專題5課題2課前預(yù)習(xí)巧設(shè)計(jì)名師課堂一點(diǎn)通重點(diǎn)突破創(chuàng)新演練大沖關(guān)知識(shí)清單案例師說(shuō)課堂強(qiáng)化每課一練了解了解 PCRPCR技術(shù)的基本操作、反應(yīng)條件技術(shù)的基本操作、反應(yīng)條件理解理解 PCRPCR技術(shù)的基本原理技術(shù)的基本原理PCRPCR技術(shù)的原理和基本操作技術(shù)的原理和基本操作 一、細(xì)胞內(nèi)一、細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制所需要的基本條件復(fù)制所需要的基本條件 (1)原料：原料： 。 (2)模板：模板：DNA分子分子 。 (3)酶：打開(kāi)酶：打開(kāi)DNA雙鏈的雙鏈的 、催化合成、催化合成DNA子子鏈的鏈的 。 (4)引物：由于引物：由于DNA聚合酶合成子鏈時(shí)不能從頭開(kāi)始，聚合酶合成子鏈時(shí)不能從頭開(kāi)始，而只能從而只能從 延伸，因此延伸，因此DNA復(fù)制需要引物。復(fù)制需要引物。4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸兩條母鏈兩條母鏈解旋酶解旋酶DNA聚合酶聚合酶3端端 二、二、PCR技術(shù)的條件及原理技術(shù)的條件及原理 1條件條件 (1)模板：模板： 。 (2)引物：能分別與引物：能分別與 結(jié)合的兩種引物。結(jié)合的兩種引物。 (3)原料：原料： 。 (4)酶：酶： DNA聚合酶。聚合酶。 (5)其他條件：需穩(wěn)定的其他條件：需穩(wěn)定的 和能自動(dòng)調(diào)控溫度和能自動(dòng)調(diào)控溫度的溫控設(shè)備。的溫控設(shè)備。DNA兩條模板鏈兩條模板鏈四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸耐熱的耐熱的緩沖溶液緩沖溶液 2方向方向 子鏈的延伸方向?yàn)閺淖渔湹难由旆较驗(yàn)閺?。 3原理原理 (1)DNA變性：在變性：在 的溫度范圍內(nèi)，的溫度范圍內(nèi)，DNA的的 結(jié)構(gòu)解體，雙鏈分開(kāi)，這個(gè)過(guò)程稱為結(jié)構(gòu)解體，雙鏈分開(kāi)，這個(gè)過(guò)程稱為 。 (2)DNA復(fù)性：當(dāng)溫度緩慢復(fù)性：當(dāng)溫度緩慢 后，兩條彼此分離的后，兩條彼此分離的DNA鏈又會(huì)重新結(jié)合成鏈又會(huì)重新結(jié)合成 。 (3)DNA合成：合成：DNA聚合酶從引物聚合酶從引物 端開(kāi)始延伸端開(kāi)始延伸DNA鏈，鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的的合成方向總是從子鏈的 端向端向 端延伸。端延伸。5端到端到3端端80100雙螺雙螺旋旋變性變性降低降低雙鏈雙鏈353 三、三、PCR反應(yīng)過(guò)程和結(jié)果反應(yīng)過(guò)程和結(jié)果 1過(guò)程過(guò)程 PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)。一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)。 (1)每次循環(huán)可以分為每次循環(huán)可以分為 、 和和 三步，所需三步，所需要的溫度分別約為要的溫度分別約為 以上、以上、 左右、左右、 左右。左右。 (2)從第二輪循環(huán)開(kāi)始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物作為從第二輪循環(huán)開(kāi)始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物作為 參與參與反應(yīng)，并且由反應(yīng)，并且由 上延伸而成的上延伸而成的DNA單鏈會(huì)與單鏈會(huì)與 結(jié)合，結(jié)合，進(jìn)行進(jìn)行DNA的延伸。的延伸。變性變性復(fù)性復(fù)性延伸延伸905072模板模板引物引物引物引物 2結(jié)果結(jié)果 DNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于聚合酶只能特異地復(fù)制處于 之間的之間的DNA序列，使這段序列，使這段 的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。 四、四、DNA含量的測(cè)定含量的測(cè)定 1原理原理 DNA在在 波段有一強(qiáng)烈吸收峰，可利用波段有一強(qiáng)烈吸收峰，可利用DNA的這一特點(diǎn)測(cè)定的這一特點(diǎn)測(cè)定DNA含量。含量。 