2019年高考一輪復(fù)習(xí) 基因工程教材版本全國(guó)通用課時(shí)說(shuō)明2課時(shí)知識(shí)點(diǎn)基因工程的原理和技術(shù)，基因工程的應(yīng)用和發(fā)展復(fù)習(xí)目標(biāo)1. 基因工程的誕生2. 基因工程的原理及技術(shù)（含PCR技術(shù)）3.基因工程的應(yīng)用4. 蛋白質(zhì)工程5. DNA的粗提取與鑒定復(fù)習(xí)重點(diǎn)1. DNA重組技術(shù)所需的三種基本工具的作用。2. 基因工程基本操作程序的四個(gè)步驟。3.基因工程在農(nóng)業(yè)和醫(yī)療等方面的應(yīng)用。4. 蛋白質(zhì)工程的原理。復(fù)習(xí)難點(diǎn)1. 基因工程載體需要具備的條件。2. 從基因文庫(kù)中獲取目的基因。3.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。4. 基因治療。5. 蛋白質(zhì)工程的原理。一、自我診斷 知己知彼1.下圖表示通過(guò)cDNA過(guò)程獲得目的基因并利用PCR擴(kuò)增過(guò)程的示意圖。據(jù)圖分析，下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是()A. 催化過(guò)程的酶是RNA聚合酶B. 過(guò)程不需要DNA解旋酶C. 過(guò)程需要兩個(gè)相同的引物D. 催化過(guò)程的酶都是DNA聚合酶，均須耐高溫2.將經(jīng)過(guò)擴(kuò)增的DNA和質(zhì)粒用相同的限制酶進(jìn)行如右圖所示的切割，電泳得到純凈的B片段和D片段，將兩種片段置于適宜的緩沖液中用DNA連接酶處理。如果只考慮兩個(gè)片段的環(huán)狀連接，則能形成不同核苷酸序列的環(huán)狀DNA的種類是()A. 6種 B. 3種 C. 2種 D. 1種3.我國(guó)科學(xué)家屠呦呦因青蒿素的研究榮獲2019年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。青蒿素是目前世界上最有效的治療瘧疾藥物，為青蒿植株的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其化學(xué)本質(zhì)一種萜類化合物，其生物合成途徑如圖1所示。正常青蒿植株的青蒿素產(chǎn)量很低，難以滿足臨床需求，科學(xué)家為了提高青蒿素產(chǎn)量，將棉花中的FPP合成酶基因?qū)肓饲噍镏仓瓴⒆屍涑晒Ρ磉_(dá)，獲得了高產(chǎn)青蒿植株，過(guò)程如圖2所示。圖1圖2(1) 研究人員從棉花基因文庫(kù)中獲取FPP合成酶基因后，可以采用_技術(shù)對(duì)該目的基因進(jìn)行大量擴(kuò)增，該技術(shù)除了需要提供模板和游離的脫氧核苷酸外，還需要提供_、_等條件。(2) 圖2中的為_(kāi)，形成過(guò)程中需要_等酶；棉花FPP合成酶基因能夠和質(zhì)粒連接成的主要原因是_。(3) 若不能在含有抗生素Kan的培養(yǎng)基上生存，則原因是_。(4) 由題意可知，除了通過(guò)提高FPP的含量來(lái)提高青蒿素的產(chǎn)量外，還可以通過(guò)哪些途徑來(lái)提高青蒿素的產(chǎn)量？(試舉一例)_。4.p53基因是人體內(nèi)一種抑癌基因。該基因編碼的p53蛋白可對(duì)癌變前的DNA損傷進(jìn)行修復(fù)，使其恢復(fù)正常，或誘導(dǎo)其進(jìn)入休眠狀態(tài)或細(xì)胞凋亡，阻止細(xì)胞癌變。“今又生”是我國(guó)首創(chuàng)的基因治療藥物之一，是世界首個(gè)獲準(zhǔn)上市的基因治療藥物，其核心成分是利用腺病毒和人p53基因拼裝得到的重組病毒?！敖裼稚彼幬镏械南俨《窘?jīng)基因工程改造后，在宿主細(xì)胞內(nèi)不能復(fù)制，不能整合到染色體上。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：(1) 將p53基因與腺病毒拼裝成重組病毒，需要用到的工具酶有_。常用的基因工程載體除動(dòng)植物病毒外，還有_。(2) 限制酶能將特定序列的核苷酸之間的_鍵切開(kāi)，形成_末端。(3) 在“今又生”的生產(chǎn)中，科學(xué)家選擇性地放棄了一般載體都應(yīng)該具有的_，以獲得更高的安全性能。p53基因應(yīng)插入載體的_之間，以便于基因的表達(dá)。(4) p53基因的大量擴(kuò)增可以采用PCR技術(shù)，該技術(shù)中需使用的一種特殊的酶是_。下圖是需要擴(kuò)增的p53基因在DNA中的位置示意圖，擴(kuò)增過(guò)程需要_種引物。n次循環(huán)之后，只含目的基因的片段占所有擴(kuò)增產(chǎn)物的比例為_(kāi)。5.白僵菌可感染農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，常作為防治害蟲(chóng)的菌劑。由于白僵菌對(duì)除草劑草丁膦敏感且殺死害蟲(chóng)的能力較弱，科研人員對(duì)其進(jìn)行基因工程改造，流程如下圖所示，請(qǐng)回答有關(guān)問(wèn)題：(1) 蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的毒蛋白，能有效殺死害蟲(chóng)。已知該基因的全部序列，科研人員可通過(guò)_法和PCR技術(shù)獲得大量毒蛋白基因片段。據(jù)圖分析，將毒蛋白基因和質(zhì)粒連接獲得重組質(zhì)粒1的過(guò)程需要用到的工具酶是_。(2) 重組質(zhì)粒1和Bar基因(草丁膦抗性基因)各自用Xba酶處理，得到酶切片段。重組質(zhì)粒1的酶切片段再用去磷酸化酶處理，使末端游離的磷酸基團(tuán)脫離，目的是防止_。將未用去磷酸化酶處理的Bar基因與重組質(zhì)粒1連接，獲得重組質(zhì)粒2。獲得的重組質(zhì)粒2是下圖中的_。(3) 將重組質(zhì)粒2與感受態(tài)的白僵菌菌液混合進(jìn)行轉(zhuǎn)化，重組質(zhì)粒2在白僵菌細(xì)胞內(nèi)被修復(fù)。一段時(shí)間后用含有_的平板培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，獲得含有Bar基因的重組白僵菌。(4) 提取上述重組白僵菌全部mRNA，加入_酶，獲得cDNA，再加入毒蛋白基因引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，根據(jù)是否有相應(yīng)產(chǎn)物生成判斷毒蛋白基因在白僵菌體內(nèi)是否完成_。(5) 科研人員將重組白僵菌噴涂于植物葉片上，以此飼喂饑餓處理的害蟲(chóng)，記錄單位時(shí)間內(nèi)的_，以判斷重組白僵菌的殺蟲(chóng)效果。