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基因工程 1.(2017全國Ⅲ卷)編碼蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五個片段組成,編碼蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段組成,如圖1所示。 圖1 圖2 回答下列問題。 (1)現(xiàn)要通過基因工程的方法獲得蛋白乙,若在啟動子的下游直接接上編碼蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA),則所構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞后不能翻譯出蛋白乙,原因是 　。 (2)某同學(xué)在用PCR技術(shù)獲取DNA片段B或D的過程中,在PCR反應(yīng)體系中加入了DNA聚合酶、引物等,還加入了序列甲作為　　　　,加入了　　　　作為合成DNA的原料。 (3)現(xiàn)通過基因工程的方法獲得了甲、乙、丙三種蛋白,要鑒定這三種蛋白是否具有刺激T淋巴細胞增殖的作用,某同學(xué)做了如下實驗:將一定量的含T淋巴細胞的培養(yǎng)液平均分成四組,其中三組分別加入等量的蛋白甲、乙、丙,另一組作為對照,培養(yǎng)并定期檢測T淋巴細胞濃度,結(jié)果如圖2。 ①由圖2 可知:當細胞濃度達到a時,添加蛋白乙的培養(yǎng)液中T淋巴細胞濃度不再增加,此時若要使T淋巴細胞繼續(xù)增殖,可采用的方法是　　　　　　　　　　　　　　　。細胞培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)箱中通常要維持一定的CO2濃度,CO2的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　。 ②僅根據(jù)圖1、圖2可知,上述甲、乙、丙三種蛋白中,若缺少　　(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所編碼的肽段,會降低其刺激T淋巴細胞增殖的效果。 答案 (1)編碼乙的DNA序列起始端無ATG,轉(zhuǎn)錄出的mRNA無起始密碼子 (2)模板　dNTP (3)①進行細胞傳代培養(yǎng)　維持培養(yǎng)液的pH?、贑 解析 (1)由基因乙的堿基序列可知,由該序列轉(zhuǎn)錄出的mRNA無起始密碼子,所以在啟動子的下游直接接上編碼蛋白乙的DNA序列后,所構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞后不能翻譯出蛋白乙。(2)PCR反應(yīng)體系中除了加入DNA聚合酶、引物等,還應(yīng)加入序列甲作為模板,加入四種脫氧核苷酸(dNTP)作為合成DNA的原料。(3)當細胞濃度達到a時,T淋巴細胞的濃度不再增加,是因為出現(xiàn)了接觸抑制現(xiàn)象,所以可以進行細胞傳代培養(yǎng),使T淋巴細胞繼續(xù)增殖;細胞培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)箱中通常要維持一定的CO2濃度,CO2的作用是維持培養(yǎng)液中的pH。根據(jù)圖2可知,甲、乙兩組的T淋巴細胞數(shù)量多,丙組的T淋巴細胞數(shù)量少,根據(jù)圖1比較可知,丙組T淋巴細胞少的原因是蛋白丙缺少C片段所編碼的肽段。 2.科學(xué)家從某細菌中提取抗鹽基因,轉(zhuǎn)入煙草并培育成轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草。下圖是轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的培育過程,含目的基因的DNA和質(zhì)粒上的箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點。請分析回答下列問題。 (1)在該過程中,研究人員首先獲取了抗鹽基因(目的基因),并采用　　　　　　　　　　技術(shù)對目的基因進行擴增,該技術(shù)需要的條件是　　　　、酶、原料、模板,該技術(shù)必須用　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　酶;然后構(gòu)建基因表達載體,基因表達載體中除了具有目的基因、啟動子和終止子之外,還需具有　　　　　　　　。 (2)用圖中的質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒,不能使用SmaⅠ酶切割,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。