料管路進汽，待罐壓低于精過濾器壓力后，快速關閉空氣管路蒸汽閥門，打開空氣閥門，調整進氣、排氣閥門，保持罐壓0.05-0.1MPa；降溫：開啟冷卻水降溫至工藝要求溫度，降溫過程注意罐壓，防止罐壓掉零。,.,消毒過程中的注意事項 1、首先要結合配料工共同確認本批罐所用的原料為合格品，發(fā)現(xiàn)有結塊、變質的原料不得使用。 2、在用泵向罐中打配制好的培養(yǎng)基時要注意保持稍開些進氣，讓料翻騰，以防（前期）培養(yǎng)基濃度過大沉淀粘附在罐底、結塊等。 3、打完料后首先調至適宜的PH，再確認一下所有的培養(yǎng)基都已加入后封住罐口，開始從進氣口、放料口、取樣口等分路進入蒸汽。各路保持均衡進汽，防止短路 和堵塞，排氣要暢通，排汽量不宜過大，以節(jié)約蒸汽。 4、在實消過程中要保持壓力的穩(wěn)定，不宜突然卸壓升壓以防造成大量泡沫冒頂或逃料。 5、在實消控制時原則上以溫度為準，壓力為輔。但是在保壓時可能出現(xiàn)壓力表與溫度計不對應的情況， 在不能確定到底是溫度計還是壓力表失靈時，當壓力表顯示壓力大于等于0.1Mpa,而溫度不到121℃時，以溫度計為準；反之，則以壓力表為準 ，總之要確保壓力與溫度都達到滅菌要求。,.,6、如遇蒸汽壓力突然升高，罐溫超過規(guī)定，可適當縮短滅菌時間；如遇蒸汽壓力突然下跌，一時上不來，溫度下降到規(guī)定范圍以下，可適當延長滅菌時間，以確保滅菌徹底。嚴防高溫高壓悶罐，否則容易造成培養(yǎng)基成分破壞和PH值升高。 7、在實消結束降溫時在確定空氣過濾器的壓力大于罐壓時，可以先打開空氣進氣閥，再開冷卻水閥以防外界空氣倒吸進去。 8、在降溫過程中嚴防大開排氣閥使罐壓幾乎跌零，特別是種子罐裝料系數(shù)較大，這樣做會使料液翻騰劇烈產生大量的泡沫，易出現(xiàn)冒頂或逃料。 9、在消移種管道時要確保整個管道打氣暢通，嚴防堵塞 或排氣不暢。在消好后，通入無菌空氣（即給管道降溫又能使管道內保持正壓）。 10、移種結束后要把發(fā)酵罐調至正常培養(yǎng)狀態(tài)并交工藝控制人員；填寫移種記錄；移種后對移種管道消毒，吹盡管道內參與種液，放置殘余種液在管道內滋生。,.,第六、接種 接種方法：壓差接種法 接種材料：種子液、火焰圈、95%酒精、酒精棉、鑷子、打火機、石棉手套 注意事項： 環(huán)境：關閉車間門窗和排氣扇，接種環(huán)境周圍禁止人員來回走動，降低空氣流動性；關掉攪拌。 無菌：拔接種針護套時需靠在火焰附近，接種壺不可傾斜過度，避免種子液流出；接種操作過程中罐壓不能掉零； 安全：罐壓不可過高，防止接種管爆裂或脫落，接種失?。?接種之前要確認種子與罐的對應關系，防止接錯種子。,.,第七、工藝控制與記錄 1、記錄 每間隔1小時記錄一次參數(shù)； 主要參數(shù)有PH值、風量、轉速、溶氧值、溫度、壓力和、補料量、備注等。 取樣 依據(jù)工藝要求按時取樣送交化驗部并做好鏡檢工作。 取樣前后的消毒、廢液的收集處理 3.工藝控制 根據(jù)工藝參數(shù)（如溶氧、PH）的變化和檢測（糖、氮、OD、目的產物等）結果，對工藝參數(shù)進行調整控制。 設備巡查 檢查攪拌電機，看電機有沒有異響、過熱等； 檢查酸堿罐、消泡罐和補料罐裝液量，及時補充； 檢查管道、閥門，看有無外漏。