【答案】1.ACD 2.A 3.(1) PCR引物熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(2) 基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)限制酶和DNA連接酶切割后具有相同的黏性末端(3) 重組質(zhì)粒沒(méi)有導(dǎo)入農(nóng)桿菌(4) 抑制SQS基因的表達(dá)(或增強(qiáng)ADS基因的表達(dá))4.(1) 限制酶和DNA連接酶質(zhì)粒和噬菌體衍生物等 (2) 磷酸二酯黏性末端或平(3) 復(fù)制原點(diǎn)啟動(dòng)子和終止子(4) Taq酶2(2n2n)/2n5.(1) 人工合成(或“化學(xué)合成”)Nco、BamH和DNA連接酶(限制酶和DNA連接酶)(2) 重組質(zhì)粒1酶切片段自身連接(或“相互連接”)C(3) 草丁膦(4) 逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄(5) 死亡害蟲(chóng)數(shù)二、溫故知新 夯實(shí)基礎(chǔ)知識(shí)點(diǎn)1基因工程的工具與操作程序1.分析基因工程的概念(1)供體：提供目的基因。(2)操作環(huán)境：體外。(3)操作水平：分子水平。(4)原理：基因重組。(5)受體：表達(dá)目的基因。(6)本質(zhì)：性狀在受體體內(nèi)表達(dá)。(7)優(yōu)點(diǎn)：克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，定向改造生物的遺傳性狀。2.巧辨基因工程操作工具(1)限制酶是一類酶，而不是一種酶。(2)限制酶的成分為蛋白質(zhì)，其作用的發(fā)揮需要適宜的理化條件，高溫、強(qiáng)酸或強(qiáng)堿均易使之變性失活。(3)在切割目的基因和載體時(shí)要求用同一種限制酶，目的是產(chǎn)生相同的黏性末端。(4)將一個(gè)基因從DNA分子上切割下來(lái)，需要切兩處，同時(shí)產(chǎn)生4個(gè)黏性末端。(5)不同DNA分子用同一種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端都相同，同一個(gè)DNA分子用不同的限制酶切割，產(chǎn)生的黏性末端一般不相同。(6)限制酶切割位點(diǎn)應(yīng)位于標(biāo)記基因之外，不能破壞標(biāo)記基因，以便于進(jìn)行檢測(cè)。(7)基因工程中的載體與細(xì)胞膜上物質(zhì)運(yùn)輸?shù)妮d體不同?；蚬こ讨械妮d體是DNA分子，能將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞內(nèi)；膜載體是蛋白質(zhì)，與細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。(8)基因工程中有3種工具，但工具酶只有2種。3.比較與DNA有關(guān)的酶(1)五種相關(guān)酶的比較作用底物作用部位形成產(chǎn)物限制酶DNA分子磷酸二酯鍵黏性末端或平末端DNA連接酶DNA片段磷酸二酯鍵重組DNA分子DNA聚合酶脫氧核苷酸磷酸二酯鍵子代DNADNA解旋酶DNA分子堿基對(duì)間的氫鍵形成脫氧核苷酸單鏈DNA(水解)酶DNA分子磷酸二酯鍵游離的脫氧核苷酸(2)限制酶和DNA連接酶之間的關(guān)系圖示4.對(duì)載體的分析條件目的穩(wěn)定并能復(fù)制目的基因穩(wěn)定存在且數(shù)量可擴(kuò)大有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)可攜帶多個(gè)或多種外源基因具有特殊的標(biāo)記基因便于重組DNA的鑒定和選擇5.觀察基因工程的操作過(guò)程，分析每一步驟的操作程序（1）獲取目的基因 從基因文庫(kù)中獲?。杭从孟拗泼高M(jìn)行切割、分離（a）直接分離 從cDNA文庫(kù)中獲取：即利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成 利用PCR擴(kuò)增技術(shù)：獲取大量目的基因（b）人工化學(xué)合成：適用于分子較小的基因。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的核心(a)目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。(b) 基因表達(dá)載體組成 目的基因 啟動(dòng)子：為RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄mRNA 終止子：使轉(zhuǎn)錄終止的一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段 標(biāo)記基因：為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因(c)構(gòu)建過(guò)程（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞生物種類植物動(dòng)物微生物常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射技術(shù)感受態(tài)細(xì)胞法受體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T­DNA上農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞整合到受體細(xì)胞的DNA上表達(dá)將含有目的基因的表達(dá)載體提純?nèi)÷?受精卵)顯微注射受精卵發(fā)育獲得具有新性狀的動(dòng)物Ca2處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞重組表達(dá)載體DNA分子與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定【提醒】(1)目的基因的插入位點(diǎn)不是隨意的基因表達(dá)需要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入到啟動(dòng)子與終止子之間的部位。(2)基因工程操作過(guò)程中只有第三步(將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞)沒(méi)有堿基互補(bǔ)配對(duì)現(xiàn)象第一步存在逆轉(zhuǎn)錄法獲得DNA，第二步存在黏性末端連接現(xiàn)象，第四步檢測(cè)存在分子水平雜交方法。