Chapter 4 EnzymeChapter 4 Enzyme本章重點及難點重點：了解酶作為生物催化劑 的特點為，國際命 名；以胰凝乳蛋白酶為例，了解酶催化作用機理 ；掌握酶促反應動力學中米氏方程及Km的意義、應用，掌握影響酶促反應動力學的因素及與影響酶催化高效性的因素之間的區(qū)別。掌握別構酶的特點及核酶、同工酶、誘導酶等的概念。掌握水溶 性維生素的輔酶形式及其英文縮寫、生化功能；了解各種維生素相對應的缺乏癥及來源。難點：酶催化作用機理 、各因素對酶促反應速度的影響及酶促反應動力學的應用，別構酶的概念及特點。水溶 性維生素作為輔酶或輔基的結構特點。l1、酶是生物催化劑 l2、酶的化學本質（一）酶的定義： 酶是具有催化作用的蛋白質（或核酸）。 化學本質：蛋白質或核酸（二）酶與一般催化劑的共性及特性l1、共性：（1）不發(fā)生質、量的變化，但能 改變反應速度（2）不改變反應的平衡點，但能 縮短反應時。（3）可降低反應活化能（4）只能催化熱力學允許的反應2、個性（1）極高的催化效率（2）高度專一性（3）易失活（4）酶活性可調控（5）催化作用與結構有關l1、國際系統(tǒng)命名法及分類l1、單純蛋白酶與結合蛋白酶l2、輔助因子l3、維生素與輔酶蛋白質部分：酶蛋白蛋白質部分：酶蛋白 ( (apoenzyme)輔助因子輔助因子(cofactor) 金屬離子金屬離子小分子有機化合物小分子有機化合物全酶全酶(holoenzyme)(1)單純蛋白酶單純蛋白酶(2)結合蛋白酶結合蛋白酶定義：是維持機體正常生命活動不可缺少的一類小分子 有機化合物。分類：（1）水溶性維生素 B族維生素、Vc、硫辛酸 作用：通過轉變成輔酶對代謝起調節(jié)作用 不易貯存，應隨時攝入（2）脂溶性維生素： VA、VD、VE、VK 在體內可直接參與代謝的調節(jié)作用 涉入太多會引起中毒（1）硫胺素(維生素B1) 在體內以焦磷酸硫胺素(TPP)形式存在。（2）缺乏癥： 表現(xiàn)出多發(fā)性神經炎、皮膚麻木、心力衰竭、四肢無力、下肢水腫。（3）功能： 焦磷酸硫胺素是脫羧酶的輔酶，是催化酮酸的脫羧反應。（4）存在：植物體內、尤其是谷物的外皮中含量最高。NNNH2H3CCH2N+SCH3CH2CH2OPOOPOHOHOOHCl-（1 1）核黃素(維生素B2)在生物體內的活性形式： FAD(黃素-腺嘌呤二核苷酸) FMN(黃素單核苷酸)（2）缺乏癥：組織呼吸減弱，代謝強度降低。 主要癥狀為口腔發(fā)炎，舌炎、角膜炎、皮炎等。（3）功能：在脫氫酶催化的氧化-還原反應中，起著電子和質子的 傳遞體作用。（4）存在： 小麥、 表菜、 黃豆、 肝臟等。CH3CH3NCCNHNNOOCH2CHCHCHCH2OPOOHOHOHOOHOCH2OHOHNNNH2NNFMN FADCH3CH3NCCNHNNOOCH2CHCHCHCH2OPOOHOHOHOOHOCH2OHOHNNNH2NNFMN FADCH3CH3NCCNHNNOOCH2CHCHCHCH2OPOOHOHOHOOHOCH2OHOHNNNH2NNFMN FADCH3CH3NCCNHNNOOCH2CHCHCHCH2OPOOHOHOHOOHOCH2OHOHNNNH2NNFMN FAD FMN FAD（1）輔酶A是生物體內代謝反應中乙?；傅妮o酶，它的前體是維生素(B3)泛酸。（2）功能：是傳遞?；?，是形成代謝中間產物的重要輔酶。（3）分布：分布廣泛，腸內細菌也可以合成，所以一般不缺乏。CH2CCH3CH3CHOHCONHCH2CH2CNHCH2CH2SHOOOOHPOOHHONNNH2NNOPOOOHPOOOHCH2泛酸核糖|3|磷酸腺嘌呤（1）生物體內的活性形式： NAD+ ：煙酰胺-腺嘌呤二核苷酸，又稱為輔酶I NADP+：煙酰胺-腺嘌呤二核苷酸磷酸,又稱為輔酶II （2）功能：是多種重要脫氫酶的輔酶。（3）缺乏癥：能維持神經組織的健康。 