2計(jì)算公式計(jì)算公式 DNA含量含量(g/mL)50 稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)兩引物兩引物固定長(zhǎng)度固定長(zhǎng)度260 nm紫外線紫外線260 nm的讀數(shù)的讀數(shù) 1仔細(xì)閱讀教材仔細(xì)閱讀教材P5862基礎(chǔ)知識(shí)基礎(chǔ)知識(shí)的相關(guān)內(nèi)容，歸納的相關(guān)內(nèi)容，歸納并回答下列問(wèn)題。并回答下列問(wèn)題。 (1)PCR的原理是什么？運(yùn)用文字與箭頭表示出來(lái)。的原理是什么？運(yùn)用文字與箭頭表示出來(lái)。 提示：提示：DNA的熱變性。的熱變性。 (2)聯(lián)想聯(lián)想DNA復(fù)制的知識(shí)，討論并交流：生物體內(nèi)的復(fù)制的知識(shí)，討論并交流：生物體內(nèi)的DNA復(fù)制與復(fù)制與PCR技術(shù)有哪些異同？填寫(xiě)下表。技術(shù)有哪些異同？填寫(xiě)下表。 (3)觀察教材觀察教材P6061圖圖59，思考，思考PCR反應(yīng)過(guò)程是反應(yīng)過(guò)程是DNA的兩條模板鏈全長(zhǎng)復(fù)制嗎？若一個(gè)的兩條模板鏈全長(zhǎng)復(fù)制嗎？若一個(gè)DNA分子在分子在PCR中中循環(huán)循環(huán)n次，可獲得的子代次，可獲得的子代DNA分子數(shù)是多少？若開(kāi)始有分子數(shù)是多少？若開(kāi)始有N0個(gè)個(gè)DNA，則循環(huán)，則循環(huán)n次后獲得的子代次后獲得的子代DNA分子數(shù)目是多少？分子數(shù)目是多少？ 提示：提示：PCR反應(yīng)過(guò)程中的反應(yīng)過(guò)程中的DNA聚合酶只能特異地復(fù)聚合酶只能特異地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使該段固定長(zhǎng)度的序列，使該段固定長(zhǎng)度的DNA序列呈指數(shù)擴(kuò)增；序列呈指數(shù)擴(kuò)增；2n；N02n。 2讀教材讀教材P62實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作和和操作提示操作提示的相關(guān)內(nèi)容，結(jié)合的相關(guān)內(nèi)容，結(jié)合你自己的實(shí)驗(yàn)體會(huì)，思考在你自己的實(shí)驗(yàn)體會(huì)，思考在PCR操作中，應(yīng)注意哪些問(wèn)題？操作中，應(yīng)注意哪些問(wèn)題？ 提示：提示：PCR所用的緩沖液實(shí)驗(yàn)前應(yīng)分裝成小份，并在所用的緩沖液實(shí)驗(yàn)前應(yīng)分裝成小份，并在20儲(chǔ)存；儲(chǔ)存； PCR所用的緩沖液配制一定要嚴(yán)格，或者直接購(gòu)買專用所用的緩沖液配制一定要嚴(yán)格，或者直接購(gòu)買專用擴(kuò)增緩沖液；擴(kuò)增緩沖液； 為避免外源為避免外源DNA等因素的污染，等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、吸液槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高離心管、吸液槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌；壓滅菌； 在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)每吸一種試劑后，移液在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)每吸一種試劑后，移液器上的槍頭必須更換。器上的槍頭必須更換。 PCR過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過(guò)程相比，主要復(fù)制過(guò)程相比，主要有兩點(diǎn)不同，它們是有兩點(diǎn)不同，它們是 () PCR過(guò)程需要的引物是人工合成的單鏈過(guò)程需要的引物是人工合成的單鏈DNA或或RNAPCR過(guò)程不需要過(guò)程不需要DNA聚合酶聚合酶PCR過(guò)程中過(guò)程中DNA的解旋的解旋不依靠解旋酶，而是通過(guò)對(duì)反應(yīng)溫度的控制來(lái)實(shí)現(xiàn)的不依靠解旋酶，而是通過(guò)對(duì)反應(yīng)溫度的控制來(lái)實(shí)現(xiàn)的PCR過(guò)程中，過(guò)程中，DNA不需要解旋，直接以雙鏈不需要解旋，直接以雙鏈DNA為模板為模板進(jìn)行復(fù)制進(jìn)行復(fù)制 A B C D 解析解析PCR過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)的過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制過(guò)程相比較，主要復(fù)制過(guò)程相比較，主要有兩點(diǎn)不同：有兩點(diǎn)不同：PCR過(guò)程需要的引物是人工合成的單鏈過(guò)程需要的引物是人工合成的單鏈DNA或或RNA，長(zhǎng)度通常為，長(zhǎng)度通常為2030個(gè)核苷酸。