專題專題5DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)和蛋白質(zhì)技術(shù) 課題課題2 2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNADNA片段片段 欄目鏈接欄目鏈接 欄目鏈接欄目鏈接在刑事偵破案件中常需要對樣品在刑事偵破案件中常需要對樣品DNA進(jìn)行分析，進(jìn)行分析，PCR技術(shù)能快速擴(kuò)增技術(shù)能快速擴(kuò)增DNA片段，在幾個小時內(nèi)復(fù)制出片段，在幾個小時內(nèi)復(fù)制出上百萬份的上百萬份的DNA拷貝，有效地解決了因為樣品中拷貝，有效地解決了因為樣品中DNA含量太低而難以對樣品進(jìn)行分析研究的問題?，F(xiàn)在含量太低而難以對樣品進(jìn)行分析研究的問題?，F(xiàn)在PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷、刑偵破案、古技術(shù)已廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和基因測序。生物學(xué)、基因克隆和基因測序。 欄目鏈接欄目鏈接請思考：請思考：1PCR技術(shù)的基本原理是什么？技術(shù)的基本原理是什么？2PCR反應(yīng)過程是怎樣的？反應(yīng)過程是怎樣的？ 欄目鏈接欄目鏈接 欄目鏈接欄目鏈接1生物體內(nèi)生物體內(nèi)DNA復(fù)制的條件復(fù)制的條件(1)原料：原料：_。(2)模板：解旋后的每一條模板：解旋后的每一條_。(3)酶：打開酶：打開DNA雙鏈的雙鏈的_和合成和合成DNA單鏈的單鏈的_。(4)引物：為引物：為DNA聚合酶的起始提供聚合酶的起始提供_末端。末端。一、一、PCR的原理及反應(yīng)過程的原理及反應(yīng)過程 4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸 DNA母鏈母鏈 解旋酶解旋酶 DNA聚合酶聚合酶 3 欄目鏈接欄目鏈接2PCR擴(kuò)增的原理擴(kuò)增的原理(1)概念：概念：PCR即多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種體外即多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種體外_的技術(shù)。它能以極少量的的技術(shù)。它能以極少量的DNA為模為模板，在幾小時內(nèi)復(fù)制出上百萬份的板，在幾小時內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝?？截悺?2)原理：原理：DNA變性：在變性：在_的溫度范圍內(nèi)，的溫度范圍內(nèi)，DNA的的_結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性。結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性。 迅速擴(kuò)增迅速擴(kuò)增DNA片段片段 80 100 雙螺旋雙螺旋 欄目鏈接欄目鏈接DNA復(fù)性：當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的復(fù)性：當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會重新鏈又會重新_，這個過程稱為復(fù)性。，這個過程稱為復(fù)性。DNA合成：合成：DNA聚合酶從引物聚合酶從引物_端開端開始延伸始延伸DNA鏈，鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的的合成方向總是從子鏈的_端向端向_端延伸。端延伸。 結(jié)合成雙鏈結(jié)合成雙鏈 3 5 3 欄目鏈接欄目鏈接(3)條件：條件：模板：解旋后的每一條模板：解旋后的每一條_。引物：能分別與引物：能分別與_結(jié)合的兩種引物結(jié)合的兩種引物。原料原料：_。酶：酶：_DNA聚合酶。聚合酶。其他條件：需要穩(wěn)定的其他條件：需要穩(wěn)定的_和能自動調(diào)節(jié)溫度和能自動調(diào)節(jié)溫度的溫控設(shè)備的溫控設(shè)備。 DNA母鏈母鏈 兩條模板鏈兩條模板鏈 4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸 耐熱的耐熱的 緩沖溶液緩沖溶液 欄目鏈接欄目鏈接 90 50 堿基互補(bǔ)配對堿基互補(bǔ)配對 欄目鏈接欄目鏈接 72 DNA聚合酶聚合酶 堿基互補(bǔ)配對原則堿基互補(bǔ)配對原則 欄目鏈接欄目鏈接1實驗用具實驗用具 (1)PCR儀：該儀器能自動調(diào)控儀：該儀器能自動調(diào)控_，實現(xiàn)，實現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。如果沒有的擴(kuò)增。