病毒感染的實驗室診斷,1,病毒感染實驗室確診的意義,2003年SARS爆發(fā)2008年手足口病的流行群體性發(fā)熱臨床工作中病原的確定 及時準確的實驗室確診非常重要,2,3,Dengue登革熱,麻疹可疑病例的臨床診斷發(fā)熱38OC，出現斑丘疹和至少伴有以下一種癥狀：咳嗽，鼻炎或結膜炎（WHO）,EchovirusesEcho病毒,Measles 麻疹,Parvovirus B19微小病毒B19,HHV-6,Rubella 風疹,Others 其它,4,內容,病毒感染的實驗室診斷方法簡介檢測的結果分析EBV感染的血清學診斷,5,病毒感染的診斷方法簡介,6,病毒感染的診斷類型及方法,7,病毒感染的臨床過程與診斷,8,ELISA的原理,病毒抗原/抗體包被在固相載體表面加入待檢血清，抗原抗-體復合物洗滌，加入酶標記抗人免疫球蛋白，與抗原抗體復合物特異性結合洗滌，加入底物顯色，測OD值,9,10,ELISA結果的判定,目測法：一般加底物后，肉眼下出現顏色的為陽性，無色為陰性臨界值法：以標本OD值陰性對照平均OD值加2-3個標準差作為陽性結果的閾值S/N值法：以S/N值2.1為陽性， S/N值 2.1而1.5為可疑， S/N值1.5為陰性,11,免疫熒光法,間接法和直接法間接法1）固定2）沖洗3）與第一抗體結合4）與第二抗體及免疫熒光抗體結合5）沖洗6）封片、觀察,12,DEAFF test for CMV,(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital),13,PCR,一、PCR基本原理 PCR是一種快速和簡便的DNA體外擴增技術。在模板DNA，引物和4種脫氧核糖核苷三磷酸存在的條件下，利用耐熱DNA聚合酶進行聚合反應，經變性、退火及延伸三步驟多次循環(huán)，對特定DNA模板進行擴增。PCR技術的特異性取決于引物和模板DNA結合的特異性。,14,PCR的要求,目的基因的序列設定引物PCR實驗要求的原料：引物、酶、dNTP、Mg+、模板及緩沖液,15,PCR一次循環(huán)包括三個基本步驟： 1.變性(denaturation)：加熱至9096ºC，DNA 雙鏈模板變成單鏈 2.退火(annealling): 緩慢降溫至30-65 ºC ，引物 與單鏈DNA模板互補結合 3.延伸(extention): 升溫至7074ºC, DNA鏈延伸 （需TaqDNA聚合酶，dNTP， Mg2+） 循環(huán)30次，特異DNA產量達230拷貝(約109),PCR基本步驟,16,PCR擴增靶DNA示意圖,雙鏈靶DNA,變性,退火,延伸,5,3,5,3,5,5,3,3,17,18,19,PCR反應步驟,預變性,退火,延伸,變性,20,PCR animation,21,常規(guī)PCR產物確認,22,熒光定量PCR,23,熒光定量PCR的標準曲線,24,病毒分離,標本接種于敏感細胞觀察細胞病變病毒的鑒定：PCR，IF等,25,Cytopathic Effect,Cytopathic effect of enterovirus 71 and HSV in cell culture: note the ballooning of cells. (Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital, Linda Stannard, University of Cape Town),26,檢測結果的分析,27,一、血清中特異性IgG和IgM的意義,單份血清特異性IgG陽性，只能說明過去有過病毒感染，而不能確定最近感染。只有在發(fā)病初期檢測不到抗體或滴度低，而恢復期抗體4倍以上升高才有診斷意義。測定單份血清中的特異性IgM抗體，有助于疾病的早期快速診斷，但臨床診斷中要結合病程、臨床表現和病毒類型綜合考慮。,28,Typical Serological Profile After Acute Infection,Note that during reinfection, IgM may be absent or present at a low level transiently,29,檢測IgM應注意的問題,持續(xù)的IgM反應：如風疹、CMV等早期妊娠感染或先天性感染的兒童，特異性IgM可能持續(xù)達1年或更長時間IgM型抗體陰性： 1）病程：風疹、出疹后第1天，45%能查到IgM；麻疹、出疹后3天內，70%左右能查到IgM 2）病人的免疫功能：免疫抑制病人,30,3）局部感染4）隱性感染的再激活和再次感染（EBV、CMV等人皰疹病毒）：產生的特異性的IgM少，應查雙份血清的特異性IgG多種病原體IgM抗體同時陽性1、IgM持續(xù)時間2、交叉反應：腸道病毒、黃病毒,31,二、PCR檢測結果的分析,PCR檢測陽性：并不一定說明是病原或活動性感染，要結合臨床、標本來源等綜合分析 