(3)原核生物作為受體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少。(4)一般情況下，用同一種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的片段，但有時(shí)可用兩種限制酶分別切割質(zhì)粒和目的基因，這樣可避免質(zhì)粒和質(zhì)粒之間、目的基因和目的基因之間的連接。(5)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的實(shí)質(zhì)是目的基因整合到受體細(xì)胞染色體基因組中。(6)不熟悉標(biāo)記基因的種類和作用：標(biāo)記基因的作用篩選、檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞，常見(jiàn)的有抗生素抗性基因、發(fā)光基因(表達(dá)產(chǎn)物為帶顏色的物質(zhì))等。(7)對(duì)受體細(xì)胞模糊不清：受體細(xì)胞常用植物受精卵或體細(xì)胞(經(jīng)組織培養(yǎng))、動(dòng)物受精卵(一般不用體細(xì)胞)、微生物(大腸桿菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰島素則必須用真核生物酵母菌(需內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的加工、分泌)；一般不用支原體，原因是它營(yíng)寄生生活；一定不能用哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞，原因是它無(wú)細(xì)胞核，不能合成蛋白質(zhì)。(8)還應(yīng)注意的問(wèn)題有：基因表達(dá)載體中，啟動(dòng)子(DNA片段)起始密碼子(RNA)；終止子(DNA片段)終止密碼子(RNA)?；虮磉_(dá)載體的構(gòu)建是最核心、最關(guān)鍵的一步，在體外進(jìn)行。知識(shí)點(diǎn)2基因工程的應(yīng)用與蛋白質(zhì)工程1.有關(guān)基因工程應(yīng)用的易錯(cuò)點(diǎn)動(dòng)物基因工程主要是為了改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)，而不是為了產(chǎn)生體型巨大的個(gè)體。DNA分子作探針進(jìn)行檢測(cè)時(shí)應(yīng)檢測(cè)單鏈，即將待測(cè)雙鏈DNA分子打開(kāi)。Bt毒蛋白基因控制合成的Bt毒蛋白并無(wú)毒性，進(jìn)入昆蟲(chóng)消化道被分解成多肽后產(chǎn)生毒性。青霉素是青霉菌產(chǎn)生的，不是通過(guò)基因工程產(chǎn)生的。并非所有個(gè)體都可作為乳腺生物反應(yīng)器。操作成功的應(yīng)該是雌性個(gè)體，個(gè)體本身的繁殖速度較高，泌乳量、蛋白含量等都是應(yīng)該考慮的因素?；蛑委熀螅毕莼驔](méi)有改變?；蛑委熓前颜；?qū)胧荏w細(xì)胞中，以表達(dá)正常產(chǎn)物從而治療疾病，對(duì)原來(lái)細(xì)胞中存在缺陷的基因沒(méi)有清除或改變。2.蛋白質(zhì)工程(1)概念理解基礎(chǔ)：蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系。操作：基因修飾或基因合成。結(jié)果：改造了現(xiàn)有蛋白質(zhì)或制造出新的蛋白質(zhì)。目的：滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。(2)操作過(guò)程：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列(基因)基因表達(dá)產(chǎn)生需要的蛋白質(zhì)?！咎嵝选?1)對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行改造，其本質(zhì)是改變其基因組成。如果對(duì)蛋白質(zhì)直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白質(zhì)分子還是無(wú)法遺傳。(2)蛋白質(zhì)工程的實(shí)質(zhì)是根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，創(chuàng)造新基因或者改造老基因，是基因工程的發(fā)展與延續(xù)。(3)蛋白質(zhì)工程與DNA分子重組技術(shù)是分不開(kāi)的，常用到基因工程工具酶，如限制酶和DNA連接酶。3.乳腺生物反應(yīng)器與工程菌生產(chǎn)藥物的比較比較項(xiàng)目乳腺生物反應(yīng)器工程菌基因結(jié)構(gòu)動(dòng)物基因的結(jié)構(gòu)與人類基因的結(jié)構(gòu)基本相同細(xì)菌或酵母菌等生物基因的結(jié)構(gòu)與人類基因的結(jié)構(gòu)有較大差異基因表達(dá)合成的藥物蛋白與天然蛋白質(zhì)相同細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等，產(chǎn)生的藥物蛋白可能沒(méi)有活性受體細(xì)胞哺乳動(dòng)物的受精卵微生物細(xì)胞生產(chǎn)條件不需嚴(yán)格滅菌，溫度等條件對(duì)其影響不大需嚴(yán)格滅菌，需嚴(yán)格控制工程菌所需的外界條件藥物提取從動(dòng)物乳汁中提取從微生物細(xì)胞中提取4.基因治療與基因診斷原理操作過(guò)程進(jìn)展基因治療基因表達(dá)把正常基因?qū)胗谢蛉毕莸募?xì)胞中，以表達(dá)出正常性狀來(lái)治療臨床實(shí)驗(yàn)基因診斷堿基互補(bǔ)配對(duì)制作特定DNA探針與病人樣品DNA混合，分析雜交帶情況臨床應(yīng)用5.