乙肝病毒檢測 方法學(xué)評價 1 乙肝病毒結(jié)構(gòu) 2 一 乙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)特點 HBsAg 是HBV感染的主要標(biāo)志HBsAb 保護性抗體HBcAg 僅存于感染的肝細(xì)胞核內(nèi) 一般不存在于血循環(huán)中HBcAb 非保護性抗體 HBcAb IgM提示HBV處于復(fù)制狀態(tài)HBeAg HBV復(fù)制及強感染性的指標(biāo)HBeAb 有一定的保護作用 預(yù)后良好 3 患者血清中存在三種基本形態(tài) 大球型顆粒 又稱Dane顆粒 小球型顆粒 管型顆粒小球型顆粒 管型顆粒管型顆粒 4 乙型肝炎病毒的實驗室診斷 一 血清學(xué)檢查 二 生化學(xué)檢查 三 HBVDNA 基因型和變異檢查 5 血清學(xué)檢查 項目 HBsAg 抗 HBs HBeAg 抗 HBe 抗 HBc以及抗 HBcIgM方法ELISA enzyme linkedimmunosorbentassay 最常用 定性 6 HBsAg 感染的標(biāo)志Anti HBs 既往感染 接種疫苗Anti HBcIgM 急性感染標(biāo)志Anti HBcIgG 既往或慢性感染HBeAg 急性病毒復(fù)制 有傳染性Anti HBe 病毒不再復(fù)制HBV DNA 急性病毒復(fù)制 比HBeAg更準(zhǔn)確 主要用于監(jiān)測治療反應(yīng) 7 HBV血清學(xué)標(biāo)志物的臨床意義 8 兩對半的意義 乙型肝炎的診斷 判斷傳染性 判斷預(yù)后 篩查獻血員 流行病學(xué)調(diào)查 9 乙肝三系定性檢查是用來判斷是否感染乙肝或粗略估計病毒復(fù)制水平的初步檢查 對患者病情程度的評估參考性不大 所以乙肝患者在做乙肝三系定性檢查的時候 應(yīng)結(jié)合肝功能檢查 乙肝病毒DNA檢查 B超檢查等來判定病情的輕重 10 ELISA檢測靈敏低的原因及局限 ELISA法受其自身敏感性和特異性的限制 HBVS和前C基因區(qū)出現(xiàn)位點突變導(dǎo)致HBsAg和HBeAg表達缺陷 影響因素多 如加樣時間 試劑平衡時間 樣本溶血程度等等 特別是低濃度樣本易導(dǎo)致假陰性結(jié)果 使弱陽性樣本漏檢 急性感染的窗口期 HBsAg檢測方法靈敏度不足 血清亞型的漏檢等 標(biāo)本中病毒顆粒少 11 血清學(xué)檢測的局限性 HBV具有 檢測窗口期假陰性結(jié)果無法檢測突變株及抗體 12 乙肝病毒的定量檢測 1 乙肝表面抗原 HBsAg 定量檢測 1 參考值 0 0 05IU mL2 臨床意義 1 可作為HBV攜帶者乙肝病毒復(fù)制的參考指標(biāo) 2 評價拉美呋定的治療效果 3 監(jiān)測應(yīng)用alpha 干擾素治療病人的乙肝病毒復(fù)制 4 確定肝移植病人免疫球蛋白的使用劑量 13 2 乙肝表面抗體 抗 HBs 定量測定 是HBsAg刺激機體產(chǎn)生的特異性抗體 是一種保護性抗體 能中和HBV 1 抗 HBs含量在0 10mIU ml 表示不具有保護性 需要注射乙肝疫苗 3針 0 1 6方案 2 抗 HBs含量在10 100mIU ml 表示具有保護性 但較弱 需要乙肝疫苗強化注射 1針 3 抗 HBs含量大于100mIU ml 表示具有很強的保護性 不需要注射乙肝疫苗 14 3 乙肝病毒e抗原 HBeAg HBeAg增高說明病毒復(fù)制 具有很強的傳染性 4 乙肝病毒e抗體 抗 HBe 抗 HBe陽性說明病毒復(fù)制減少 傳染性弱 但并非沒有傳染性 抗HBe不是保護性抗體 15 5 乙肝病毒核心抗體 抗 HBc 抗 HBc 不是中和抗體 有IgG和IgM兩種形式 IgM在早期出現(xiàn) 而IgG在恢復(fù)期出現(xiàn) 可持續(xù)多年或終身存在 16 乙肝五項定量檢測的優(yōu)點 由于乙肝病毒容易發(fā)生變異 再加上乙肝定性檢測方法的局限性 會出現(xiàn)假陰性結(jié)果 導(dǎo)致不能及時發(fā)現(xiàn)乙肝的感染 也就不能得到及時的治療 對醫(yī)護人員和其他患者也存在著被感染的威脅 乙肝五項定量應(yīng)用目前最先進的化學(xué)發(fā)光法檢測 避免了假陰性和漏檢的問題 而且準(zhǔn)確 尤其對乙肝病人的療效觀察提供了依據(jù) 這是檢驗發(fā)展的趨勢 17 兩對半定量檢測極大地提高了檢測的靈敏度 LiCa技術(shù)檢測HBsAg靈敏度可達0 5ng ml 而ELISA檢測HBsAg達到2ng ml時才會陽性 急性乙肝早期定量能及早檢出HBsAg 確證HBV感染 幾乎能與PreSi同時檢測 在病程觀察中大大縮短了 窗口期 而酶標(biāo)檢測在乙肝早期往往HBsAg呈陰性 慢性乙肝一些患者由于機體常缺乏對HBV包膜蛋白的免疫應(yīng)答 HBsAg表達較低 