缺乏時表現(xiàn)出神經營養(yǎng)障礙，出現(xiàn)皮炎。即癩皮病。（4）分布：肉類、谷物、花生及酵母含量豐富。 玉米缺乏色氨酸，長期食用玉米，可能出現(xiàn)缺乏癥。 （肝臟可將色氨酸轉變?yōu)闊燉０罚㎡CH2OPOPOCH2OHOHO OO-O-N+CONH2OOHOH(OPO3H2)NNNH2NN 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸） NAD+（P）NCOOHNCONH2NCOOHNCONH2 煙酸（尼克酸）煙酰胺|尼克酰胺（1）吡哆素(維生素B6，包括吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺)。（2）磷酸吡哆素主要包括磷酸吡哆醛（PLP） 磷酸吡哆胺（PMP）。（3）磷酸吡多素是轉氨酶的輔酶，轉氨酶通過磷酸吡多醛和磷酸 吡多胺的相互轉換，起轉移氨基的作用。（4）腸道細菌可以合成，一般不缺乏。長期酗酒和患結核病的 人應補充VB6。NH3CHOCHOCH2O P OHOOHNH3CHOCH2NH2CH2O P OHOOH磷酸吡哆醛 磷酸吡哆胺(1)生物素的功能是作為CO2的遞體，在生物合成中起傳遞和固定 CO2的作用(2)生物素是羧化酶的輔酶，它本身就是一種B族維生素B7。(3)缺乏癥：缺乏VB7，消瘦、皮炎、脫毛、神經過敏，一般不缺乏。HNNHCOCHH2CS(CH2)4COOH攜帶CO2蛋白結合（1）四氫葉酸（FH4、THF）是合成酶的輔酶，前體是維生素B11。（2）四氫葉酸的主要作用是作為一碳基團，如-CH3, -CH2-, -CHO 等的載體，參與多種生物合成過程。（3）葉酸缺乏會導致貧血。（4）分布：青菜、肝、酵母等。NNH2NOHNNHHCH2HHHNHCONHCHCOOHCH2CH2COOH（1）維生素B12又稱為鈷胺素。5-脫氧腺苷鈷氨素是VB12在生物體內的活性形式，維生素B12輔酶。（2）維生素B12輔酶的主要功能是作為變位酶的輔酶，催化底物分子內基團(主要為甲基)的變位反應。（3）肝、魚、肉等且腸道細菌 可以合成。（1）硫辛酸是少數(shù)不屬于維生素的輔酶。硫辛酸是6,8-二硫辛酸， 有兩種形式，即硫辛酸（氧化型）和二氫硫辛酸（還原型）.（2）硫辛酸是-酮戊二酸脫氫酶系的輔酶之一，起傳遞氫和轉 移?；淖饔?。（3）肝、酵母中含量多SCHSCHCH2CH2CH2CH2CH2COOH硫辛酸（氧化型）（1）稱為抗壞血酸，缺乏時易患壞血病；過量容易產生尿路結石。（2）VC的水溶液不穩(wěn)定，熱、堿、氧化劑均能使其破壞。（3）在體內參與氧化還原反應，羥化反應。人體不能合成。CCCCCCH2OHOHOHOHHOHOOCCOOOHHOHCH2OHCCC（1）稱為抗干眼病維生素（2）-胡蘿卜素（VA原）2VA。（3）維生素A分A1, A2兩種，是不飽和一元醇類。維生素A1又稱 為視黃醇，A2稱為脫氫視黃醇（4）肝、蛋黃、胡蘿卜、青菜、玉米中含量量較多。CH2OHCH2OHA1A2（1）抗佝僂病的維生素（2）維生素D是固醇類化合物，主要有D2（麥角鈣化醇）,D3（膽 鈣化醇）。它們由VD源麥角固醇和膽固醇分別轉化而來。 （3）在生物體內，D2和D3本身不具有生物活性。它們在肝臟和腎 臟中進行羥化后，形成1，25-二羥基維生素D。其中1，25-二 羥基維生素D3是生物活性最強的。（4）調節(jié)鈣磷的代謝， 使骨骼正常發(fā)育。（5）VA、VD不要同時食用。HOR（1）生育酚，目前發(fā)現(xiàn)的有6種，其中，四種有生理活性（2）VE缺乏，易出現(xiàn)心血管病變；VE抗衰老。（3）花生油、玉米油及豆類、蔬菜中含量高。且體內易貯存、代謝慢，不易缺乏。OHOR2R1R3（1）具有凝血的功能，因此又稱凝血維生素。（2）功能：促進肝臟合成凝血酶原，調節(jié)凝血因子，促進血液凝固。