可能是正常攜帶病毒或潛伏感染，如腸道病毒，正常人糞便中可以檢測到，但腦脊液中檢測陽性則有臨床意義,32,CMV尿熒光定量PCR陽性不能用于判斷療效和指導治療，但血清中定量PCR與病情嚴重程度相關PCR檢測陰性：要結合臨床病程分析 呼吸道病毒感染、腸道病毒感染一般710天后可能檢測不到病毒核酸,33,三、病毒分離結果,敏感性較低結合臨床病程、癥狀體征和標本來源綜合判定： 1、陽性結果，是否與臨床相符（SARS與衣原體） 2、陰性結果，是否病程已過急性期,34,兒童手足口病患者病原檢測,35,原發(fā)性EBV感染的診斷,36,人類皰疹病毒,37,Burkitts lymphoma in Kenya,Epstein-Barr virus (EBV)1964, discovered from Burkitts lymphoma tissue by Epstein, Achong, and Barr1968, the etiologic agent for infectious mononucleosis1970, nasopharyngeal carcinoma1980, non-Hodgkins lymphoma,38,EBV 相關疾病,傳染性單核細胞增多癥（Infectious mononucleosis，IM）慢性活動性EB病毒感染（Chronic active EBV infection，CAEBV）EB病毒相關性嗜血細胞綜合征（EBV-associated hemophagocytic syndrome, EBVAHS),39,伴性淋巴增殖綜合征（X-linked lymphoproliferative syndrom）鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma）Burkitts 淋巴瘤（Burkitts lymphoma）何奇金淋巴瘤（Hodgkins lymphoma）,40,41,EBV-IM的臨床表現,發(fā)熱： 約1周，嚴重者2周或更久，幼兒可不明顯淋巴結腫大：任何淋巴結，頸部最易受累咽炎：50有滲出物，25上腭有瘀點脾腫大：病程23周，50出現肝炎：腫大1015，而GPT升高80皮疹：紅斑、斑丘疹或麻疹樣疹，50可有眼瞼浮腫,42,EBV-IM的臨床表現,其它：1.間質性肺炎2.CNS: 腦炎、格林巴利綜合征等3.心肌炎4.血液系統(tǒng)：溶血性貧血、再障、粒細胞減少5.腎炎6.關節(jié)炎7.胰腺炎,43,EBV抗體四項,VCA-IgGVCA-IgMEA-IgGNA-IgGVCA-IgG親合力,44,衣殼抗原（CA）IgM,一般情況下：一周左右升高，持續(xù)存在48周，類風濕因子和IgG抗體可致結果假陽性臨床要注意以下情況： 1、有的病人抗EB病毒CA-IgM產生延遲 2、少部分病人感染EBV后，CA-IgM持續(xù)陰 性 3、也有的病人CA-IgM持續(xù)幾個月陽性,45,抗體親合力檢測,機體在受到病原體入侵時首先產生低親合力抗體，隨感染的繼續(xù)和進展，抗體親合力升高。因此，低親合力抗體的檢出提示原發(fā)性急性感染。原發(fā)EBV感染，100的病人在第一個月內可檢測到抗EB病毒CA-IgG低親合力抗體,46,47,病程,周,月,抗體滴度,早期階段,晚期階段,癥狀,原發(fā)性EBV感染的體液免疫,48,晚期,早期,復發(fā),病程,周,月,抗體滴度,EBV感染的再激活,恢復期,49,體液免疫的特殊情況,50,220例IM病人血清中EBV抗體四項結果,51,EBV抗體四項結果分析1,52,EBV抗體四項結果分析2,53,1,4,2,5,3,1,說明：圖1為VCA-IgG，陽性；圖2為VCA-IgG，提示為低親和力； 圖3 為VCA-IgM，陰性；圖4為EA-IgG，陰性；圖5為NA-IgG，陰性,病程4天外周血EBV抗體結果,54,病程8天外周血EBV抗體結果,說明：圖1為VCA-IgG，陽性；圖2為VCA-IgG，提示為低親和力； 圖3 為VCA-IgM，陽性；圖4為EA-IgG，可疑陽性性；圖5為NA-IgG，陰性,1,2,3,4,5,55,說明：上二圖中，從左到右，前4條曲線為標準品； 第5條曲線為病程8天， CT值 為19.73，EBV-DNA為8410.54拷貝/ml; 第6條曲線為病程4天，CT值為24.00，EBV-DNA為413.03拷貝/ml.,56,說明：圖1為VCA-IgG，陽性；圖2為VCA-IgG，提示為高親和力； 圖3 為VCA-IgM，陽性；圖4為EA-IgG，陽性；圖5為NA-IgG，陽性,1,2,3,4,5,EBV抗體四項全陽性，結合臨床提示再激活或傳單后期,57,小結,不同的實驗室診斷方法各具優(yōu)點，針對不同的感染時相和臨床標本檢測結果必須結合臨床癥狀體征、病程和標本來源綜合分析,58,謝謝,59,