第第1部部分分專專題題5課課題題2理解教材理解教材新知新知把握熱點(diǎn)把握熱點(diǎn)考向考向應(yīng)用創(chuàng)新應(yīng)用創(chuàng)新演練演練知識(shí)點(diǎn)一知識(shí)點(diǎn)一知識(shí)點(diǎn)二知識(shí)點(diǎn)二考向一考向一考向二考向二 1.DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只，只 能從能從3端延伸端延伸DNA鏈。鏈。 2DNA的合成方向總是從子鏈的的合成方向總是從子鏈的5端向端向3 端延伸。端延伸。3PCR反應(yīng)需要反應(yīng)需要DNA模板、引物、四種脫氧核苷酸、耐熱模板、引物、四種脫氧核苷酸、耐熱的的DNA聚合酶等條件。聚合酶等條件。4PCR原理：原理：DNA熱變性的原理。熱變性的原理。5PCR每次循環(huán)都包括變性、復(fù)性和延伸三步。每次循環(huán)都包括變性、復(fù)性和延伸三步。6PCR擴(kuò)增擴(kuò)增DNA片段可以使目的片段呈指數(shù)增長(zhǎng)。片段可以使目的片段呈指數(shù)增長(zhǎng)。 自讀教材自讀教材夯基礎(chǔ)夯基礎(chǔ) 1細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的條件復(fù)制的條件原料原料 4種種 模板模板2條條DNA母鏈母鏈酶酶 和和 引物引物使使DNA聚合酶能夠從引物的聚合酶能夠從引物的 開(kāi)始連接脫開(kāi)始連接脫氧核苷酸氧核苷酸脫氧核苷酸脫氧核苷酸解旋酶解旋酶DNA聚合酶聚合酶3端端 2PCR擴(kuò)增的原理及條件擴(kuò)增的原理及條件 (1)PCR技術(shù)：即技術(shù)：即 ，是一種，是一種 迅迅速擴(kuò)增速擴(kuò)增 的技術(shù)。它能以極少量的的技術(shù)。它能以極少量的 為模板，為模板，在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝?？截?。 (2)擴(kuò)增方向：總是從子鏈的擴(kuò)增方向：總是從子鏈的 端向端向 端延伸。端延伸。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外體外DNA片段片段DNA53 (3)引物：引物： 特點(diǎn)：是一小段特點(diǎn)：是一小段 或或 ，能與，能與 的一的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)，用于段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)，用于PCR的引物長(zhǎng)度通常為的引物長(zhǎng)度通常為 個(gè)核苷酸。個(gè)核苷酸。 需要引物的原因：需要引物的原因：DNA聚合酶不能聚合酶不能 ，而只能從而只能從 延伸延伸DNA鏈，因此鏈，因此DNA復(fù)制需要引物。復(fù)制需要引物。DNARNADNA母鏈母鏈2030從頭合成從頭合成DNA3端端DNA的熱變性的熱變性DNA兩條模板鏈兩條模板鏈脫氧核苷酸脫氧核苷酸耐高溫的耐高溫的緩沖溶液緩沖溶液自動(dòng)自動(dòng)調(diào)控溫度調(diào)控溫度3PCR的反應(yīng)過(guò)程的反應(yīng)過(guò)程(1) ：溫度上升到：溫度上升到90 以上時(shí)，雙鏈以上時(shí)，雙鏈DNA解旋為解旋為 單鏈單鏈 (2) ：溫度下降到：溫度下降到50 左右，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)左右，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ) 配對(duì)與兩條單鏈配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合結(jié)合 (3) ：溫度上升到：溫度上升到72 左右時(shí)，在左右時(shí)，在 酶的作酶的作 用下，四種脫氧核苷酸通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)合用下，四種脫氧核苷酸通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)合 成新成新DNA鏈鏈變性變性復(fù)性復(fù)性延伸延伸DNA聚合聚合 1DNA復(fù)制時(shí)為什么需要引物？