圖中①②過程為防止質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化,應(yīng)選用　　　　　　　　　　　　　酶對外源DNA、質(zhì)粒進行切割。 (3)為確定轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草是否培育成功,既要用放射性同位素標記的　　　　　　　　　　　作探針進行分子雜交檢測,又要在個體水平上鑒定,后者具體過程是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 答案 (1)PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))　引物　耐熱的DNA聚合酶或熱穩(wěn)定性的DNA聚合　標記基因 (2)SmaⅠ會破壞質(zhì)粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因　BamHⅠ和HindⅢ (3)抗鹽基因(或目的基因)　將培育的煙草幼苗栽培于含有一定鹽的土壤中,觀察該煙草植株的生長狀態(tài) 解析 (1)依題意可知,抗鹽基因?qū)儆谀康幕?可采用PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))技術(shù)擴增目的基因,該技術(shù)需要的條件是引物、酶、原料、模板,利用PCR技術(shù)擴增目的基因時,每次循環(huán)都是在90~95 ℃時進行變性、在55~60 ℃時進行復(fù)性、在70~75 ℃時延伸,所以該技術(shù)需要用熱穩(wěn)定DNA聚合酶(或Taq DNA聚合酶)。基因表達載體由目的基因、啟動子、終止子、標記基因等組成。(2)題圖顯示,質(zhì)粒上的M抗生素抗性基因和目的基因中都含有Sma Ⅰ 酶的識別和酶切位點,若使用Sma Ⅰ 酶切割,會破壞質(zhì)粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因,因此不能使用Sma Ⅰ 酶切割?？果}基因(或目的基因)的兩側(cè)都有EcoR Ⅰ 酶的識別和酶切位點,因此用EcoR Ⅰ 酶切割目的基因會出現(xiàn)自身環(huán)化;BamH Ⅰ和Hind Ⅲ識別和酶切位點分別位于目的基因的兩側(cè),而且質(zhì)粒中也有相應(yīng)的酶切位點,因此用BamH Ⅰ 和HindⅢ同時進行酶切,才能完整地切下該抗鹽基因,同時保證目的基因與質(zhì)粒的連接方式的唯一性,防止質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化。(3)檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細胞,在分子水平上進行檢測時,要用放射性同位素標記的抗鹽基因(或目的基因)作探針進行分子雜交檢測;在個體水平上進行鑒定時,可將培養(yǎng)的煙草幼苗栽培于含有一定鹽的土壤中,觀察該植株的生長狀態(tài)。 3.將蘇云金桿菌Bt蛋白的基因?qū)朊藁毎?可獲得抗棉鈴蟲的轉(zhuǎn)基因棉,其過程如下圖所示。 注質(zhì)粒中“Bt”代表“Bt基因”,“KmR”代表“卡那霉素抗性基因”。農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上只有T-DNA片段能轉(zhuǎn)移到植物細胞中。 (1)過程①需用同種　　　　　　　　　　　　　　　　酶對含Bt基因的DNA和Ti質(zhì)粒進行酶切。為將過程②獲得的含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌篩選出來,應(yīng)使用　　　　　培養(yǎng)基。 (2)過程③中將棉花細胞與農(nóng)桿菌混合后共同培養(yǎng),旨在讓　　　　　　　　　進入棉花細胞;除盡農(nóng)桿菌后,還須轉(zhuǎn)接到含卡那霉素的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng),目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 (3)若過程④僅獲得大量的根,則應(yīng)在培養(yǎng)基中增加　　　　　　　　　　　　以獲得芽;部分接種在無激素培養(yǎng)基上的芽也能長根,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 (4)檢驗轉(zhuǎn)基因棉的抗蟲性狀,常用方法是　　　　　　　　　　　。