,.,第八：放罐 達到工藝放罐標準條件即可放罐，放罐操作流程如下： 提前通知后提取車間準備放罐 取樣（常溫保存和低溫保存） 蒸汽消毒放罐管道 檢查管道閥門 升壓 放罐 吹洗放料管道內殘余料液。 填寫記錄表格（放罐體積、工藝技術指標等） 第九：洗罐 放罐結束以后立即進行洗罐，洗罐流程如下： 卸壓：打開罐蓋前要先卸掉罐壓； 電極保養(yǎng)：拔出電極清洗干凈以后進行正確保養(yǎng)； PH電極用3摩爾每升的KCl溶液浸泡電極頭； 溶氧電極直接通電。 沖洗罐壁：用高壓水槍沖洗罐壁，如果罐壁培養(yǎng)基沖洗不掉則考慮堿煮（5%的堿液用夾套升溫到80℃以后保溫30分鐘）； 排污：排掉污水。,.,第十、檢修 目的：確保閥門、法蘭、機械密封和試鏡燈等不會泄漏，以備下批生產使用； 方法：罐體通入空氣保壓在0.15MPa，然后用肥皂水進行試漏，出現(xiàn)泄漏的閥門待壓力卸掉以后進行檢修，更換相應的墊片。,.,第四部分 染菌的發(fā)生、原因分析及防治 發(fā)酵工業(yè)自從采用純種培養(yǎng)以后，產率有了很大提高，然而防止染菌的要求也更高了。染菌是發(fā)酵工業(yè)的致命傷，輕者影響產率、提取收率、產品質量和三廢治理，嚴重者造成倒罐，浪費大量原材料，造成嚴重經(jīng)濟損失，而且擾亂生產秩序，破壞生產計劃。 在發(fā)酵染菌之后，必須分析染菌原因，總結發(fā)酵染菌的經(jīng)驗教訓，把發(fā)酵染菌消滅在發(fā)生之前，防患于未然，是積極制服發(fā)酵染菌的最重要措施。 一、不同染菌時間對發(fā)酵的影響 1、種子培養(yǎng)期染菌 種子培養(yǎng)主要是生長繁殖菌體，菌體濃度低，培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，比較容易染菌，帶進發(fā)酵罐中危害極大，應嚴格控制種子污染。當發(fā)現(xiàn)種子染菌均應滅菌后倒入地溝，并對種子罐、管道進行檢查和徹底滅菌。 2、發(fā)酵前期染菌 發(fā)酵前期主要是菌體生長繁殖，代謝產物較少，這個時期容易染菌，一旦污染雜菌會迅速繁殖，與生產菌爭奪營養(yǎng)成分和氧分，嚴重干擾生產菌的生長繁殖和產物的生成，要特別防止發(fā)酵前期染菌。緊急處理措施：如果污染危害較大的雜菌不能繼續(xù)運轉，必須重新滅菌。重滅前可適當放出部分發(fā)酵液，并補入適量的培養(yǎng)基特別是氮源使消后的培養(yǎng)基符合發(fā)酵要求，滅后調節(jié)好PH后重新移種或倒種。,.,如果污染的雜菌無大的影響，可以繼續(xù)運轉，但要密切注意發(fā)酵過程的代謝情況和雜菌的變化，必要時可適當降低罐溫、空氣流量、和控制補料量進行發(fā)酵。 3、發(fā)酵中期染菌 發(fā)酵中期染菌將嚴重干擾生產菌的代謝，影響產物的生成。有些雜菌繁殖后產生酸性或堿性物質，使PH值異常變化加堿突增或驟減，糖、氮消耗迅速，菌體自溶，發(fā)酵液發(fā)粘或渾濁，產生大量泡沫，代謝產物的積累迅速減少或停止或下降，有的發(fā)酵液發(fā)臭。發(fā)酵中期染菌，由于營養(yǎng)成分大量消耗，一般挽救處理困難，危害性很大常用的方法有：降低罐溫，控制殘?zhí)橇?