個(gè)核苷酸。PCR過(guò)程中，過(guò)程中，DNA解旋不依賴解旋酶，而是通過(guò)對(duì)反應(yīng)溫度的控制來(lái)實(shí)現(xiàn)的。解旋不依賴解旋酶，而是通過(guò)對(duì)反應(yīng)溫度的控制來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 答案答案C 現(xiàn)在現(xiàn)在PCR技術(shù)技術(shù)(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))成為分子生物成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室里的一種常規(guī)手段，其原理是利用學(xué)實(shí)驗(yàn)室里的一種常規(guī)手段，其原理是利用DNA半保留復(fù)半保留復(fù)制，在試管中進(jìn)行制，在試管中進(jìn)行DNA的人工復(fù)制的人工復(fù)制(如下圖所示如下圖所示)，在很短，在很短的時(shí)間內(nèi)，將的時(shí)間內(nèi)，將DNA擴(kuò)增幾百萬(wàn)倍甚至幾十億倍，使實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增幾百萬(wàn)倍甚至幾十億倍，使實(shí)驗(yàn)室所需要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。所需要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。 (1)加熱使加熱使DNA雙鏈打開(kāi)，這一步是打開(kāi)雙鏈打開(kāi)，這一步是打開(kāi)_鍵，稱為鍵，稱為_(kāi)。 (2)當(dāng)溫度降低時(shí)，引物與模板當(dāng)溫度降低時(shí)，引物與模板_端結(jié)合，在端結(jié)合，在DNA聚合聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最終合成兩個(gè)酶的作用下，引物沿模板延伸，最終合成兩個(gè)DNA分子，此過(guò)程分子，此過(guò)程中原料是中原料是 _，遵循的原則是，遵循的原則是_。 (3)PCR技術(shù)的必要條件，除了模板、原料、技術(shù)的必要條件，除了模板、原料、ATP、酶以外，、酶以外，至少還需要三個(gè)條件，即：液體環(huán)境、適宜的至少還需要三個(gè)條件，即：液體環(huán)境、適宜的_和和_，前者由，前者由PCR儀自動(dòng)調(diào)控，后者則靠?jī)x自動(dòng)調(diào)控，后者則靠_來(lái)維持。來(lái)維持。 解析解析 (1)PCR技術(shù)利用熱變性原理使技術(shù)利用熱變性原理使DNA雙鏈間的氫雙鏈間的氫鍵斷裂，稱為變性。鍵斷裂，稱為變性。 (2)PCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增DNA與細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制所需原料一樣，復(fù)制所需原料一樣，為四種脫氧核苷酸，遵循的原則是堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。引物為四種脫氧核苷酸，遵循的原則是堿基互補(bǔ)配對(duì)原則。引物與模板的與模板的3端結(jié)合后，端結(jié)合后，DNA聚合酶才發(fā)揮作用。聚合酶才發(fā)揮作用。 (3)PCR技術(shù)與體內(nèi)技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制不完全相同，除了需要模復(fù)制不完全相同，除了需要模板、原料、板、原料、ATP、酶以外，至少還需要液體環(huán)境、適宜的溫、酶以外，至少還需要液體環(huán)境、適宜的溫度和酸堿度，適宜的溫度靠度和酸堿度，適宜的溫度靠PCR儀自動(dòng)調(diào)控，而酸堿度靠緩儀自動(dòng)調(diào)控，而酸堿度靠緩沖液來(lái)維持。沖液來(lái)維持。答案答案(1)氫變性氫變性(2)3四種脫氧核苷酸堿基互補(bǔ)配對(duì)原則四種脫氧核苷酸堿基互補(bǔ)配對(duì)原則(3)溫度酸堿度緩沖液溫度酸堿度緩沖液 (1)DNA母鏈的母鏈的3端對(duì)應(yīng)著子鏈的端對(duì)應(yīng)著子鏈的5端，即端，即DNA的兩條鏈的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?。是反向平行的?(2)解旋酶的作用是使解旋酶的作用是使DNA兩條鏈的氫鍵斷開(kāi)，而兩條鏈的氫鍵斷開(kāi)，而DNA聚合酶與聚合酶與DNA連接酶都是催化形成磷酸二酯鍵。連接酶都是催化形成磷酸二酯鍵。 (3)DNA聚合酶是將單個(gè)核苷酸加到已有的單鏈片段的聚合酶是將單個(gè)核苷酸加到已有的單鏈片段的3端上，需要模板，而端上，需要模板，而DNA連接酶連接的是兩條連接酶連接的是兩條DNA片段的片段的缺口，不需要模板。缺口，不需要模板。