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激光掃描共聚焦顯微鏡 LaserScanningConfocalMicroscope LSCM 采用激光作為光源 在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上 使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針 采用共軛聚焦原理和裝置 從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像 在亞細(xì)胞水平上觀察生理信號(hào)及細(xì)胞形態(tài)的變化 并利用計(jì)算機(jī)對(duì)所觀察的對(duì)象進(jìn)行數(shù)字圖象處理的一套集觀察 分析和輸出為一體系統(tǒng) 它把光學(xué)成像的分辨率提高了30 40 成為形態(tài)學(xué) 分子生物學(xué) 神經(jīng)科學(xué) 藥理學(xué) 遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代的研究工具 LSCM的發(fā)展1957年提出了共聚焦顯微鏡技術(shù)的某些基本原理 并獲得了美國(guó)的專利 1967年成功的應(yīng)用共聚焦顯微鏡產(chǎn)生了一個(gè)光學(xué)橫面 1970年牛津和阿姆斯特丹同時(shí)向科學(xué)界推薦了一種新型的掃描共聚焦顯微鏡 1984年Bio Rad公司推出了世界第一臺(tái)共聚焦顯微鏡品 1987年White和Amos在英國(guó) 自然 雜志發(fā)表了 共聚焦顯微鏡時(shí)代的到來 一文 標(biāo)志著LSCM已成為進(jìn)行科學(xué)研究的重要工具 隨后Zeiss Leica Meridian等多家公司相繼開發(fā)出不同型號(hào)的共聚焦顯微鏡 隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善 產(chǎn)品的性能也不斷改進(jìn)和更新 應(yīng)用的范圍也越來越廣泛 HippocampusneuronsexpressingGFP LSCM與普通熒光顯微鏡的圖像質(zhì)量比較 熒光顯微鏡 LSCM 顯微鏡成像清晰度的決定因素 1 分辨率2 球差3 色差 1 分辨率 指顯微鏡能將近鄰的兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)分辨清楚的能力 通常是用顯微鏡所能分辨清楚最近的相鄰兩點(diǎn)間的距離來表示 人眼及各類顯微鏡的分辨率 人眼分辨率 0 20mm光學(xué)顯微鏡分辨率 0 25mm共焦顯微鏡分辨率 0 18mm電子顯微鏡分辨率 0 20nm 2 球差 由主軸上某一物點(diǎn)向光學(xué)系統(tǒng)發(fā)出的單色圓錐形光束 經(jīng)該光學(xué)系列折射后 不能聚焦成一點(diǎn) 使成像模糊不清 形成一彌散光斑 俗稱模糊圈 則此光學(xué)系統(tǒng)的成像誤差稱為球差 3 色差 由白色物點(diǎn)向光學(xué)系統(tǒng)發(fā)出一束白光 經(jīng)該光學(xué)系列折射后 組成該束白光的紅 橙 黃 綠 青 藍(lán) 紫等各色光 不能會(huì)聚于同一點(diǎn) 即白色物點(diǎn)不能結(jié)成白色像點(diǎn) 而結(jié)成一彩色像斑的成像誤差 稱為色差 LSCM的重要組件 激光光源自動(dòng)顯微鏡掃描模塊 包括共聚焦光路通道和針孔 掃描鏡 檢測(cè)器 數(shù)字信號(hào)處理器計(jì)算機(jī)以及圖象輸出設(shè)備 顯示器 彩色打印機(jī) 等 激光器顯微鏡 物鏡載物臺(tái)計(jì)算機(jī)系統(tǒng) 圖像分析與控制系統(tǒng) 激光掃描共聚焦顯微鏡vs熒光顯微鏡 激光掃描共聚焦顯微鏡 熒光顯微鏡 激光掃描共聚焦顯微鏡中常見的激光器 激光器 Ar激光器 458nm 476nm 488nm 514nmHeNe 543nm 633nm固體激光器 UV 405nm 激光器的特點(diǎn) 1 方向性好 激光基本延直線傳播2 單色性好 10 8nm3 高亮度 激光方向性好 其在空間上的能量分布是高度集中的 4 偏振性 激光為平面偏振光 光纖耦合 顯微鏡 LeicaDMIRBE倒置熒光顯微鏡 物鏡 LSCM物鏡的重要參數(shù)NA 數(shù)值孔徑又叫做鏡口率 簡(jiǎn)寫為N A 是物鏡的主要技術(shù)參數(shù) 是判斷物鏡性能高低的重要標(biāo)志 N A n sina 2n 物體與物鏡間媒質(zhì)的折射率a 2 物鏡孔徑角的一半溴萘折射率1 66 香柏油1 515 玻璃1 52 水的為1 