，降低空氣流量或冷置待放?4、發(fā)酵后期染菌 發(fā)酵后期產物積累較多，糖等營養(yǎng)物質接近耗盡，如果染菌不太多，可繼續(xù)進行發(fā)酵；如污染嚴重，破壞性較大，可以采取提前放罐。,.,二、不同染菌規(guī)模的原因分析 1、當發(fā)酵出現(xiàn)連續(xù)染菌或大面積染菌，一般是公用系統(tǒng)有問題，特別是空氣系統(tǒng)。總空過濾器失效，過濾效率下降，新裝過濾器要裝好，避免空氣走短路。 接種和中間補糖設備系統(tǒng)有滲漏和死角，也會造成大面積染菌因此要按時檢查維修相關設備。 2、部分發(fā)酵罐染菌，發(fā)生在前期可能是滅菌不徹底或種子罐帶菌所致，同時也與公用接種設備系統(tǒng)有關；染菌發(fā)生在中后期，一般與補料有關。 3、個別罐連續(xù)染菌時要檢查該罐設備的各個部件，查找有無滲漏和死角，如降溫盤管穿孔是造成染菌的多見原因之一。個別罐批偶爾染菌，原因比較復雜，要針對具體情況，視染菌時間和染菌類型，從操作到設備作具體分析。,.,三、從染菌類別上分析原因 1、染革蘭氏陽性桿菌、酵母菌等其它雜菌多是由空氣系統(tǒng)中帶入而造成污染也有可能是種子帶菌 2、染革蘭氏陰性桿菌、特別是球菌大多數(shù)因設備滲漏所致，帶菌的冷卻水或污水，從冷卻盤管、連接法蘭、襯里焊縫中滲漏進入發(fā)酵罐培養(yǎng)基中。 3、染耐熱的芽孢桿菌，可能是培養(yǎng)基或設備滅菌不徹底但并不是絕對的，空氣帶菌也常引起染芽孢桿菌； 4、染霉菌，一般是無菌室滅菌不徹底或操作問題 四、染菌的途徑和防治 （一）種子帶菌及其防治 種子帶菌的原因： 1、培養(yǎng)基及用具滅菌不徹底 菌種培養(yǎng)基及用具滅菌均在滅菌鍋中進行，造成滅菌不徹底主要是滅菌時鍋內空氣排放不完全，造成假壓，使滅菌時溫度還達不到要求。 2、菌種在移種過程中受污染 菌種的移接工作是在無菌室中，按無菌操作進行的。當菌種移接操作不當或管理不嚴，就可能引起污染。,.,3、菌種在培養(yǎng)過程或保藏過程中受污染 菌種在培養(yǎng)過程和保藏過程中，由于外界空氣進入，也使雜菌進入而受污染。為了防止污染，試管的棉花塞應有一定的緊密度，不宜太松，且有一定的長度，培養(yǎng)和保藏溫度不宜變化太大。在放入搖床后要經(jīng)常去檢查種母搖瓶的狀況。 （二）無菌空氣帶菌及防止 空氣凈化系統(tǒng)失效或空氣精過、預過減效是發(fā)酵染菌的主要原因之一。具體防止措施：定期更新主空氣系統(tǒng)的過濾介質，加強平時系統(tǒng)的排污除水，特別是在多雨或潮濕的天氣。確保進入車間之前的空氣升溫至45--55℃，使相對 濕度下降，定時拆檢空氣精過、預過。（做空氣系統(tǒng)無菌檢查） （三）培養(yǎng)基和設備滅菌不徹底帶菌及防止 培養(yǎng)基和設備滅菌不徹底的原因，主要與以下幾個方面有關 1、原料形狀 一般稀薄的培養(yǎng)基容易滅菌徹底，而含有固體顆?；蛘吵頎钗锪蠒r容易由于滅菌不徹底而造成染菌。這就要求在投料時確保攪拌混合均勻。 2、實消時未充分排除罐內空氣 實消時罐內空氣未完全排除造成假壓，使罐頂空間局部溫度達不到滅菌要求，導致滅菌不徹底而污染。因此在實消升溫時，應打開排氣閥門及有關連接管的邊閥、罐頂部的接管邊閥，使蒸汽通過達到徹底滅菌。