復(fù)制時(shí)為什么需要引物？ 提示：提示：DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，而只能，而只能從從3端延伸端延伸DNA鏈。鏈。 2PCR擴(kuò)增擴(kuò)增DNA過(guò)程中是否還需要解旋酶？過(guò)程中是否還需要解旋酶？ 提示：提示：不需要。不需要。 3利用利用PCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增1個(gè)個(gè)DNA分子分子n次，所得次，所得DNA分分子中，不含引物的脫氧核苷酸鏈所占的比例是多少？含引子中，不含引物的脫氧核苷酸鏈所占的比例是多少？含引物的物的DNA分子所占的比例是多少？分子所占的比例是多少？ 提示：提示：1/2n；100%。 跟隨名師跟隨名師解疑難解疑難 1細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制與體外復(fù)制與體外DNA擴(kuò)增擴(kuò)增(PCR技術(shù)技術(shù))的比較的比較細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制復(fù)制PCR不不同同點(diǎn)點(diǎn)解旋解旋解旋酶，邊解旋邊復(fù)制解旋酶，邊解旋邊復(fù)制80 100 高溫解旋，雙高溫解旋，雙鏈完全分開(kāi)鏈完全分開(kāi)酶酶DNA解旋酶、解旋酶、DNA聚合酶、聚合酶、DNA連接酶連接酶TaqDNA聚合酶聚合酶引物引物RNADNA或或RNA溫度溫度體內(nèi)溫和條件體內(nèi)溫和條件高溫高溫子鏈子鏈合成合成一條鏈連續(xù)一條鏈連續(xù)(先導(dǎo)鏈先導(dǎo)鏈)，另一條鏈，另一條鏈不連續(xù)，先合成片段，再由不連續(xù)，先合成片段，再由DNA連接酶連結(jié)連接酶連結(jié)(滯后鏈滯后鏈)兩條子鏈均連續(xù)合成兩條子鏈均連續(xù)合成相同點(diǎn)相同點(diǎn)提供提供DNA模板模板四種脫氧核苷酸作原料四種脫氧核苷酸作原料子鏈延伸的方向都是從子鏈延伸的方向都是從5端到端到3端端 2PCR反應(yīng)過(guò)程反應(yīng)過(guò)程 (1)變性：當(dāng)溫度上升到變性：當(dāng)溫度上升到90 以上時(shí)，雙鏈以上時(shí)，雙鏈DNA解聚解聚為單鏈，如圖：為單鏈，如圖： (2)復(fù)性：系統(tǒng)溫度下降至復(fù)性：系統(tǒng)溫度下降至50 左右時(shí)，兩種引物通左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合，如下圖：結(jié)合，如下圖： (3)延伸：當(dāng)系統(tǒng)溫度上升至延伸：當(dāng)系統(tǒng)溫度上升至72 左右，溶液中的四左右，溶液中的四種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸(A、T、G、C)在在DNA聚合酶的作用下，據(jù)聚合酶的作用下，據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈，如下圖：鏈，如下圖： 特別提醒特別提醒 PCR反應(yīng)的結(jié)果反應(yīng)的結(jié)果 PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)都包括變一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)都包括變性、復(fù)性、延伸三步。性、復(fù)性、延伸三步。 兩引物之間的固定長(zhǎng)度的兩引物之間的固定長(zhǎng)度的DNA序列呈指數(shù)擴(kuò)增。序列呈指數(shù)擴(kuò)增。 自讀教材自讀教材夯基礎(chǔ)夯基礎(chǔ) 微量移液器微量移液器1實(shí)驗(yàn)操作程序?qū)嶒?yàn)操作程序 準(zhǔn)備：按照準(zhǔn)備：按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需試劑擺放反應(yīng)體系的配方將所需試劑擺放 于實(shí)驗(yàn)桌上于實(shí)驗(yàn)桌上 移液：用移液：用 按照配方在微量離心管中依按照配方在微量離心管中依 次加入各組分次加入各組分 混合：蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁混合：蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁 ：將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約：將微量離心管放在離心機(jī)上，離心約10 s。