基因工程與蛋白質(zhì)工程的比較項(xiàng)目蛋白質(zhì)工程基因工程區(qū)別過(guò)程預(yù)期蛋白質(zhì)的功能設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列推測(cè)相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列合成DNA表達(dá)出蛋白質(zhì)獲取目的基因構(gòu)建基因表達(dá)載體將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定實(shí)質(zhì)定向改造或生產(chǎn)人類所需蛋白質(zhì)定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型或生物產(chǎn)品結(jié)果生產(chǎn)自然界中沒(méi)有的蛋白質(zhì)一般是生產(chǎn)自然界中已有的蛋白質(zhì)聯(lián)系蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上延伸出來(lái)的第二代基因工程，因?yàn)閷?duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)的改造或制造新的蛋白質(zhì)，都必須通過(guò)基因修飾或基因合成實(shí)現(xiàn)三、典例剖析 思維拓展考點(diǎn)一 基因工程的工具與操作程序例1為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C（圖1），擬將其與質(zhì)粒（圖2）重組，再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入菊花中。下列操作與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟环氖牵?）A用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒B用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰?xì)胞C在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞D用分子雜交方法檢測(cè)C基因是否整合到菊花染色體上【答案】C【解析】用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI處理目的基因和質(zhì)粒，可以使目的基因兩側(cè)和質(zhì)粒產(chǎn)生相同的黏性末端，再用連接酶把切口連起來(lái)就構(gòu)建成重組質(zhì)粒，A正確；農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法適用于雙子葉植物或裸子植物，菊花屬于雙子葉植物，故可用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰?xì)胞，B正確；質(zhì)粒中含有潮霉素抗性基因，被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞只對(duì)潮霉素具有抗性，在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，不能篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞，C錯(cuò)誤；檢測(cè)目的基因是否整合到受體細(xì)胞的染色體上，可采用DNA分子雜交技術(shù)，D正確。【易錯(cuò)點(diǎn)】基因工程操作流程。【方法點(diǎn)撥】本題考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，掌握基因工程操作流程及各個(gè)操作依據(jù)的原理是正確解答該題的關(guān)鍵。例2在應(yīng)用農(nóng)桿菌侵染植物葉片獲得轉(zhuǎn)基因植株的常規(guī)實(shí)驗(yàn)步驟中，不需要的是（ ）A.用攜帶目的基因的農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞B.用選擇培養(yǎng)基篩法導(dǎo)入目的基因的細(xì)胞C.用聚乙二醇誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的原生物質(zhì)融合D.用適當(dāng)比例的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)愈傷組織生芽【答案】C【解析】農(nóng)桿菌侵染細(xì)菌是基因工程中常常用到的把目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法，A正確；目的基因是否導(dǎo)入了細(xì)胞，需要在選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，B正確；在植物細(xì)胞組織培養(yǎng)的過(guò)程中，需要調(diào)整培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的比例，來(lái)達(dá)到對(duì)其脫分化和再分化的控制，D正確；在農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞的過(guò)程中并沒(méi)有涉及到原生質(zhì)體的融合，所以C錯(cuò)誤。【易錯(cuò)點(diǎn)】基因工程操作程序和植物細(xì)胞工程【方法點(diǎn)撥】解決本題必須明確土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法培育轉(zhuǎn)基因植株的程序有：獲取目的基因 目的基因與Ti質(zhì)粒結(jié)合形成重組質(zhì)粒 將重組質(zhì)粒導(dǎo)入土壤農(nóng)桿菌 用土壤農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞 檢測(cè)是否導(dǎo)入目的基因并鑒定是否成功表達(dá) 通過(guò)植物組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng) 獲得轉(zhuǎn)基因植株。例3真核生物基因中通常有內(nèi)含子，而原核生物基因中沒(méi)有，原核生物沒(méi)有真核生物所具有的切除內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的RNA序列的機(jī)制。已知在人體中基因A（有內(nèi)含子）可以表達(dá)出某種特定蛋白（簡(jiǎn)稱蛋白A）。回答下列問(wèn)題：（1）某同學(xué)從人的基因組文庫(kù)中獲得了基因A，以大腸桿菌作為受體細(xì)胞卻未得到蛋白A，其原因是_。（2）若用家蠶作為表達(dá)基因A的受體，在噬菌體和昆蟲(chóng)病毒兩種載體中，不選用_作為載體，其原因是_。（3）若要高效地獲得蛋白A，可選用大腸桿菌作為受體。因?yàn)榕c家蠶相比，大腸桿菌具有_（答出兩點(diǎn)即可）等優(yōu)點(diǎn)。（4）若要檢測(cè)基因A是否翻譯出蛋白A，可用的檢測(cè)物質(zhì)是_（填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗體”）。（5）艾弗里等人的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)為證明DNA是遺傳物質(zhì)做出了重要貢獻(xiàn)，也可以說(shuō)是基因工程的先導(dǎo)，如果說(shuō)他們的工作為基因工程理論的建立提供了啟示，那么，這一啟示是_?！