3 空氣為1 香柏油與玻璃折射率相似 故光折射少 透光率高 成像清楚 N A 越大 放大倍數(shù)越大 分辨率越高 N A 越大 視場(chǎng)寬度與工作距離越小 4x 20 x 10 x 40 x 60 x 100 x 載物臺(tái) 計(jì)算機(jī)系統(tǒng) 圖像分析與控制系統(tǒng) 分析軟件 控制軟件 激光共聚焦顯微鏡原理 圖1 共聚焦顯微鏡簡(jiǎn)化原理圖用于激發(fā)熒光的激光束 Laser 透過入射小孔 lightsourcepinhole 被二向色鏡 Dichroicmirror 反射 通過顯微物鏡 Objectivelens 匯聚后入射于待觀察的標(biāo)本 specimen 內(nèi)部焦點(diǎn) focalpoint 處 激光照射所產(chǎn)生的熒光 fluorescencelight 和少量反射激光一起 被物鏡重新收集后送往二向色鏡 其中攜帶圖像信息的熒光由于波長(zhǎng)比較長(zhǎng) 直接通過二向色鏡并透過出射小孔 Detectionpinhole 到達(dá)光電探測(cè)器 Detector 通常是光電倍增管 PMT 或是雪崩光電二極管 APD 變成電信號(hào)后送入計(jì)算機(jī) 而由于二向色鏡的分光作用 殘余的激光則被二向色鏡反射 不會(huì)被探測(cè)到 共軛 圖2 探測(cè)針孔的作用示意圖 解釋了出射小孔所起到的作用 只有焦平面上的點(diǎn)所發(fā)出的光才能透過出射小孔 焦平面以外的點(diǎn)所發(fā)出的光線在出射小孔平面是離焦的 絕大部分無(wú)法通過中心的小孔 因此 焦平面上的觀察目標(biāo)點(diǎn)呈現(xiàn)亮色 而非觀察點(diǎn)則作為背景呈現(xiàn)黑色 反差增加 圖像清晰 在成像過程中 出射小孔的位置始終與顯微物鏡的焦點(diǎn) focalpoint 是一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系 共軛conjugate 因而被稱為共聚焦 con focal 顯微技術(shù) 普通光學(xué)顯微鏡與激光共聚焦顯微鏡的區(qū)別 LSCM掃描圖像方式 單一光學(xué)切片掃描 singleopticalsection x y 時(shí)程活細(xì)胞掃描 timelapselivecellimaging x y t 三維掃描及重構(gòu) 3 Dreconstruction x y z 四維掃描 4 Dimaging x y z t Z X Y XY平面 單一光學(xué)切片掃描 singleopticalsection x y Opticalsectionscollectedsimultaneouslyatthreedifferentexcitationwavelengths 488 568 and647nanometers Thespecimenisthefruitflythirdinstarwingimaginaldisk X Y XY平面 時(shí)程活細(xì)胞掃描 timelapselivecellimaging x y t X Y XY平面 time Time lapseimagingofalivingfruitflyembryoinjectedwithcalciumgreenispresentedinFigure2 Theseriesofimagesshowsthechangeindistributionofthefluorescentprobeovertime 0s 10s 20s 30s 三維掃描及重構(gòu) 3 Dreconstruction x y z Peripheralnervoussystemofafruitflyembryo Z X Y XY平面 三維掃描及重構(gòu) 3 Dreconstruction x y z 一種高分辨率的顯微成像技術(shù) 1用激光做光源 激光單色性好 光源波長(zhǎng)相同 從根本上消除了色差 2采用共聚焦技術(shù)在物鏡的焦平面上放置了一個(gè)帶有小孔的擋板 將焦平面以外的雜散光擋住 消除了球差 并進(jìn)一步消除了色差 顯微圖象的清晰度和細(xì)節(jié)分辨能力 3采用點(diǎn)掃描技術(shù)將樣品分成無(wú)數(shù)個(gè)點(diǎn) 用十分細(xì)小的激光束逐點(diǎn)逐行掃描成像 再通過電腦組合成一個(gè)整體 傳統(tǒng)的光鏡在場(chǎng)光源下一次成像 標(biāo)本上每一點(diǎn)都會(huì)受到相鄰點(diǎn)的衍射光和散射光的干擾 這兩種圖像的清晰度和精密度是無(wú)法相比的 4用計(jì)算機(jī)采集和處理光信號(hào) 并利用光電倍增管放大信號(hào) 它代替了人眼和照相機(jī)進(jìn)行觀察 攝像 得到的圖像是數(shù)字化的 