酶標(biāo)檢測可出現(xiàn)HBsAg和HBsAb均陰性的情況 而定量檢測則可避免這些情況的出現(xiàn) 為正確判斷病情提供依據(jù) 靈敏度如病毒發(fā)生變異后 表達量較低 常規(guī)ELISA測不出抗原 而定量檢測具有極高的靈敏度 可發(fā)現(xiàn)極有可能同時檢測出HBsAg和HBsAb 血清中HBsAg含量與病人對HBsAg細(xì)胞免疫成反比關(guān)系 而肝功能改變則與此種細(xì)胞免疫成正比 定量HBsAg是反映這一關(guān)系的唯一手段 可發(fā)現(xiàn)低濃度的HBsAg攜帶者 特別是一些群體如醫(yī)務(wù)工作者及病人家屬等 18 定量檢測意義 監(jiān)測疾病發(fā)展評估藥物療效指導(dǎo)疫苗接種 19 國內(nèi)疫苗評價標(biāo)準(zhǔn) 無應(yīng)答者 無抗體產(chǎn)生 5 加強計量復(fù)種低應(yīng)答者 100IU L 20 無須復(fù)種 20 PCR技術(shù)在乙肝方面的應(yīng)用 乙型肝炎病毒屬嗜肝DNA病毒科 hepadnaviridae 基因組長度3 2kb目前感染人類最小的DNA病毒部分雙鏈環(huán)狀DNA 21 定量PCR的特點 可定量結(jié)果 準(zhǔn)確靈敏地反應(yīng)了病原體的感染和治療恢復(fù)情況光譜分析儀直讀結(jié)果 自動分析 增強了靈敏性和客觀性 22 23 HBV基因及編碼蛋白 24 HBV DNA定量檢測的臨床應(yīng)用 慢性乙肝診斷治療監(jiān)測和療效評價跟蹤隨訪預(yù)后判斷 25 二 HBV DNA與 兩對半 1 兩對半 機體的免疫反應(yīng)狀態(tài) FQ PCR 檢測的是HBV本身的遺傳物質(zhì) DNA 是病毒存在和復(fù)制的最可靠 最直接的指標(biāo) 2 攜帶者 大三陽 小三陽 等免疫學(xué)指標(biāo)不能反應(yīng)體內(nèi)病毒復(fù)制水平與感染程度 26 3 血清學(xué)指標(biāo) 不能排除HBV感染 4 也可能出現(xiàn)HBsAg HBV DNA 5 HBsAb HBcAb HBeAb 三抗體陽性與HBVDNA2 5 103copy ml結(jié)果解釋 27 HBV DNA檢測的臨床意義 診斷方面 HBVDNA是HBV存在最直接的依據(jù) HBVDNA是HBV復(fù)制的標(biāo)志 HBVDNA是患者具有傳染性的標(biāo)志 對HBV M起補充作用 HBeAg 抗HBe 乙型肝炎 前C區(qū)變異 HBsAg 乙型肝炎 S區(qū)變異 低水平感染單項抗HBc 乙型肝炎 28 療效判斷 HBVDNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標(biāo) 預(yù)后判斷HBVDNA水平與病情有一定的關(guān)系 29 一 乙肝病毒DNA檢查可檢查乙肝病毒的復(fù)制狀況 如乙肝病毒DNA測定值 1000copies ml 就提示乙肝病毒有復(fù)制 而且病毒數(shù)量的高低與病毒復(fù)制的程度成正相關(guān) 若結(jié)果陰性 則表明病毒處于不活躍階段 病情比較平穩(wěn) 二 乙肝病毒DNA檢查還是判斷乙肝病毒傳染性的重要指標(biāo) 如果乙肝病毒DNA測定值 1000copies ml 常提示具有傳染性 且檢測值越高就說明乙肝病毒復(fù)制越活躍 傳染性越強 30 三 乙肝病毒DNA檢查可以作為肝病患者確診病情的主要依據(jù) 乙肝病毒DNA陽性者 即使肝功能正常 必要時也應(yīng)考慮進行抗病毒治療 乙肝抗病毒治療的標(biāo)準(zhǔn)就是乙肝病毒DNA 1000copies ml 且患者轉(zhuǎn)氨酶超過正常值兩倍 此時是肝病患者抗病毒治療的最佳時機 四 乙肝病毒DNA檢查結(jié)果還可以在一定程度上輔助判斷乙肝病毒是否產(chǎn)生了變異 如在治療過程中乙肝病毒DNA檢測結(jié)果由陰性轉(zhuǎn)為陽性時 則提示病毒已發(fā)生變異 應(yīng)結(jié)合具體病情重新選擇抗病毒藥物 31 基因檢測在乙肝診療各階段的應(yīng)用 藥物治療方案的確定 用藥 干擾素 拉米夫定 阿德福韋 恩替卡韋 藥物治療 療效評價 前C區(qū)1896位點突變檢測 跟蹤隨訪 乙肝病毒定量檢測 確診 病毒學(xué)分析 乙肝病毒分型檢測 拉米夫定耐藥檢測 阿德福韋耐藥檢測 共價閉合環(huán)狀DNA cccDNA 檢測 恩替卡韋耐藥檢測 32 FQ PCR檢測的優(yōu)勢 靈敏度高可以達到pg級而ELISA只能檢測ng級 可以檢測包括乳汁的其他低含量的標(biāo)本 不受病毒變異影響 而前C和S變異后ELISA難以檢測 熒光定量PCR技術(shù)采用閉管檢測 無須凝膠電泳 避免了交叉污染 實現(xiàn)了對HBVDNA的定量測定 其實時監(jiān)測技術(shù)使藥物選擇和療效觀察成為可能 漏檢率低 33 謝謝 34