敬鸢浮浚?）基因A有內(nèi)含子，在大腸桿菌中，其初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中與內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的RNA序列不能被切除，無(wú)法表達(dá)出蛋白A （2）噬菌體 噬菌體的宿主是細(xì)菌，而不是家蠶 （3）繁殖快、容易培養(yǎng) （4）蛋白A的抗體 （5）DNA可以從一種生物個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體【解析】（1）基因A的編碼區(qū)中有內(nèi)含子，在真核生物細(xì)胞內(nèi)把內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄來(lái)的RNA切除，而原核生物細(xì)胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄后不切除，轉(zhuǎn)錄后直接表達(dá)，所以翻譯形成的蛋白質(zhì)不是蛋白A。（2）由于噬菌體是專性寄生在細(xì)菌體內(nèi)的病毒，無(wú)法侵染到真核生物家蠶細(xì)胞內(nèi)，所以不能用噬菌體作為運(yùn)載體。而家蠶屬于昆蟲(chóng)，故可用昆蟲(chóng)病毒作為運(yùn)載體。（3）大腸桿菌作為受體菌具有繁殖周期短、易培養(yǎng)。（4）檢測(cè)目的基因是否表達(dá)通常用抗原抗體雜交技術(shù)。（5）艾弗里等人的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)為證明DNA是遺傳物質(zhì)做出了重要貢獻(xiàn)，證明了生物的遺傳物質(zhì)是DNA，還為基因工程理論的建立提供了啟示，這一啟示是DNA可以從一種生物轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體?！疽族e(cuò)點(diǎn)】基因結(jié)構(gòu)、原核生物與真核生物基因轉(zhuǎn)錄的不同、目的基因的檢測(cè)等知識(shí)?！痉椒c(diǎn)撥】本題考查基因結(jié)構(gòu)、原核生物與真核生物基因轉(zhuǎn)錄的不同、目的基因的檢測(cè)等知識(shí)，要求考生能正確分析原核生物與真核生物基因轉(zhuǎn)錄的不同，掌握基因的結(jié)構(gòu)、目的基因的檢測(cè)方法?？键c(diǎn)二 基因工程的應(yīng)用與蛋白質(zhì)工程例1某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因）。有人將此質(zhì)粒載體用BamHI酶切后，與用BamHI酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉?wèn)題：（1）質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應(yīng)具備的基本條件有_（答出兩點(diǎn)即可）。而作為基因表達(dá)載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動(dòng)子和終止子。（2）如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含有環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的，其原因是_；并且_和_的細(xì)胞也是不能區(qū)分的，其原因是_。在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的單菌落，還需使用含有是_的固體培養(yǎng)基。（3）基因工程中，某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為載體，其DNA復(fù)制所需的原料來(lái)自于_【答案】（1）能夠自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因、具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)（答出兩點(diǎn)即可）（2）二者均不含氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上都不能生長(zhǎng) 含有質(zhì)粒載體 含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒（或答含有重組質(zhì)粒） 二者都含氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng) 四環(huán)素 （3）受體細(xì)胞【解析】（1）質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應(yīng)具備的基本條件有：能自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因、具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)等。（2）由于未被轉(zhuǎn)化的和僅含有環(huán)狀目的基因的大腸桿菌中不含有氨芐青霉素抗性基因，因此如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，未被轉(zhuǎn)化的和僅含有環(huán)狀目的基因的大腸桿菌均不能存活，因此兩者是不能區(qū)分的；含有質(zhì)粒的大腸桿菌和 含重組質(zhì)粒的大腸桿菌的細(xì)胞由于均含有氨芐青霉素抗性基因，在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上都能生長(zhǎng)，因此兩者也是不能區(qū)分的在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的單菌落，還需使用含有四環(huán)素的固體培養(yǎng)基，即含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌在其中不能生長(zhǎng)，而含有普通質(zhì)粒的大腸桿菌能生長(zhǎng)。（3）噬菌體是專門(mén)寄生在細(xì)菌細(xì)胞中的病毒，在侵染細(xì)菌時(shí)，噬菌體的DNA進(jìn)入到細(xì)菌細(xì)胞只能夠，而蛋白質(zhì)外殼仍留在細(xì)胞外，在噬菌體的DNA指導(dǎo)下，利用細(xì)菌細(xì)胞中的物質(zhì)來(lái)合成噬菌體的組成成分，據(jù)此可推知：基因工程中，某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為載體，其DNA復(fù)制所需的模板來(lái)自于噬菌體，原料來(lái)自于受體細(xì)胞?！