如果沒有PCR儀，可用儀，可用3個個_水浴水浴鍋代替，操作時按程序在鍋代替，操作時按程序在3個水浴鍋中來回轉(zhuǎn)移個水浴鍋中來回轉(zhuǎn)移PCR反反應(yīng)的微量離心管。應(yīng)的微量離心管。 (2)微量離心管：總?cè)莘e為微量離心管：總?cè)莘e為_mL，實際上，實際上是進(jìn)行是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場所。反應(yīng)的場所。 (3)微量移液器：用于向微量離心管中轉(zhuǎn)移微量移液器：用于向微量離心管中轉(zhuǎn)移PCR配配方中的液體，每吸取一種試劑后其上的一次性吸液槍方中的液體，每吸取一種試劑后其上的一次性吸液槍頭都必須更換。頭都必須更換。二、二、PCR的實驗操作的實驗操作 溫度溫度 恒溫恒溫 0.5 欄目鏈接欄目鏈接2實驗步驟實驗步驟 用微量移液器用微量移液器 輕輕彈擊輕輕彈擊 欄目鏈接欄目鏈接 10 欄目鏈接欄目鏈接3DNA含量的測定含量的測定(1)原理：利用原理：利用DNA在在_的紫外線波段有一的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰。強(qiáng)烈的吸收峰。(2)計算公式：計算公式：DNA含量含量(g/mL)_稀釋倍稀釋倍數(shù)。數(shù)。點撥：點撥：在在PCR實驗操作中，常用微量離心管作為實驗操作中，常用微量離心管作為反應(yīng)場所，在操作時，用微量移液器按照反應(yīng)場所，在操作時，用微量移液器按照PCR反應(yīng)體反應(yīng)體系的配方在微量離心管中依次加入各組分，再設(shè)計好系的配方在微量離心管中依次加入各組分，再設(shè)計好PCR儀的循環(huán)程序就可以了。儀的循環(huán)程序就可以了。 260 nm 50(260 nm的讀數(shù)的讀數(shù)) 欄目鏈接欄目鏈接 欄目鏈接欄目鏈接一、生物體內(nèi)的一、生物體內(nèi)的DNA復(fù)制與復(fù)制與PCR反反應(yīng)的比較應(yīng)的比較 欄目鏈接欄目鏈接DNA單鏈有方向性，單鏈有方向性，DNA母鏈的母鏈的3端對應(yīng)端對應(yīng)著子鏈的著子鏈的5端，即端，即DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?。的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械摹Ｗ⒁獠煌傅淖饔茫航庑傅淖饔檬鞘棺⒁獠煌傅淖饔茫航庑傅淖饔檬鞘笵NA兩條鏈的氫鍵斷開，而兩條鏈的氫鍵斷開，而DNA聚合酶與聚合酶與DNA連接酶都是連接酶都是催化形成磷酸二酯鍵的。催化形成磷酸二酯鍵的。DNA聚合酶是將單個核苷酸加到已有的單鏈聚合酶是將單個核苷酸加到已有的單鏈片段的片段的3端上，需要模板，而端上，需要模板，而DNA連接酶連接的是兩連接酶連接的是兩條條DNA片段的缺口，不需要模板。片段的缺口，不需要模板。特特 別別提提 醒醒 欄目鏈接欄目鏈接例例1標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程一般分為變性、復(fù)性、延伸過程一般分為變性、復(fù)性、延伸三大步，這三大步需要的溫度依次是三大步，這三大步需要的溫度依次是()A92 、50 、72 B72 、50 、92 C50 、92 、72 D80 、50 、72 欄目鏈接欄目鏈接解析：解析：當(dāng)溫度上升到當(dāng)溫度上升到90 (9096 )以上時，雙以上時，雙鏈鏈DNA解聚為單鏈，稱之為變性；當(dāng)溫度下降到解聚為單鏈，稱之為變性；當(dāng)溫度下降到50 (4060 )左右時，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩左右時，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對與兩條單鏈條單鏈DNA結(jié)合；當(dāng)溫度上升到結(jié)合；當(dāng)溫度上升到72 (7075 )時，時，溶液中的四種脫氧核苷酸溶液中的四種脫氧核苷酸(A、T、C、G)在在Taq DNA聚聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則合成新的DNA鏈，稱為延伸。鏈，稱為延伸。答案：答案：A 欄目鏈接欄目鏈接變式變式訓(xùn)練訓(xùn)練1DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是的復(fù)制需要引物，其主要原因是()A可加快可加快DNA的復(fù)制速度的復(fù)制速度B引物可與引物可與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合母鏈通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合C引物的引物的5端有助端有助DNA聚合酶的延伸聚合酶的延伸DNA鏈鏈DDNA聚合酶只能從聚合酶只能從3端延伸端延伸DNA鏈鏈 欄目鏈接欄目鏈接變式變式訓(xùn)練訓(xùn)練解析：解析：DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，為了明確的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模瑸榱嗣鞔_地表示地表示DNA的方向，通常將的方向，通常將DNA的羥基的羥基(OH)末端稱末端稱為為3端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5端。