（3）VK1可從植物中分離到；VK2腸內細菌可以合成。OOOOCH2CHC(CH3)CH2CH25CHC(CH3)2l1、酶的活性部位和必需基團l2、酶原與酶原激活l3、多功能酶與多酶體系l活性部位(活性中心)：是指酶分子上結合底物并催化底物發(fā)生化學反應的有限三維空間。對于單成分酶，活性中心就是酶分子在三維結構上比較靠近的少數(shù)幾個氨基酸殘基或是這些殘基上的某些基團，它們在一級結構上可能相距很遠，位于不同的多肽鏈上，但通過肽鏈的盤繞、折疊而在空間構象上相到靠近，形成一個立體空間結構，叫。 對于雙成份酶來說，輔助因子也是酶活性中心的組成成分。 功能部位： 結合部位：專一性與底物結合 催化部位：決定酶的催化能力 活性中心的共同點： （1）、活性中心只是酶體積的一個小部分，并且具有三維結構 （2）、專一性取決于中心處原子的排列 （3）、活性部位是柔性的必需基團必需基團：酶分子中氨基酸殘基側鏈的酶分子中氨基酸殘基側鏈的化學基團中，一些與酶活性密切相化學基團中，一些與酶活性密切相關的化學基團關的化學基團。化學修飾法：指通過某些化學試劑與酶分子中某些側鏈 基團的共價 結合來確定這些基團與酶催化作用有關的一種方法。 1、利用特異性試劑對特殊基團的標記 2、差示標記法l酶原：細胞中合成的不具催化活性的酶前體形式，稱為。l酶原激活：將無活性的酶原轉變活性酶的過程稱為。l多功能酶：是指具有兩種以上催化活性的酶。l多酶體系：根據(jù)酶催化反應的需要，由催化一系列反應步驟的酶彼此以次級鍵 嵌合形成具有高度組織性的復合體，這一多酶復合體被稱為，又稱多酶蛋白。l1、過渡態(tài)和反應活化能l2、中間產物學說l3、酶作用專一性的機理l4、酶作用高效性的機理反應總能量改變反應總能量改變 非催化反應活化能非催化反應活化能 酶促反應酶促反應 活化能活化能 一般催化劑催一般催化劑催化反應的活化能化反應的活化能 能能量量 反反 應應 過過 程程 底物底物 產物產物 酶促反應活化能的改變酶促反應活化能的改變 lE + S ES P + E(1)、鎖鑰學說（模板學說） (2)、多位點親和理論(3)、誘導契合學說酶作用專一性學說：酶作用專一性學說：（1）結構專一性：酶對底物分子化學結構的特殊要求和選擇稱。 絕對專一性：一種酶只作用于一種物質 鍵專一性：一種酶只作用于一種鍵型 相對專一性 基團專一性：也稱族專一性，要求鍵型和基團同時符合 （2）立體異構專一性：化學結構+立體構型 光學專一性（旋光異構專一性） ：L-；D- 幾何異構專一性：順式；反式 (1). 鄰近效應鄰近效應與定向排列與定向排列（2）變形與扭曲效應）變形與扭曲效應（3）共價催化）共價催化（4）酸堿催）酸堿催（5）微環(huán)境的影響）微環(huán)境的影響l（一）專一性： 特異的催化芳香族氨基酸羧基端形成的肽鍵。l（二）活性中心的構成： Asp102His57Ser195l（三）屬性： 蛋白水解酶l（四）催化機理（相關過程） l1、底物濃度與酶促反應速度的影響l2、酶濃度對酶促反應速度的影響l3、pH對酶促反應速度的影響l4、溫度對酶促反應速度的影響l5、激活劑對酶促反應速度的影響l6、抑制劑對酶促反應速度的影響n在低底物濃度時在低底物濃度時, , 反應速度與底物濃反應速度與底物濃 度成正比，表現(xiàn)為一級反應特征。度成正比，表現(xiàn)為一級反應特征。n當?shù)孜餄舛冗_到一定值，幾乎所有的當?shù)孜餄舛冗_到一定值，幾乎所有的 酶都與底物結合后，反應速度達到酶都與底物結合后，反應速度達到 最大值（最大值（V Vmaxmax），此時再增加底物），此時再增加底物 濃度，反應速度不再增加，表現(xiàn)為濃度，反應速度不再增加，表現(xiàn)為 零級反應。零級反應。