疽族e(cuò)點(diǎn)】基因工程?！痉椒c(diǎn)撥】本題以圖文結(jié)合的形式，綜合考查學(xué)生對(duì)基因工程技術(shù)的熟記和理解能力。解決此類問(wèn)題的關(guān)鍵是，熟記并理解相關(guān)的基礎(chǔ)知識(shí)、形成知識(shí)網(wǎng)絡(luò)，從題圖中挖掘出隱含的信息，據(jù)此結(jié)合每個(gè)問(wèn)題情境進(jìn)行圖文轉(zhuǎn)換、實(shí)現(xiàn)對(duì)知識(shí)的整合和遷移。例2幾丁質(zhì)是許多真菌細(xì)胞壁的重要成分，幾丁質(zhì)酶可催化幾丁質(zhì)水解。通過(guò)基因工程將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，可增強(qiáng)其抗真菌病的能力?；卮鹣铝袉?wèn)題：（1）在進(jìn)行基因工程操作時(shí)，若要從植物體中提取幾丁質(zhì)酶的mRNA，常選用嫩葉而不選用老葉作為實(shí)驗(yàn)材料，原因是_。提取RNA時(shí)，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是_。（2）以mRNA為材料可以獲得cDNA，其原理是_。（3）若要使目的基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，需要通過(guò)質(zhì)粒載體而不能直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，原因是_（答出兩點(diǎn)即可）。（4）當(dāng)幾丁質(zhì)酶基因和質(zhì)粒載體連接時(shí)，DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是_。（5）若獲得的轉(zhuǎn)基因植株（幾丁質(zhì)酶基因已經(jīng)整合到植物的基因組中）抗真菌病的能力沒(méi)有提高，根據(jù)中心法則分析，其可能的原因是_?！敬鸢浮浚?）嫩葉組織細(xì)胞易破碎防止RNA降解（2）在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則可以合成cDNA（3）目的基因無(wú)復(fù)制原點(diǎn)；目的基因無(wú)表達(dá)所需啟動(dòng)子（4）磷酸二酯鍵（5）目的基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯異?！窘馕觥浚?）在進(jìn)行基因工程操作時(shí)，若要從植物體中提取幾丁質(zhì)酶的mRNA，常選用嫩葉而不選用老葉作為實(shí)驗(yàn)材料，原因是嫩葉組織細(xì)胞易破碎。提取RNA時(shí)，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是防止RNA降解。（2）以mRNA為材料可以獲得cDNA，其原理是在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則可以合成cDNA。（3）若要使目的基因在受體細(xì)胞中表達(dá)，需要通過(guò)質(zhì)粒載體而不能直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，原因是目的基因無(wú)復(fù)制原點(diǎn)、目的基因無(wú)表達(dá)所需啟動(dòng)子。（4）當(dāng)幾丁質(zhì)酶基因和質(zhì)粒載體連接時(shí)，DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是磷酸二酯鍵。（5）若獲得的轉(zhuǎn)基因植株（幾丁質(zhì)酶基因已經(jīng)整合到植物的基因組中）抗真菌病的能力沒(méi)有提高，根據(jù)中心法則分析，其可能的原因是目的基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯異常。【易錯(cuò)點(diǎn)】基因工程?！痉椒c(diǎn)撥】本題主要考查了基因工程等有關(guān)知識(shí)，旨在考查學(xué)生對(duì)基因工程操作步驟及細(xì)節(jié)的深層理解，綜合性強(qiáng)，有一定的難度。易錯(cuò)點(diǎn)為第一問(wèn)，衰老葉片基因表達(dá)水平低，葉片不易研磨破碎，組織細(xì)胞不能充分裂解，RNA提取不充分，而且老葉富含多酚物質(zhì)，當(dāng)其氧化后，會(huì)使得RNA沉淀變成褐色，干擾了后續(xù)實(shí)驗(yàn)。第二問(wèn)填寫(xiě)反轉(zhuǎn)錄的原理注意三點(diǎn)：酶、模板、堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則。第三問(wèn)考查不能直接將目的基因直接導(dǎo)入受體細(xì)胞的原因（目的基因無(wú)復(fù)制原點(diǎn)、目的基因無(wú)表達(dá)所需啟動(dòng)子），學(xué)生需要注意對(duì)教材知識(shí)的深入理解，教師注意深挖教材。例3（9分）下表是幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)，其中切割位點(diǎn)相同的酶不重復(fù)標(biāo)注。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：限制酶BamHBclSau3AHind識(shí)別序列及切割位點(diǎn)（1）用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用_兩種限制酶切割，酶切后的載體和目的基因片段，通過(guò)_酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了擴(kuò)增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入處于_態(tài)的大腸桿菌。（2）為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加_，平板上長(zhǎng)出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖2中_。（3）若BamH I酶切的DNA末端與Bcl I酶切的DNA末端連接，連接部位的6個(gè)堿基對(duì)序列為，對(duì)于該部位，這兩種酶（填“都能”、“都不能”或“只有一種能”）切開(kāi)。