端。DNA聚合酶聚合酶不能從不能從5端開始合成端開始合成DNA，而只能從，而只能從3端延伸端延伸DNA鏈。因此，鏈。因此，DNA復(fù)制需要引物。當(dāng)引物與復(fù)制需要引物。當(dāng)引物與DNA母鏈通母鏈通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合后，過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的聚合酶就能從引物的3端開始延伸端開始延伸DNA鏈，鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的合成方向總是從子鏈的的5端向端向3端延伸。端延伸。答案：答案：D 欄目鏈接欄目鏈接二、二、PCR技術(shù)的基本原理技術(shù)的基本原理類似于類似于DNA的天然復(fù)制過程，由變性的天然復(fù)制過程，由變性復(fù)性復(fù)性延延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：1模板模板DNA的變性的變性模板模板DNA經(jīng)加熱至經(jīng)加熱至95 左右一定時間后，使模板左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的擴(kuò)增形成的DNA的雙鏈解開，使之的雙鏈解開，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。2模板模板DNA與引物的退火與引物的退火(復(fù)性復(fù)性)模板模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55 左左右，引物與模板右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合。單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合。 欄目鏈接欄目鏈接 欄目鏈接欄目鏈接3引物的延伸引物的延伸DNA模板引物結(jié)合物在模板引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，聚合酶的作用下，以四種脫氧核苷酸為反應(yīng)原料，以四種脫氧核苷酸為反應(yīng)原料，DNA母鏈為模板，按堿母鏈為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性復(fù)性復(fù)性延伸三過延伸三過程，就可獲得更多的程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈，而且這種新鏈又成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需又成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24 min,23 h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。 欄目鏈接欄目鏈接 PCR擴(kuò)增過程中的易錯點擴(kuò)增過程中的易錯點PCR過程中無解旋酶，破壞氫鍵需要升高溫度過程中無解旋酶，破壞氫鍵需要升高溫度才能打開氫鍵，但此時的溫度還不能破壞磷酸二酯鍵，才能打開氫鍵，但此時的溫度還不能破壞磷酸二酯鍵，因此，熱變性后是因此，熱變性后是DNA單鏈，并未分解成單體。單鏈，并未分解成單體。復(fù)性時只是在引物和復(fù)性時只是在引物和DNA單鏈之間形成氫鍵，單鏈之間形成氫鍵，兩條單鏈之間并未形成氫鍵，因此復(fù)性后，無雙鏈兩條單鏈之間并未形成氫鍵，因此復(fù)性后，無雙鏈DNA分子形成。分子形成。特特 別別提提 醒醒 欄目鏈接欄目鏈接三、三、PCR的實驗操作的實驗操作1操作步驟操作步驟(1)按按PCR反應(yīng)體系的配方配制所需試劑。反應(yīng)體系的配方配制所需試劑。(2)用微量移液器按照配方在微量離心管中依次加用微量移液器按照配方在微量離心管中依次加入各組分。入各組分。(3)蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。(4)將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約10 s。 欄目鏈接欄目鏈接(5)將離心管放在將離心管放在PCR儀上，設(shè)置好儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)儀的循環(huán)程序。程序。以上過程可以概括為準(zhǔn)備、移液、混合、離心、以上過程可以概括為準(zhǔn)備、移液、混合、離心、反應(yīng)五大步。