可以在電腦中進(jìn)行處理 進(jìn)一步提高圖像的清晰度 5觀察活細(xì)胞 活組織 在不損傷細(xì)胞的前提下 對(duì)活組織 活細(xì)胞進(jìn)行觀察和測(cè)量 這不僅省去了繁瑣的樣品前期處理過程 如脫水 脫蠟 染色等 而且觀察過的樣品還可以繼續(xù)用于其他的研究 這種功能對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng) 轉(zhuǎn)基因研究尤為重要 這可以說是 最大的優(yōu)勢(shì) 6生化成分精確定位觀察配合專用的分子探針 對(duì)于要檢測(cè)的成分不僅可以定位到細(xì)胞水平 還可以定位到亞細(xì)胞水平和分子水平 7動(dòng)態(tài)觀察在同一樣品平面上隨時(shí)間進(jìn)行連續(xù)掃描 就可分析細(xì)胞結(jié)構(gòu) 內(nèi)含 和標(biāo)記等動(dòng)力學(xué)變化 目前在這方面做得最多的是使用 觀察心肌或平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣 鈉 鉀離子濃度或 的動(dòng)態(tài)變化 8定量測(cè)量 首先應(yīng)用專一的熒光探針對(duì)樣品進(jìn)行染色 樣品的熒光強(qiáng)度和所測(cè)成分的含量呈正比 如果其余條件固定 通過對(duì)比各組樣品之間的熒光強(qiáng)度值 可得出特定成分的含量比 應(yīng)用范圍細(xì)胞生物學(xué) 細(xì)胞結(jié)構(gòu) 細(xì)胞骨架 細(xì)胞膜結(jié)構(gòu) 流動(dòng)性 受體 細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和分布變化生物化學(xué) 酶 核酸 FISH 熒光原位雜交 受體分析藥理學(xué) 藥物對(duì)細(xì)胞的作用及其動(dòng)力學(xué)生理學(xué) 膜受體 離子通道 細(xì)胞內(nèi)離子含量 分布動(dòng)態(tài)神經(jīng)生物學(xué) 神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu) 神經(jīng)遞質(zhì)的成分 運(yùn)輸和傳遞 遞質(zhì)受體 離子內(nèi)外流 神經(jīng)組織結(jié)構(gòu) 細(xì)胞分布微生物學(xué)和寄生蟲學(xué) 細(xì)菌 寄生蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)病理學(xué)及臨床應(yīng)用 活檢標(biāo)本診斷 腫瘤診斷 自身免疫性疾病診斷 HIV等遺傳學(xué)和組胚學(xué) 細(xì)胞生長(zhǎng) 分化 成熟變化 細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu) 染色體分析 基因表達(dá) 基因診斷 LSCM在生物學(xué)上的應(yīng)用 熒光組織化學(xué)動(dòng)態(tài)熒光測(cè)量 細(xì)胞內(nèi)鈣測(cè)量 細(xì)胞內(nèi)pH測(cè)量 細(xì)胞膜流動(dòng)性測(cè)量 膜電位測(cè)定 細(xì)胞間隙連接的細(xì)胞間通訊 熒光探針的選擇 合適的熒光探針是有效地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并獲取理想實(shí)驗(yàn)結(jié)果的保障 1 現(xiàn)有儀器所采用的激光器 2 熒光探針的光穩(wěn)定性和光漂白性 3 熒光的定性或定量定性 單波長(zhǎng)激發(fā)探針定量 雙波長(zhǎng)激發(fā)比率探針 4 熒光探針的特異性和毒性 5 熒光探針適用的pH 不同的熒光探針在不同標(biāo)本的效果常有差異 故除綜合考慮以上因素以外 有條件者應(yīng)進(jìn)行染料的篩選 以找出最適的熒光探針 許多熒光探針是疏水性的 很難或不能進(jìn)入細(xì)胞 需使熒光探針與AM 乙酰羥甲基酯 結(jié)合后變成不帶電荷的親脂性化合物方易于通過質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞 在細(xì)胞內(nèi)熒光探針上的AM被非特異性酯酶水解 去掉AM后的熒光探針不僅可與細(xì)胞內(nèi)的靶結(jié)構(gòu)或靶分子結(jié)合且不易透出質(zhì)膜 從而能有效的發(fā)揮作用 常見應(yīng)用及其熒光探針 1 細(xì)胞內(nèi)游離鈣共聚焦激光掃描顯微鏡常用的有Fluo 3 Fluo 4 Rhod 1 Rhod 2 Indo 1 Fura 