課題課題1 1 微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物的實(shí)驗(yàn)微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件：室培養(yǎng)條件：合合適的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件適的營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件確確保其他微生物無法混保其他微生物無法混入入一一. . 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 1. 1. 概念：概念： 按按照微生物對(duì)照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同的不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基養(yǎng)基質(zhì)。質(zhì)。 需要加入瓊脂（凝固劑）需要加入瓊脂（凝固劑） 多糖多糖2. 2. 種類：種類：按按物理形物理形態(tài)分態(tài)分液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基應(yīng)用微生物分離、鑒定、計(jì)數(shù)和應(yīng)用微生物分離、鑒定、計(jì)數(shù)和菌種保存等方面菌種保存等方面 按照培養(yǎng)基按照培養(yǎng)基用途（功能）分用途（功能）分 基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇培選擇培養(yǎng)基養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基按照培養(yǎng)基的成分來分按照培養(yǎng)基的成分來分 合成培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基各自優(yōu)缺點(diǎn)？各自優(yōu)缺點(diǎn)？選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基不加氮源的無氮培養(yǎng)基不加氮源的無氮培養(yǎng)基: : 分離固氮菌分離固氮菌不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基: : 分離自養(yǎng)型微生物分離自養(yǎng)型微生物加入四環(huán)素等抗生素的培養(yǎng)基加入四環(huán)素等抗生素的培養(yǎng)基: : 分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞不加氨基嘌呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的不加氨基嘌呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)基: : 分離雜交瘤細(xì)胞分離雜交瘤細(xì)胞加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: : 分離金黃色葡萄分離金黃色葡萄球菌球菌從成分上判斷：從成分上判斷：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基麥芽汁培養(yǎng)基麥芽汁培養(yǎng)基葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成養(yǎng)基合成養(yǎng)基半合成養(yǎng)基半合成養(yǎng)基3. 3. 成分：成分：水、無機(jī)鹽、碳源、氮源、（生長(zhǎng)因子）水、無機(jī)鹽、碳源、氮源、（生長(zhǎng)因子）+滿足微生物對(duì)滿足微生物對(duì)pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣的、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣的要求要求培養(yǎng)乳酸菌培養(yǎng)乳酸菌 添加添加 維生素維生素培養(yǎng)霉菌培養(yǎng)霉菌 PH調(diào)至調(diào)至 酸性酸性培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌 PH調(diào)至調(diào)至 中性或微堿中性或微堿CC二二. 無菌技術(shù)無菌技術(shù)1.1.無無菌菌技術(shù)技術(shù)2.2.消消毒和滅菌有何不同？毒和滅菌有何不同？泛泛指培養(yǎng)微生物操作中，所有防指培養(yǎng)微生物操作中，所有防 止雜菌污染的方法。止雜菌污染的方法。無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。被微生物感染。3. 3. 常用的常用的消毒消毒方法：方法：煮沸消煮沸消毒法毒法巴巴氏消氏消毒法毒法紫外線紫外線化化學(xué)藥劑消毒法學(xué)藥劑消毒法70-7570-75 3030分鐘分鐘8080 15 15分鐘分鐘 牛牛奶奶 接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)接種室、接種箱或超凈工作臺(tái) 酒精、氯氣（水）酒精、氯氣（水） 接種環(huán)接種環(huán)接種針接種針4.常常用的用的滅菌滅菌方法：方法：灼燒灼燒滅菌滅菌干熱滅菌干熱滅菌 高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 100kPa 121 100kPa 121 15-30min 15-30min 接接種環(huán)、接種環(huán)、接種針、試管口、瓶口種針、試管口、瓶口 玻璃器玻璃器皿和金屬皿和金屬 判斷下列各項(xiàng)是否需要消毒或滅菌。如需要，判斷下列各項(xiàng)是否需要消毒或滅菌。如需要，選擇合適方法。選擇合適方法。1 1）豆?jié){）豆?jié){ 2 2）游泳池）游泳池 3 3）超凈工作臺(tái)）超凈工作臺(tái) 4 4）玻棒、試管、吸管、錐形瓶）玻棒、試管、吸管、錐形瓶 5 5）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)皿）培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)皿 6 6）無菌水）無菌水 7 7）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基8 8）接種環(huán)、接種針）接種環(huán)、接種針9 9）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手計(jì)算、稱量計(jì)算、稱量溶化溶化滅菌滅菌倒平板（分裝）倒平板（分裝）接種（方法）接種（方法）培養(yǎng)培養(yǎng)保存保存制備培制備培養(yǎng)基養(yǎng)基純化純化細(xì)菌細(xì)菌調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)PHPH4 4、倒平板、倒平板冷冷卻至卻至50501 1、為什么需要使錐形瓶口通過火焰？