0246810 12 14 16 18 20020406080100C oncentration of S ubstrate(um ol/L)Rate of Reaction(v)V=Vmax SKm + SnK Km m 即為米氏常數(shù)，即為米氏常數(shù)，nV Vmaxmax為最大反應速度為最大反應速度KmS 2Km + S Vmax VmaxSKm值等于酶促反應速度為最大反應速度一半時值等于酶促反應速度為最大反應速度一半時的底物濃度，單位是的底物濃度，單位是mol/L。Km值值 Km等于酶促反應速度為最大反應速度一半時的底等于酶促反應速度為最大反應速度一半時的底物濃度。物濃度。 意義：意義：a) Km是酶的特征性常數(shù)之一；是酶的特征性常數(shù)之一；b) Km可近似表示酶對底物的親和力；可近似表示酶對底物的親和力；c) 同一酶對于不同底物有不同的同一酶對于不同底物有不同的Km值。值。d) Km是代謝物對多種代謝途徑選擇取向的決定因素之一是代謝物對多種代謝途徑選擇取向的決定因素之一e) Km也可反映酶對底物的專一性也可反映酶對底物的專一性 1、雙倒數(shù)做圖法：-4-202468100.00.20.40.60.81.01/S(1/mmol.L-1)1/v斜率斜率=Km/Vmax-1/Km1/Vmax2、其它做圖法； （1）Hanes法 （2）Woolf法 （3）Eadie法當當SE，酶可，酶可被底物飽和的情況下，被底物飽和的情況下，反應速度與酶濃度成反應速度與酶濃度成正比。正比。關系式為：關系式為：V = K3 E0 V E 當當SE時，時，Vmax = k3 E 酶濃度對反應速度的影響酶濃度對反應速度的影響 (1)、pH的影響表現(xiàn)在： a）酶蛋白 b）活性中心基團 c）底物分子(2)、在一定的pH 下, 酶具有 最大的催化活性,通常稱此 pH 為最適 pH。(1)、一方面是溫度升高,酶促 反應速度加快。(2)、另一方面,溫度升高,酶的 高級結構將發(fā)生變化或變 性，導致酶活性降低甚至 喪失。 (3)、因此大多數(shù)酶都有一個最 適溫度。 在最適溫度條件 下,酶促反應速度最大。102030405060708090020406080100Temperature OCRelative Activity (%)激活劑激活劑(activator)使酶由無活性變?yōu)橛谢钚曰蚴姑富钚栽黾拥奈镔|。使酶由無活性變?yōu)橛谢钚曰蚴姑富钚栽黾拥奈镔|。（1）激活劑間有拮抗作用（2）激活劑的作用不是固定不變的，濃度不同作用不同（3）同一種物質對一種酶可能是激活劑而對于另一種酶可能就是抑制劑 非專一性不可逆抑制 不可逆抑制作用 專一性不可逆抑制 抑制作用 競爭性抑制 可逆抑制作用 非競爭性抑制 反競爭性抑制定義： 凡是使酶活性下降，但不引起蛋白變性失活的物質稱該酶的。 抑制劑與酶反應中心的活性基團以共價形式結合引起酶的永久性失活。如有機磷毒劑二異丙基氟磷酸酯。 非專一性不可逆抑制作用： 定義：這類抑制劑可作用于酶分子上的不同基團或幾類 不同的酶。 例：烷化劑（碘乙酸）：氨基、巰基、咪唑基等 專一性不可逆抑制作用 定義：一種抑制劑只作用于一種酶分子中的一種基團。 例：有機磷殺蟲劑：乙酰膽堿酯酶 定義定義：抑制劑與酶蛋白以非共價方式結合，引起酶：抑制劑與酶蛋白以非共價方式結合，引起酶 活性暫時性喪失。抑制劑可以通過透析等方活性暫時性喪失。抑制劑可以通過透析等方 法被除去，并且能部分或全部恢復酶的活性。法被除去，并且能部分或全部恢復酶的活性。種類：種類：a）、競爭性可逆抑制）、競爭性可逆抑制b）、非競爭性可逆抑制）、非競爭性可逆抑制c）、反競爭性可逆抑制）、反競爭性可逆抑制特點：特點： a）抑制劑只能與）抑制劑只能與ES結合結合 b）動力學：）動力學：Vmax減?。粶p?。籏m值減小值減小競爭性可逆抑制：n某些抑制劑的化學結構與底物相似，因而能與底物竟爭某些抑制劑的化學結構與底物相似，因而能與底物竟爭與酶活性中心結合。