目的。目的是是 使反應(yīng)液集中在使反應(yīng)液集中在 反應(yīng)：將離心管放入反應(yīng)：將離心管放入 中，設(shè)置程序進(jìn)行反應(yīng)中，設(shè)置程序進(jìn)行反應(yīng)離心管底部離心管底部PCR儀儀 2DNA含量的測(cè)定含量的測(cè)定 (1)原理：利用原理：利用DNA在在 的紫外線波段的吸收峰的紫外線波段的吸收峰曲線來(lái)測(cè)定相應(yīng)含量。曲線來(lái)測(cè)定相應(yīng)含量。 (2)計(jì)算公式：計(jì)算公式：DNA含量含量(g/mL)50(260 nm的讀的讀數(shù)數(shù))稀釋倍數(shù)。稀釋倍數(shù)。260 nm離心離心 跟隨名師跟隨名師解疑難解疑難 1實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng) (1)為避免外源為避免外源DNA等因素的污染，實(shí)驗(yàn)中使用的一等因素的污染，實(shí)驗(yàn)中使用的一些用具在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。些用具在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌。 (2)所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在20 儲(chǔ)儲(chǔ)存。存。 (3)在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，每吸取一種試在微量離心管中添加反應(yīng)成分時(shí)，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭必須更換。所有成分都加入后，通劑后，移液器上的槍頭必須更換。所有成分都加入后，通過(guò)手指輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻。過(guò)手指輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻。 2結(jié)果分析與評(píng)價(jià)結(jié)果分析與評(píng)價(jià) DNA在在260 nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，可以利用的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，可以利用DNA的這一特點(diǎn)進(jìn)行的這一特點(diǎn)進(jìn)行DNA含量的測(cè)量，以判斷含量的測(cè)量，以判斷DNA片段的擴(kuò)片段的擴(kuò)增是否成功。具體方法如下：增是否成功。具體方法如下： (1)稀釋：取稀釋：取2 L PCR反應(yīng)液，加入反應(yīng)液，加入98 L蒸餾水，即將樣蒸餾水，即將樣品進(jìn)行品進(jìn)行50倍稀釋。倍稀釋。 (2)對(duì)照調(diào)零：以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)對(duì)照調(diào)零：以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)260 nm處，處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。 (3)測(cè)定：取測(cè)定：取DNA稀釋液稀釋液100 L至比色杯中，測(cè)定至比色杯中，測(cè)定260 nm處的光吸收值。處的光吸收值。 (4)計(jì)算：檢測(cè)計(jì)算：檢測(cè)DNA片段的擴(kuò)增情況，可以通過(guò)計(jì)算片段的擴(kuò)增情況，可以通過(guò)計(jì)算DNA含量來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，計(jì)算公式為：含量來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，計(jì)算公式為：DNA含量含量(g/mL)50(260 nm的讀數(shù)的讀數(shù))稀釋倍數(shù)。