、為什么需要使錐形瓶口通過火焰？2 2、平板冷凝后，為什么要將平板倒置？、平板冷凝后，為什么要將平板倒置？3、如何知道滅菌后的培養(yǎng)基是否還有、如何知道滅菌后的培養(yǎng)基是否還有雜菌？雜菌？4、接種細(xì)菌后，培養(yǎng)基還需倒置培養(yǎng)、接種細(xì)菌后，培養(yǎng)基還需倒置培養(yǎng)嗎？嗎？復(fù)習(xí)：復(fù)習(xí)：1 1、按照用途分培養(yǎng)基可分為哪幾類？、按照用途分培養(yǎng)基可分為哪幾類？ 其中添加青霉素的培養(yǎng)基為哪種類其中添加青霉素的培養(yǎng)基為哪種類型？添加伊紅型？添加伊紅美藍(lán)的為哪種培養(yǎng)基？美藍(lán)的為哪種培養(yǎng)基？2 2、培養(yǎng)基的成分都含有哪些？、培養(yǎng)基的成分都含有哪些？3 3、配制培養(yǎng)基時(shí)是先調(diào)節(jié)、配制培養(yǎng)基時(shí)是先調(diào)節(jié)PHPH值，還是值，還是先滅菌？先滅菌？4 4、無菌操作是如何實(shí)現(xiàn)的？、無菌操作是如何實(shí)現(xiàn)的？5 5、接種：、接種： 方法方法 接種針接種針 穿刺接種穿刺接種 接種環(huán)接種環(huán) 平板劃線平板劃線法法 玻璃刮鏟玻璃刮鏟 稀釋涂布稀釋涂布平板法平板法 平板劃線法平板劃線法 通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作表面連續(xù)畫線的操作, ,將聚集的菌種將聚集的菌種逐步逐步稀釋分散稀釋分散到培養(yǎng)基的表面到培養(yǎng)基的表面. . 在數(shù)次畫線后在數(shù)次畫線后, ,可以分離到由可以分離到由一一個(gè)細(xì)胞繁殖個(gè)細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)而來的肉眼可見的子細(xì)胞胞群體群體, ,這就是這就是菌落菌落. .1.1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？前都要灼燒接種環(huán)？在最后一次劃在最后一次劃線操作結(jié)線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？操作的第一步灼燒接種環(huán)：操作的第一步灼燒接種環(huán)： 每每次劃線前灼燒接種環(huán)：次劃線前灼燒接種環(huán)：最后一次劃最后一次劃線結(jié)束后灼燒接種線結(jié)束后灼燒接種環(huán)：環(huán)： 避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；殺殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。便得到菌落。及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。染環(huán)境和感染操作者。2.2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？再進(jìn)行劃線？3.3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？么總是從上一次劃線的末端開始劃線？以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。劃線后，線條劃線后，線條末端末端細(xì)菌的數(shù)目比細(xì)菌的數(shù)目比線條起線條起始處始處要要少少，每，每次從上一次劃線的末端開次從上一次劃線的末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落繁殖而來的菌落稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法菌液菌液 稀釋度足夠高的菌液里，微生物被稀釋度足夠高的菌液里，微生物被分散成分散成單個(gè)細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞，從而在培養(yǎng)基表，從而在培養(yǎng)基表面形成面形成單個(gè)菌落單個(gè)菌落系列梯度系列梯度稀釋稀釋涂布涂布到到培養(yǎng)基培養(yǎng)基 涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第操作要求，想一想，第2 2步應(yīng)如何進(jìn)行無步應(yīng)如何進(jìn)行無菌操作？菌操作？ 應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無菌無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。在酒精燈火焰周圍等等。將接種后的培養(yǎng)基和一個(gè)未接種的將接種后的培養(yǎng)基和一個(gè)未接種的培養(yǎng)基都放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基都放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12h和和24h后觀察后觀察觀察菌落的觀察菌落的顏色，形狀，大小顏色，形狀，大小是否是否符合某種細(xì)菌的菌落特征符合某種細(xì)菌的菌落特征未接種的培養(yǎng)基表面如果有菌落生未接種的培養(yǎng)基表面如果有菌落生長(zhǎng)，說明什么？長(zhǎng)，說明什么？大腸桿菌菌落特征：綠色有金屬光澤大腸桿菌菌落特征：綠色有金屬光澤伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基1 1、臨時(shí)保藏：、臨時(shí)保藏：接種到固體斜面接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長(zhǎng)培養(yǎng)基，菌落長(zhǎng)成后置于成后置于44冰冰箱保存。箱保存。2 2、長(zhǎng)期保存：、長(zhǎng)期保存：甘油冷凍管藏法甘油冷凍管藏法