與酶活性中心結合。n竟爭性抑制通?？梢酝ㄟ^增大底物濃度，即提高底物的竟爭性抑制通?？梢酝ㄟ^增大底物濃度，即提高底物的競爭能力來消除。競爭能力來消除。n動力學：動力學：VmaxVmax不變；不變；KmKm值增加值增加定義：定義： 酶可同時與底物及抑制劑結合，引起酶分子構酶可同時與底物及抑制劑結合，引起酶分子構象變化，并導至酶活性下降。由于這類物質并不是與象變化，并導至酶活性下降。由于這類物質并不是與底物競爭與活性中心的結合，所以稱為非競爭性抑制底物競爭與活性中心的結合，所以稱為非競爭性抑制劑。劑。動力學：動力學：VmaxVmax減小，減小，KmKm不變不變抑制劑只與酶底物復合物結合；抑制劑只與酶底物復合物結合；抑制程度取決與抑制劑的濃度及底物的濃度；抑制程度取決與抑制劑的濃度及底物的濃度；動力學特點：動力學特點：Vmax降低，表觀降低，表觀Km降低。降低。抑制劑抑制劑 1/V 1/S 無抑制劑無抑制劑 小結：各種可逆性抑制作用的比較小結：各種可逆性抑制作用的比較 動力學參數(shù)動力學參數(shù)表觀表觀Km Km增大增大不變不變減小減小最大速度最大速度Vmax不變不變降低降低降低降低林林-貝氏作圖貝氏作圖斜率斜率Km/Vmax增大增大增大增大不變不變縱軸截距縱軸截距1/Vmax不變不變增大增大增大增大橫軸截距橫軸截距-1/Km增大增大不變不變減小減小與與I結合的組分結合的組分EE、ESES作用特征作用特征無抑制劑無抑制劑競爭性抑制競爭性抑制非競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制反競爭性抑制l1、變構酶l2、同工酶l3、共價調節(jié)酶l4、抗體酶l5、固定化酶結構特點：結構特點： （1）活性中心：結合部位和催化部位）活性中心：結合部位和催化部位 （2）變構中心：特殊的調控部位）變構中心：特殊的調控部位 注意：注意：變構中心不是酶活性中心的組成部分。變構中心不是酶活性中心的組成部分。（1）變構酶：）變構酶：有的酶可以與某些化合物（稱為變構劑）發(fā)生非共價結合，引起有的酶可以與某些化合物（稱為變構劑）發(fā)生非共價結合，引起酶分子構象的改變，對酶起到激活或抑制的作用，這類酶通常稱為酶分子構象的改變，對酶起到激活或抑制的作用，這類酶通常稱為。（2）別構效應）別構效應別構酶通過與調節(jié)物非共價的結合，誘導或穩(wěn)定住酶分子的某種別構酶通過與調節(jié)物非共價的結合，誘導或穩(wěn)定住酶分子的某種構象來調節(jié)酶促反應速度及代謝過程的這種效應稱為構象來調節(jié)酶促反應速度及代謝過程的這種效應稱為。（3）變構調節(jié)作用）變構調節(jié)作用由于變構劑與變構中心的結合而引起酶活性改變的現(xiàn)象則稱由于變構劑與變構中心的結合而引起酶活性改變的現(xiàn)象則稱為為。動力學：動力學： 其其SSV V的動力學曲線呈的動力學曲線呈“S”S”型。型。假說：假說： （1 1）序變模型）序變模型 （2 2）齊變模型）齊變模型定義定義：同工酶同工酶(isoenzyme)是指催化相同的是指催化相同的化學反應，而酶蛋白的分子結構理化性化學反應，而酶蛋白的分子結構理化性質乃至免疫學性質不同的一組酶。質乃至免疫學性質不同的一組酶。乳酸脫氫酶的同工酶乳酸脫氫酶的同工酶l3、共價調節(jié)酶：l4、抗體酶：具有催化功能的抗體分子稱為抗具有催化功能的抗體分子稱為抗體酶體酶(abzyme) 。l5、固定化酶：將水溶性酶經物理或化學方將水溶性酶經物理或化學方法處理后，成為不溶于水但仍具有酶活性的一種酶法處理后，成為不溶于水但仍具有酶活性的一種酶的衍生物。的衍生物。 固定化酶在催化反應中以固相狀態(tài)作固定化酶在催化反應中以固相狀態(tài)作用于底物，并保持酶的活性。用于底物，并保持酶的活性。l1、酶分離純化的一般原則l2、酶活力測定酶活力單位