種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉能減少　　　　　的使用,以減輕環(huán)境污染。 答案 (1)限制性核酸內(nèi)切　選擇 (2)T-DNA　篩選獲得含T-DNA片段的植物細胞 (3)細胞分裂素濃度　芽頂端合成的生長素向基部運輸,促進根的分化 (4)投放棉鈴蟲　農(nóng)藥 解析 (1)目的基因與質(zhì)粒構(gòu)建基因表達載體時需要用同種限制性核酸內(nèi)切酶對二者進行切割。要篩選出含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌應(yīng)使用選擇培養(yǎng)基。(2)為將目的基因?qū)胧荏w細胞,應(yīng)先將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌,再用農(nóng)桿菌感染棉花細胞,從而將T-DNA整合至棉花細胞染色體的DNA上;除盡農(nóng)桿菌后,因重組質(zhì)粒中含有卡那霉素抗性基因,在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)可篩選獲得含T-DNA 片段的植物細胞。(3)愈傷組織培養(yǎng)過程中,生長素能促進根的分化,細胞分裂素能促進芽的分化,在培養(yǎng)過程中芽頂端合成的生長素也可促進根的分化。(4)在個體水平檢測抗蟲棉的抗蟲性狀,可投放棉鈴蟲,觀察棉鈴蟲的生存情況。種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉能減少農(nóng)藥的使用,從而減輕環(huán)境污染。 4.人血清白蛋白(HSA)具有重要的醫(yī)用價值,原來只能從人血漿中提取。下圖是以基因工程技術(shù)獲取重組HSA(rHSA)的兩條途徑。 (1)為獲取HSA基因,首先需采集人的血液,提取　　　　　　合成總cDNA,然后以cDNA為模板,使用PCR技術(shù)擴增HSA基因。下圖中箭頭表示一條引物結(jié)合模板的位置及擴增方向,請用箭頭在方框內(nèi)標出另一條引物的位置及擴增方向。 (2)啟動子通常具有物種及組織特異性,構(gòu)建在水稻胚乳細胞內(nèi)特異表達rHSA的載體,需要選擇的啟動子是　　　　(填寫字母,單選)。 A.人血細胞啟動子　　　　B.水稻胚乳細胞啟動子 C.大腸桿菌啟動子 D.農(nóng)桿菌啟動子 (3)利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻受體細胞的過程中,需添加酚類物質(zhì),其目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 (4)人體合成的初始HSA多肽,需要經(jīng)過膜系統(tǒng)加工形成正確空間結(jié)構(gòu)才有活性。與途徑Ⅱ相比,選擇途徑Ⅰ獲取rHSA的優(yōu)勢是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 (5)為證明rHSA具有醫(yī)用價值,須確認rHSA與　　　　　　的生物學(xué)功能一致。 答案 (1)總RNA(或mRNA) (2)B (3)吸引農(nóng)桿菌移向水稻受體細胞,有利于目的基因成功轉(zhuǎn)化 (4)水稻是真核生物,具有膜系統(tǒng),能對初始rHSA多肽進行高效加工 (5)HSA 解析 (1)目的基因的獲取途徑之一是逆轉(zhuǎn)錄法,即以RNA為模板合成目的基因,故需要提取相關(guān)的RNA。PCR技術(shù)利用的是DNA復(fù)制的原理,由于DNA分子的兩條鏈是反向平行的,而DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸,故另一條子鏈的擴增方向相反。(2)啟動子通常具有物種及組織特異性,要構(gòu)建在水稻胚乳細胞內(nèi)特異表達rHSA的載體,需選擇水稻胚乳細胞啟動子。(3)利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻受體細胞時,由于酚類物質(zhì)能夠吸引農(nóng)桿菌移向水稻受體細胞,有利于目的基因成功轉(zhuǎn)化,故需添加酚類物質(zhì)。(4)由于真核細胞中具有膜系統(tǒng),途徑Ⅰ中的水稻胚乳細胞能對初始rHSA多肽進行加工,使rHSA具有生物學(xué)活性。(5)由題意知,要制備有醫(yī)用價值的rHSA,需要rHSA 與HSA的生物學(xué)功能一致。 5.