（4）若用Sau3A I切圖1質(zhì)粒最多可能獲得種大小不同的DNA片段?！敬鸢浮浚?）BclI和Hind 連接 感受 （2）四環(huán)素 引物甲和引物丙（3） 都不能 （4）7【解析】（1）選擇的限制酶應(yīng)在目的基因兩端存在識(shí)別位點(diǎn)，但BamH I可能使質(zhì)粒中啟動(dòng)子丟失，因此只能選BclI和Hind。酶切后的載體和目的基因片段，通過(guò)DNA連接酶酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了擴(kuò)增重組質(zhì)粒，需將其轉(zhuǎn)入處于感受態(tài)的大腸桿菌。（2）為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，根據(jù)質(zhì)粒上的抗性基因，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素PCR技術(shù)要求兩種引物分別和目的基因的兩條單鏈結(jié)合，沿相反的方向合成子鏈，故所用的引物組成為圖2中引物甲和引物丙。（3）根據(jù)BamH和BclI的酶切位點(diǎn)，若BamHI酶切的DNA末端與BclI酶切的DNA末端連接，則連接部位的6個(gè)堿基對(duì)序列為，對(duì)于該部位，由于與兩種酶的酶切位點(diǎn)均不同，故這兩種酶都不能切開(kāi)。（4）根據(jù)BamH、BclI和Sau3A I的酶切位點(diǎn)，Sau3A I在質(zhì)粒上有三個(gè)酶切位點(diǎn)，完全酶切可得到記為A、B、C三種片段，若部分位點(diǎn)被切開(kāi)，可得到AB、AC、BC、ABC四種片段，所以用Sau3A I切圖1質(zhì)粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段。【易錯(cuò)點(diǎn)】基因工程，限制酶，連接酶，重組質(zhì)?！痉椒c(diǎn)撥】此題是對(duì)基因工程的考查，解答本題的關(guān)鍵在于理解重組質(zhì)粒中標(biāo)記基因的作用，在插入目的基因時(shí)不能破壞標(biāo)記基因，故選擇限制酶須注意；PCR擴(kuò)增基因時(shí)，兩種引物結(jié)合的部位相反，延伸的方向相反；限制酶具有特異性，不同的限制酶識(shí)別不同的序列，判斷某種限制酶能否切割某片段，應(yīng)根據(jù)該片段中是否含有限制酶的識(shí)別序列。四、舉一反三 成果鞏固 考點(diǎn)一 基因工程的工具與操作程序1.下列有關(guān)人胰島素基因表達(dá)載體的敘述，正確的是（）A表達(dá)載體中的胰島素基因可通過(guò)人肝細(xì)胞mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得B表達(dá)載體的復(fù)制和胰島素基因的表達(dá)均啟動(dòng)于復(fù)制原（起）點(diǎn)C借助抗生素抗性基因可將含胰島素基因的受體細(xì)胞篩選出來(lái)D啟動(dòng)子和終止密碼子均在胰島素基因的轉(zhuǎn)錄中起作用【答案】C【解析】由于基因的選擇性表達(dá)，在人的肝細(xì)胞中，沒(méi)有胰島素基因轉(zhuǎn)錄的mRNA，A錯(cuò)誤；表達(dá)載體的復(fù)制啟動(dòng)于復(fù)制原（起）點(diǎn)，胰島素基因的表達(dá)啟動(dòng)于啟動(dòng)子，B錯(cuò)誤；標(biāo)記基因的作用是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)，C正確；啟動(dòng)子在胰島素基因的轉(zhuǎn)錄中起作用，終止密碼子在胰島素基因的翻譯中起作用，D錯(cuò)誤。2.圖（a）中的三個(gè)DNA片段上依次表示出了EcoR I、BamH I和Sau3A I三種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列與切割位點(diǎn)，圖（b）為某種表達(dá)載體示意圖（載體上的EcoR I、Sau3A I的切點(diǎn)是唯一的）。根據(jù)基因工程的有關(guān)知識(shí)，回答下列問(wèn)題：（1）經(jīng)BamH I酶切割得到的目的基因可以與上述表達(dá)載體被_酶切后的產(chǎn)物連接，理由是_。（2）若某人利用圖（b）所示的表達(dá)載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子，如圖（c）所示。這三種重組子中，不能在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因產(chǎn)物的有_，不能表達(dá)的原因是_。（3）DNA連接酶是將兩個(gè)DNA片段連接起來(lái)的酶，常見(jiàn)的有_和_，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是_?！敬鸢浮浚?）Sau3A 兩種梅切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端（2） 甲和丙 甲中目的基因插入在啟動(dòng)子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，兩者目的基因均不能轉(zhuǎn)錄 （3）E·coliDNA連接酶 T4DNA連接酶 T4DNA連接酶【解析】（1）分析圖解可知，限制酶Sau3AI和BamHI酶切割后形成的黏性末端相同，因此經(jīng)BamHI酶切割得到的目的基因可以與上述表達(dá)載體被Sau3AI酶切后的產(chǎn)物連接。（2）在基因表達(dá)載體中，啟動(dòng)子位于目的基因的首端，終止子應(yīng)位于目的基因的尾端，這樣的基因才能表達(dá)。圖中甲和丙均不符合，所以不能在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因產(chǎn)物。（3）DNA連接酶是將兩個(gè)DNA片段連接起來(lái)的酶，常見(jiàn)的有EcoliDNA連接酶和T4DNA連接酶，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是T4DNA連接酶3.基因工程又稱為DNA重組技術(shù)，回答相關(guān)問(wèn)題：（1）在基因工程中，獲取目的基因主要有兩大途徑，即_和從_中分離。（2）利用某植物的成熟葉片為材料，同時(shí)構(gòu)建cDNA文庫(kù)和基因組文庫(kù)，兩個(gè)文庫(kù)相比，cDNA文庫(kù)中含有的基因數(shù)目比基因組文庫(kù)中的少，其原因是_。（3）在基因表達(dá)載體中，啟動(dòng)子是_聚合酶識(shí)別并結(jié)合的部位。