2等 前四者為單波長(zhǎng)熒光探針 利用其單波長(zhǎng)激發(fā)特點(diǎn)可直接測(cè)量細(xì)胞內(nèi)Ca2 動(dòng)態(tài)變化 為鈣定性探針 后兩者為雙波長(zhǎng)激發(fā)探針 利用其雙波長(zhǎng)激發(fā)特點(diǎn)和比率技術(shù) 能定量細(xì)胞內(nèi)鈣 為鈣定量探針 Fura 2 激發(fā)峰為340 380nm 發(fā)射波長(zhǎng)在505 520nm之間 Fura 2可以和鈣離子結(jié)合 結(jié)合鈣離子后在330 350nm激發(fā)光下可以產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光 而在380nm激發(fā)光下則會(huì)導(dǎo)致熒光減弱 這樣就可以使用340nm和380nm這兩個(gè)熒光的比值來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度 可以消除不同細(xì)胞樣品間熒光探針裝載效率的差異 熒光探針的滲漏 細(xì)胞厚度差異等一些誤差因素 2 DNA和RNA核酸的熒光探針AO 吖啶橙 與DNA結(jié)合 發(fā)射波長(zhǎng)525nm 顯綠色 與RNA結(jié)合 發(fā)射波長(zhǎng)650nm 顯紅色 PI 既可標(biāo)記DNA又可標(biāo)記RNA 如為獲得單獨(dú)的DNA或RNA分布 染色前可用RNA酶或DNA酶處理細(xì)胞 PI不能進(jìn)入完整的細(xì)胞膜 故不能標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)的DNA和RNA DAPI 與雙鏈DNA結(jié)合熒光增強(qiáng)20倍 與單鏈DNA結(jié)合無(wú)熒光增強(qiáng) 熒光強(qiáng)度比Hoechst低 光穩(wěn)定性強(qiáng)于Hoechst 3 膜電位共聚焦激光掃描顯微鏡則可利用熒光探針在細(xì)胞膜內(nèi)外分布的差異測(cè)出膜電位 不但可以觀察細(xì)胞膜電位的變化結(jié)果 更重要的是可以用于連續(xù)監(jiān)測(cè)膜電位的迅速變化 DiBAC4 3 帶負(fù)電荷慢反應(yīng)染料 本身無(wú)熒光 當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞與胞漿內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合后才發(fā)出熒光 測(cè)量時(shí)要求細(xì)胞浸在熒光染料中 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加即膜電位 反之 即膜電位降低 Rhodamine123 主要用于線粒體膜電位測(cè)量 是一種親脂性陽(yáng)離子熒光探針 當(dāng)線粒體膜內(nèi)側(cè)負(fù)電荷增多時(shí) 熒光強(qiáng)度增加 與DiBAC4 3 的表示形式相反 4 細(xì)胞內(nèi)活性氧基 活性氧 activeoxygenspecies 可影響細(xì)胞代謝 與蛋白質(zhì) 核酸 脂類等發(fā)生反應(yīng) 有些反應(yīng)是有害的 因此測(cè)量活性氧在毒理學(xué)研究中有一定的意義 常用熒光探針有Dichlorodihydrofluoresceindiacetate 2 7 二氯二氫熒光素乙酰乙酸 H2DCFDA 其原理是不發(fā)熒光的H2DCFDA進(jìn)入細(xì)胞后能被存在的過氧化物 過氧化氫等氧化分解為二氯熒光黃 dichlorofluorescein DCF 而產(chǎn)生熒光 5 細(xì)胞間通訊 熒光光漂白恢復(fù) fluorescencerecoveryafterphotobleading FRAP 技術(shù)可用于檢測(cè)細(xì)胞縫隙連接通訊 該方法的原理是一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的熒光分子被激光漂白或淬滅 失去發(fā)光能力 而臨近未被漂白細(xì)胞中的熒光分子可通過縫隙連接擴(kuò)散到已被漂白的細(xì)胞中 熒光可以逐漸恢復(fù) 由于光漂白過程是不可逆的 因此可通過觀察已發(fā)生熒光漂白細(xì)胞其熒光恢復(fù)過程的變化量來判斷細(xì)胞縫隙連接的通訊功能 6 細(xì)胞膜流動(dòng)性 熒光光漂白恢復(fù) FRAP 技術(shù) 利用NBD C6 HPC標(biāo)記膜磷脂 然后用高強(qiáng)度的激光束照射活細(xì)胞膜表面的某一區(qū)域 1 2 m 使該區(qū)域的熒光淬滅或漂白 