(2018江蘇卷)為生產(chǎn)具有特定性能的α-淀粉酶,研究人員從某種海洋細菌中克隆了α-淀粉酶基因(1 656個堿基對),利用基因工程大量制備α-淀粉酶,實驗流程見下圖。請回答下列問題。 (1)利用PCR技術(shù)擴增α-淀粉酶基因前,需先獲得細菌的　　　　　　　。 (2)為了便于擴增的DNA片段與表達載體連接,需在引物的　　　　　　端加上限制性酶切位點,且常在兩條引物上設(shè)計加入不同的限制性酶切位點,主要目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 (3)進行擴增時,反應(yīng)的溫度和時間需根據(jù)具體情況進行設(shè)定,下列選項中　　　　　　的設(shè)定與引物有關(guān),　　　　　　的設(shè)定與擴增片段的長度有關(guān)。(填序號) ①變性溫度?、趶?fù)性溫度?、垩由鞙囟取、茏冃詴r間?、輳?fù)性時間?、扪由鞎r間 (4)下圖表示篩選獲得的工程菌中編碼α-淀粉酶的mRNA 的部分堿基序列: 5-AUGCCAUCAACAAAUACUAACACUU……-3 圖中虛線框內(nèi)mRNA片段包含　　　　　個密碼子,如虛線框后的序列未知,預(yù)測虛線框后的第一個密碼子最多有　　　種。 (5)獲得工程菌表達的α-淀粉酶后,為探究影響酶活性的因素,以濃度為1%的可溶性淀粉為底物測定酶活性,結(jié)果如下: 緩沖液 50 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4 50 mmol/L Tris-HCl 50 mmol/L Gly-NaOH pH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10.5 酶相對 活性% 25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8 根據(jù)上述實驗結(jié)果,初步判斷該α-淀粉酶活性最高的條件為 　　　　　　　　。 答案 (1)基因組DNA　(2)5　使DNA片段能定向插入表達載體,減少自連　(3)②　⑥　(4)8　13　(5)pH為8.5,緩沖液為50 mmol/L Tris-HCl 解析 (1)從海洋細菌中利用PCR技術(shù)擴增α-淀粉酶基因,首先要獲得細菌的基因組DNA,再利用引物來獲取α-淀粉酶基因。(2)由于PCR技術(shù)合成子鏈的方向是5→3,引物是與子鏈連接的DNA單鏈或RNA鏈,所以應(yīng)在引物的5端加上限制性酶切位點。為保證DNA片段能定向插入表達載體中,避免DNA片段和載體自身環(huán)化以及DNA片段和表達載體任意拼接,常在兩條引物上設(shè)計不同的限制性酶切位點。(3)引物與模板鏈結(jié)合屬于復(fù)性,所以復(fù)性溫度的設(shè)定與引物有關(guān),擴增片段屬于延伸,擴增片段的長度與延伸的時間有關(guān)。(4)密碼子是指mRNA上3個相連的堿基,虛線框內(nèi)有24個堿基,共構(gòu)成8個密碼子。虛線框后第一個密碼子的第一個堿基是U,共可構(gòu)成的密碼子種類有44=16(種),又因圖中堿基序列僅是編碼α-淀粉酶的mRNA的一部分,此密碼子不可能是終止密碼子(3種,UAA、UAG、UGA),所以虛線框后的第一個密碼子共有13種。(5)根據(jù)表格數(shù)據(jù)可知,α-淀粉酶活性最高時的條件是pH為8.5,緩沖液為50 mmol/L Tris-HCl。 6.大豆花葉病毒(RNA病毒)是世界性大豆病害,是造成大豆減產(chǎn)的重要原因。某科研小組制備了大豆花葉病毒的空衣殼蛋白(CP蛋白),生產(chǎn)過程大致如下,請回答問題。 (1)圖中的①是指　　　　　。 (2)過程Ⅱ中應(yīng)用的酶是　　　　　　　　　　　　。此過程中先要在大豆花葉病毒的基因文庫中查找　　　　　　　　　　　　　　　　的核苷酸序列,以便合成特異性引物。 (3)在上述生產(chǎn)流程中,　　　(填序號)是基因工程生產(chǎn)CP衣殼蛋白的核心步驟。為檢測樣液中是否含有有效成分,在過程Ⅶ中可使用　　　　　　　　　　　　　進行檢測。 答案 (1)RNA　 (2)Taq DNA聚合酶　CP蛋白基因(控制CP蛋白合成的RNA片段) (3)Ⅲ　CP蛋白的抗體 解析 (1)因為通過Ⅰ獲得的是cDNA,所以①是RNA,過程Ⅰ是逆轉(zhuǎn)錄。(2)過程Ⅱ是PCR擴增,在該技術(shù)中需要用到耐高溫的Taq DNA聚合酶。在該過程中,需要先知道目的基因,即CP蛋白基因的核苷酸序列,才能合成特異性引物。(3)在基因工程中基因表達載體的構(gòu)建是核心,即步驟Ⅲ是核心步驟。為了檢測樣液中是否含有有效成分,在過程Ⅶ中可以用抗原—抗體雜交,即使用CP蛋白的抗體進行檢測。如果出現(xiàn)了雜交帶,則說明含有有效成分。