稀釋倍數(shù)。 如果擴(kuò)增不成功，則要分析失敗原因?？赡艿脑蛴校喝绻麛U(kuò)增不成功，則要分析失敗原因。可能的原因有：漏加了漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程程序設(shè)置不當(dāng)?shù)?。序設(shè)置不當(dāng)?shù)取?特別提醒特別提醒公式中的公式中的50代表在波長(zhǎng)代表在波長(zhǎng)260 nm紫外波段紫外波段照射下，吸收峰為照射下，吸收峰為1時(shí)，時(shí)，DNA含量為含量為50 g/mL。 例例1 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外迅速擴(kuò)增是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。片段的技術(shù)。PCR過(guò)程一般經(jīng)歷下述三十多次循環(huán)：過(guò)程一般經(jīng)歷下述三十多次循環(huán)：95 下變性下變性(使模板使模板DNA解旋解旋)55 下復(fù)性下復(fù)性(引物與引物與DNA模板模板鏈結(jié)合鏈結(jié)合)72 下延伸下延伸(形成新的脫氧核苷酸鏈形成新的脫氧核苷酸鏈)。下列有關(guān)。下列有關(guān)PCR過(guò)程的敘述中不正確的是過(guò)程的敘述中不正確的是 () A變性過(guò)程中破壞的是變性過(guò)程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對(duì)之間的氫分子內(nèi)堿基對(duì)之間的氫鍵，也可利用解旋酶實(shí)現(xiàn)鍵，也可利用解旋酶實(shí)現(xiàn) B復(fù)性過(guò)程中引物與復(fù)性過(guò)程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠堿基模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補(bǔ)配對(duì)原則完成的互補(bǔ)配對(duì)原則完成的 C延伸過(guò)程中需要延伸過(guò)程中需要DNA聚合酶和四種核糖核苷酸聚合酶和四種核糖核苷酸 DPCR與細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比所需要酶的最適溫度復(fù)制相比所需要酶的最適溫度較高較高 解析解析變性是為了使變性是為了使DNA內(nèi)部的氫鍵斷裂，雙螺旋內(nèi)部的氫鍵斷裂，雙螺旋打開(kāi)，體內(nèi)復(fù)制時(shí)借助解旋酶來(lái)實(shí)現(xiàn)；借助堿基互補(bǔ)配對(duì)打開(kāi)，體內(nèi)復(fù)制時(shí)借助解旋酶來(lái)實(shí)現(xiàn)；借助堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，引物可與原則，引物可與DNA模板鏈結(jié)合；延伸時(shí)是形成新的模板鏈結(jié)合；延伸時(shí)是形成新的DNA分子，需要以脫氧核苷酸為原料；分子，需要以脫氧核苷酸為原料；PCR過(guò)程的溫度過(guò)程的溫度高，會(huì)導(dǎo)致一般的高，會(huì)導(dǎo)致一般的DNA聚合酶失活，需特定的耐高溫聚合酶失活，需特定的耐高溫DNA聚合酶。聚合酶。 答案答案C (1)DNA母鏈的母鏈的3端對(duì)應(yīng)著子鏈的端對(duì)應(yīng)著子鏈的5端，即端，即DNA的兩條的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?。鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械摹?(2)解旋酶的作用是使解旋酶的作用是使DNA兩條鏈的氫鍵斷開(kāi)，而兩條鏈的氫鍵斷開(kāi)，而DNA聚合酶與聚合酶與DNA連接酶都是催化形成磷酸二酯鍵的。連接酶都是催化形成磷酸二酯鍵的。 (3)DNA聚合酶是將單個(gè)核苷酸加到已有的單鏈片段聚合酶是將單個(gè)核苷酸加到已有的單鏈片段的的3端上，需要模板；而端上，需要模板；而DNA連接酶連接的是兩條連接酶連接的是兩條DNA片段的缺口，不需要模板。