反應(yīng)五大步。 欄目鏈接欄目鏈接2實驗結(jié)果與分析實驗結(jié)果與分析(1)實驗中實驗中DNA含量的測定。含量的測定。稀釋：取稀釋：取2 L PCR反應(yīng)液，加入反應(yīng)液，加入98 L蒸餾水，蒸餾水，即將樣品稀釋了即將樣品稀釋了50倍。倍。對照調(diào)零：以蒸餾水作空白對照，在波長對照調(diào)零：以蒸餾水作空白對照，在波長260 nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)至零處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)至零。測定：取測定：取DNA稀釋液稀釋液100 L至比色杯中，測定至比色杯中，測定260 nm處的光吸收值處的光吸收值。計算：計算：DNA含量含量(g/mL)50(260 nm的讀的讀數(shù)數(shù))稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)。 欄目鏈接欄目鏈接(2)理論上理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計算。擴(kuò)增數(shù)目的計算。DNA擴(kuò)增與擴(kuò)增與DNA復(fù)制一樣，呈指數(shù)擴(kuò)增。若只有復(fù)制一樣，呈指數(shù)擴(kuò)增。若只有一個一個DNA為模板，則復(fù)制為模板，則復(fù)制n次后有次后有2n個；若一開始有個；若一開始有a個模板，則復(fù)制個模板，則復(fù)制n次有次有a2n個個DNA。(3)DNA擴(kuò)增是否成功。擴(kuò)增是否成功。檢測檢測DNA片段擴(kuò)增情況可以采用上述方法，也可片段擴(kuò)增情況可以采用上述方法，也可以采用電泳檢測的方法，可以通過在紫外線下直接觀以采用電泳檢測的方法，可以通過在紫外線下直接觀察察DNA帶的分布及粗細(xì)程度來評價擴(kuò)增的效果。如果帶的分布及粗細(xì)程度來評價擴(kuò)增的效果。如果擴(kuò)增不成功，則要分析失敗原因。可能的原因有：漏擴(kuò)增不成功，則要分析失敗原因?？赡艿脑蛴校郝┘恿思恿薖CR的反應(yīng)成分、各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)、的反應(yīng)成分、各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)、PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)取３绦蛟O(shè)置不當(dāng)?shù)取?欄目鏈接欄目鏈接例例2下列操作過程的敘述中錯誤的是下列操作過程的敘述中錯誤的是()APCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌BPCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在20 儲存儲存CPCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化融化D在微量離心管中添加反應(yīng)成分時，每吸取一種在微量離心管中添加反應(yīng)成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的吸液槍頭都必須更換試劑后，移液器上的吸液槍頭都必須更換 欄目鏈接欄目鏈接解析：解析：從冰箱中放置的緩沖液和酶取出后應(yīng)放在冰從冰箱中放置的緩沖液和酶取出后應(yīng)放在冰塊上緩慢融化，而不能迅速融化。塊上緩慢融化，而不能迅速融化。答案：答案：C 欄目鏈接欄目鏈接2在在PCR實驗操作中，下列說法不正確的是實驗操作中，下列說法不正確的是()A在微量離心管中添加各種試劑時，只需一個槍在微量離心管中添加各種試劑時，只需一個槍頭頭B離心管的蓋子一定要蓋嚴(yán)，防止液體外溢離心管的蓋子一定要蓋嚴(yán)，防止液體外溢C用手輕彈離心管壁的目的是使反應(yīng)液充分混合用手輕彈離心管壁的目的是使反應(yīng)液充分混合D離心的目的是使反應(yīng)液集中在離心管部，提高離心的目的是使反應(yīng)液集中在離心管部，提高反應(yīng)效果反應(yīng)效果變變 式式訓(xùn)訓(xùn) 練練 欄目鏈接欄目鏈接解析：解析：在微量離心管中添加各種試劑時，每吸取一在微量離心管中添加各種試劑時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭必須更換，以確保實驗的種試劑后，移液器上的槍頭必須更換，以確保實驗的準(zhǔn)確性；離心管的蓋子一定要蓋嚴(yán)，防止實驗中脫落準(zhǔn)確性；離心管的蓋子一定要蓋嚴(yán)，防止實驗中脫落或液體外溢；離心或液體外溢；離心10 s的目的是使反應(yīng)液集中在離心管的目的是使反應(yīng)液集中在離心管部，提高反應(yīng)效果。部，提高反應(yīng)效果。答案：答案：A變變 式式訓(xùn)訓(xùn) 練練 欄目鏈接欄目鏈接