再用較弱的激光束照射該區(qū)域 可檢測(cè)到細(xì)胞膜上其他地方未被漂白的熒光探針流動(dòng)到漂白區(qū)域時(shí)的熒光重新分布情況 熒光恢復(fù)的速率和程度可提供有關(guān)的信息 7 細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu) 細(xì)胞器探針 共聚焦激光掃描顯微鏡可獲得較高分辨率的細(xì)胞內(nèi)線粒體 高爾基復(fù)合體 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 溶酶體等細(xì)胞器圖像 同時(shí)還可動(dòng)態(tài)觀察活細(xì)胞狀態(tài)下細(xì)胞器的形態(tài)學(xué)變化情況 此外還可通過光學(xué)切片即斷層掃描技術(shù)進(jìn)行三維重建 顯示細(xì)胞器的空間關(guān)系及其變化 適用于線粒體的熒光探針較多 如Mitotracker DASPMI DASPEI JC 1 羅丹明123等 高爾基復(fù)合體常用的熒光探針有NBD?；拾贝?ceramide BODIPY?；拾贝?內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要用Dil DiOC6 3 溶酶體的熒光探針有DAMP neutralred 8 pH值正常細(xì)胞胞漿內(nèi)的pH一般在6 8 7 4的范圍 而某些細(xì)胞器如溶酶體的pH則在4 5 6 0之間 根據(jù)檢測(cè)對(duì)象pH的不同將熒光探針分為用于偏中性和酸性兩類 常用于偏中性pH即細(xì)胞胞漿pH檢測(cè)的熒光探針有SNARF類 SNARF 1 SNARF calcein SNAFL類 SNAFL 1 SNAFL calcein BCECF等 這些探針均為疏水性探針 須使用其AM形式 FITC dextran則適用于pH范圍4 6之間 如溶酶體pH的檢測(cè) 該探針也不能透過質(zhì)膜 但可通過細(xì)胞胞飲作用進(jìn)入溶酶體 因此應(yīng)選擇分子量稍小的Dextran 葡聚糖 9 標(biāo)記抗體 配體等常用的熒光探針共聚焦激光掃描顯微鏡不僅可用免疫熒光分析固定的細(xì)胞或組織切片 還可用于分析活細(xì)胞 得到特異性抗體或其他熒光免疫探針識(shí)別靶分子的表達(dá) 定位 分布變化等信息 10 F 肌動(dòng)蛋白熒光探針 鬼筆環(huán)肽 特異性地與F 肌動(dòng)蛋白熒光探針結(jié)合 納摩爾濃度下也可標(biāo)記 11 檢測(cè)酶活性的熒光探針共聚焦激光掃描顯微鏡在檢測(cè)活細(xì)胞酶活性動(dòng)態(tài)變化方面有著無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì) 通過對(duì)細(xì)胞施予不同的處理因素可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的酶被激活或滅活的動(dòng)態(tài)變化過程 有的酶熒光探針是自身就可發(fā)出熒光 有的是與酶結(jié)合后發(fā)出熒光 有的則是被酶分解后發(fā)出熒光 實(shí)例1測(cè)定爪蟾卵母細(xì)胞內(nèi)鈣變化 手術(shù)分離卵母細(xì)胞膠原酶消化中和消化液 停止消化18 C靜止細(xì)胞4小時(shí) 以備后用 Xenopusoocytes 卵母細(xì)胞微注射 Calciumgreen 用細(xì)胞內(nèi)液稀釋Calciumgreen導(dǎo)入微注射器以20nL oocyte注射卵母細(xì)胞18 C避光放置40分鐘共聚焦顯微鏡觀察 IP3引起的卵母細(xì)胞內(nèi)鈣升高 實(shí)例2Fluo 4測(cè)定HEK293細(xì)胞內(nèi)鈣變化 前一天HEK293消化傳代Fluo 4AM孵育液的配制Fluo 4AM5uM 20 F127避光孵育HEK細(xì)胞15分鐘DMEM 10 FBS沖洗細(xì)胞2次在細(xì)胞外液中避光靜置30分鐘移入共聚焦顯微鏡載物臺(tái) 進(jìn)行觀察 實(shí)例3細(xì)胞膜磷脂PIP2的動(dòng)態(tài)測(cè)定 HEK293cellsexpressingPLC PH GFP PLC PH GFP H1receptorLipofactAMINE2000 混合20分鐘 混合物孵育細(xì)胞4 6小時(shí) 洗掉轉(zhuǎn)染液 加入正常培養(yǎng)液 培養(yǎng)24h LSCM觀察 Control Histamine washout 實(shí)例3細(xì)胞膜磷脂PIP2的動(dòng)態(tài)測(cè)定 HEK293cellsexpressingPLC PH GFP A