片段的缺口，不需要模板。 例例2 在遺傳病及刑偵破案中常需要對(duì)樣品在遺傳病及刑偵破案中常需要對(duì)樣品DNA進(jìn)行進(jìn)行分析，分析，PCR技術(shù)能快速擴(kuò)增技術(shù)能快速擴(kuò)增DNA片段，在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)復(fù)片段，在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝，有效地解決了因?yàn)闃悠分锌截?，有效地解決了因?yàn)闃悠分蠨NA含量太低而難以對(duì)樣品進(jìn)行分析研究的問(wèn)題。據(jù)圖含量太低而難以對(duì)樣品進(jìn)行分析研究的問(wèn)題。據(jù)圖回答相關(guān)問(wèn)題：回答相關(guān)問(wèn)題：a鏈鏈 5GGTC35GGOH(引物引物) b鏈鏈3CCAG5 (引物引物)95 5GGTC33CCAG555 5GGTC33CCAG572 5GGOH _ _ (1)在相應(yīng)的橫線上寫(xiě)出引物在相應(yīng)的橫線上寫(xiě)出引物，并在復(fù)性這一步驟中，并在復(fù)性這一步驟中將引物將引物置于合適的位置。置于合適的位置。 (2)在相應(yīng)的橫線上寫(xiě)出循環(huán)一次后生成的在相應(yīng)的橫線上寫(xiě)出循環(huán)一次后生成的DNA分子。分子。 (3)若將作為原料的四種脫氧核苷酸用若將作為原料的四種脫氧核苷酸用32P標(biāo)記，請(qǐng)分析標(biāo)記，請(qǐng)分析循環(huán)一次后生成的循環(huán)一次后生成的DNA分子的特點(diǎn)是分子的特點(diǎn)是_；循環(huán)；循環(huán)n次次后生成的后生成的DNA分子中不含放射性的單鏈占總單鏈的比例為分子中不含放射性的單鏈占總單鏈的比例為_(kāi)。 解析解析(1)DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能，只能從從3端延伸端延伸DNA鏈，引物就提供了鏈，引物就提供了3端。子鏈延伸方向?yàn)槎?。子鏈延伸方向?yàn)?3，引物，引物與與b鏈部分堿基互補(bǔ)，引物鏈部分堿基互補(bǔ)，引物則與則與a鏈部分鏈部分堿基互補(bǔ)，且連接到堿基互補(bǔ)，且連接到a鏈的鏈的3端，故引物端，故引物的結(jié)構(gòu)為的結(jié)構(gòu)為5GAOH，復(fù)性結(jié)果為：，復(fù)性結(jié)果為： HOAG5 5GGTC3。 (2)經(jīng)過(guò)一次循環(huán)后，產(chǎn)生的兩個(gè)經(jīng)過(guò)一次循環(huán)后，產(chǎn)生的兩個(gè)DNA分子分別含有分子分別含有引物引物和引物和引物。 (3)由于作為原料的四種脫氧核苷酸被由于作為原料的四種脫氧核苷酸被32P標(biāo)記，所以標(biāo)記，所以新合成的子鏈均含有放射性，一次循環(huán)后的兩個(gè)新合成的子鏈均含有放射性，一次循環(huán)后的兩個(gè)DNA各各有一條鏈含有一條鏈含32P，若復(fù)制，若復(fù)制n次，產(chǎn)生子鏈共次，產(chǎn)生子鏈共2n2，其中只，其中只有親本的兩條母鏈不含有親本的兩條母鏈不含32P，則其所占比例為，則其所占比例為2/(2n2)1/2n。答案答案(1)5GAOHa鏈鏈5GGTC3 HOAG5(2)5GGTC33CCAG5 3CCAG55GGTC3(3)每個(gè)每個(gè)DNA分子各有一條鏈含分子各有一條鏈含32P標(biāo)記標(biāo)記1/2n 理論上理論上DNA擴(kuò)增呈指數(shù)增長(zhǎng)。若只有一個(gè)擴(kuò)增呈指數(shù)增長(zhǎng)。若只有一個(gè)DNA分子分子作模板，則復(fù)制作模板，則復(fù)制n次后有次后有2n個(gè)個(gè)DNA分子；若一開(kāi)始有分子；若一開(kāi)始有m個(gè)個(gè)DNA分子作模板，則復(fù)制分子作模板，則復(fù)制n次后有次后有m2n個(gè)個(gè)DNA分子；實(shí)分子；實(shí)際操作過(guò)程中由于無(wú)關(guān)變量的影響，一般來(lái)說(shuō)實(shí)際值要際操作過(guò)程中由于無(wú)關(guān)變量的影響，一般來(lái)說(shuō)實(shí)際值要略小于理論值。略小于理論值。