,.,3、設備管道存在死角染菌及防止 由于操作、設備結構、安裝或人為造成的等原因，引起蒸汽不能到達預定部位，這就是死角。所以發(fā)酵罐要合理簡化安裝管、閥。凡不合理的管、閥、開孔都要堅決去掉，遺留的孔眼要焊平，消除隱患。管道之間盡可能用焊接來代替法蘭，不能用直角彎頭，要保持管道暢通、光滑、密封。主要閥門及其墊應經(jīng)常檢查更換。 4、設備滲漏引起染菌及防止 發(fā)酵設備、管道、閥門的長期使用，由于腐蝕、摩擦、振動或憋壓等原因，往往會造成滲漏。例如：設備的表面或焊縫處有砂眼，由于腐蝕逐漸加深，最終導致穿孔；冷卻管受攪拌器作用，長期磨損，焊縫處受冷熱和振動產生裂縫而滲漏。防止措施：要選用優(yōu)質材料并經(jīng)常檢查，小滲漏不易發(fā)現(xiàn)時可壓入堿性水，在可疑的地方用浸濕的酚酞指示劑的白布擦，如有滲漏時白布顯紅色。 5、操作問題 在發(fā)酵過程中如操作不當也引起染菌，如移種時或發(fā)酵培養(yǎng)時罐內壓力跌零，使外界空氣進入而染菌；泡沫冒頂而造成染菌；壓縮空氣壓力突然下降使發(fā)酵液倒流入空氣過濾器而造成染菌等等；防止措施：加強對一線操作人員的無菌操作培訓和始終貫徹無菌操作制度及責任心教育，加強管理措施。,.,6、環(huán)境衛(wèi)生 發(fā)酵車間和菌種室的內外環(huán)境，必須保持干凈整潔，定期清掃和消毒，車間周圍不得堆放廢棄物，不允許有活菌排放；有異味或易飛揚的物料的貯存，應遠離發(fā)酵車間和菌種室。 五、染菌的檢查 （一）感官檢查 1、大部分染菌的發(fā)酵液可以從發(fā)酵的異常情況來檢出，如色澤、異味、變稠或變稀、加堿速率、菌絲變形產酸不正?；虿划a酸或倒酸而糖卻消耗很快。 2、借助顯微鏡，常用梅蘭染色、結晶紫染色和革蘭氏染色來判斷。 （二）、無菌平皿劃線檢查 平板檢查法既可檢查出雜菌污染，又可以檢查出有無噬菌體污染。檢查雜菌時，先將滅菌后的培養(yǎng)基倒入已經(jīng)滅,.,（四）、環(huán)境衛(wèi)生 發(fā)酵車間和菌種室的內外環(huán)境，必須保持干凈整潔，定期清掃和消毒，車間周圍不得堆放廢棄物，不允許有活菌排放，有異味或易飛揚的物料的貯存，應遠離發(fā)酵車間和菌種室。 七、染菌的檢查 1、培養(yǎng)液的生化指標變化情況。 大部分染菌的發(fā)酵液可以從發(fā)酵的異常情況來檢出，如色澤、異味、粘度、PH、DO、菌絲形狀、產酸、耗糖、產物等。 2、鏡檢：常用美蘭染色、結晶紫染色和革蘭氏染色來判斷。 3、無菌試驗 平板檢查法：既可檢查出雜菌污染，又可以檢查出有無噬菌體污染。檢查雜菌時，先將滅菌后的培養(yǎng)基倒入已經(jīng)滅菌的培養(yǎng)皿內，冷卻后置于37℃恒溫箱內培養(yǎng)24小時，進行鏡檢?；蛘邔⒋龣z樣品置于37℃培養(yǎng)6小時，使細菌生長，增加數(shù)量，然后再劃線接種培養(yǎng)。這樣可以提高平板法的靈敏度 肉湯培養(yǎng)檢查法：主要用于空氣系統(tǒng)和培養(yǎng)基染菌的檢查。具體的做法是將培養(yǎng)液裝在吸所瓶中，滅菌30分鐘后，置于37℃培養(yǎng)24小時，如無混濁即可用于上述兩項的檢查。將無菌空氣或滅菌后的培養(yǎng)基引入后保溫培養(yǎng)，觀察有無混濁現(xiàn)象發(fā)生，如呈現(xiàn)渾濁說明染菌,