若采用原核生物作為基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞，最常用的原核生物是_。（4）將目的基因通過(guò)基因槍法導(dǎo)入植物細(xì)胞時(shí)，常用的攜帶目的基因的金屬顆粒有_和_顆粒?！敬鸢浮浚?）人工合成 生物材料（2）cDNA文庫(kù)中只含有葉細(xì)胞已轉(zhuǎn)錄（或已表達(dá)）的基因，而基因組文庫(kù)中含有該植物的全部基因（3）RNA 大腸桿菌（或答細(xì)菌）（4）金粉 鎢粉【解析】（1）獲取目的基因主要有兩大途徑，即人工合成和從自然界已有的物種中分離。（2）植物的成熟葉片中基因選擇性表達(dá)，因此由所有RNA逆轉(zhuǎn)錄形成的cDNA文庫(kù)中只含有葉細(xì)胞已轉(zhuǎn)錄（或已表達(dá)）的基因，而基因組文庫(kù)中含有該植物的全部基因。（3）在基因表達(dá)載體中，啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合的部位。采用原核生物作為基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞，由于易于培養(yǎng)，最常選用大腸桿菌（或細(xì)菌）。（4）將目的基因通過(guò)基因槍法導(dǎo)入植物細(xì)胞時(shí)，常用的攜帶目的基因的金屬顆粒有金粉 和鎢粉顆粒?？键c(diǎn)二 基因工程的應(yīng)用與蛋白質(zhì)工程1.金屬硫蛋白（MT）是一類廣泛存在的金屬結(jié)合蛋白，某研究小組計(jì)劃通過(guò)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增獲得目的基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌，用于重金屬?gòu)U水的凈化處理。PCR擴(kuò)增過(guò)程示意圖如下，請(qǐng)回答下列問(wèn)題：（1）從高表達(dá)MT 蛋白的生物組織中提取mRNA，通過(guò)_獲得_用于PCR擴(kuò)增。（2）設(shè)計(jì)一對(duì)與MT基因兩端序列互補(bǔ)配對(duì)的引物（引物1和引物2），為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，在引物中需要增加適當(dāng)?shù)腳位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間形成_，而造成引物自連。（3）圖中步驟1代表_，步驟2代表退火，步驟3代表延伸，這三個(gè)步驟組成一輪循環(huán)。（4）PCR擴(kuò)增時(shí)，退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度過(guò)高會(huì)破_的堿基配對(duì)。退火溫度的設(shè)定與引物長(zhǎng)度、堿基組成有關(guān)，長(zhǎng)度相同但_的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。（5）如果PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，則可以采取的改進(jìn)措施有_（填序號(hào)：升高退火溫度降低退火溫度重新設(shè)計(jì)引物）?！敬鸢浮浚?）逆轉(zhuǎn)錄cDNA （2）限制性核酸內(nèi)切酶堿基互補(bǔ)配對(duì)（3）變性 （4）引物與模板GC含量高 （5）【解析】（1）PCR擴(kuò)增目的基因，首先要有目的基因作為模板，所以從高表達(dá)MT蛋白的生物組織中提取mRNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，從而用于PCR擴(kuò)增。（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒，首先用限制酶切割含目的基因的DNA片段和質(zhì)粒，所以位于目的基因兩端的引物中需要增加適量的限制酶位點(diǎn)。設(shè)計(jì)的引物之間不能有堿基互補(bǔ)配對(duì)，否則引物自連，不能與模板相連。（3）圖中步驟1、2、3分別表示變性、退火、延伸，這三個(gè)步驟組成一輪循環(huán)。（4）退火表示引物與模板鏈相連，若溫度過(guò)高會(huì)破壞引物與模板的堿基配對(duì)。由于G-C間三個(gè)氫鍵，A-T間兩個(gè)鍵，所以G-C含量越高的引物，退火溫度越高。（5）PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，可能是退火溫度過(guò)高，導(dǎo)致引物與模板不能相連，或引物間相互配對(duì)，引物自連，不能與模板相連，可通過(guò)降低退火溫度或重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行改進(jìn)。2.編碼蛋白甲的DNA序列（序列甲）由A、B、C、D、E五個(gè)片段組成，編碼蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段組成，如圖1所示。回答下列問(wèn)題：（1）現(xiàn)要通過(guò)基因工程的方法獲得蛋白乙，若在啟動(dòng)子的下游直接接上編碼蛋白乙的DNA序列（TTCGCTTCTCAGGAAGGA），則所構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后不能翻譯出蛋白乙，原因是_。（2）某同學(xué)在用PCR技術(shù)獲取DNA片段B或D的過(guò)程中，在PCR反應(yīng)體系中加入了DNA聚合酶、引物等，還加入了序列甲作為_(kāi)，加入了_作為合成DNA的原料。（3）現(xiàn)通過(guò)基因工程方法獲得了甲、乙、丙三種蛋白，要鑒定這三種蛋白是否具有刺激T淋巴細(xì)胞增殖的作用，某同學(xué)做了如下實(shí)驗(yàn)：將一定量的含T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)液平均分成四組，其中三組分別加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一組作為對(duì)照，培養(yǎng)并定期檢測(cè)T淋巴細(xì)胞濃度，結(jié)果如圖2。由圖2 可知，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到a時(shí)，添加蛋白乙的培養(yǎng)液中T淋巴細(xì)胞濃度不再增加，此時(shí)若要使T淋巴細(xì)胞繼續(xù)增殖，可采用的方法是_。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)箱中通常要維持一定的CO2濃度，CO2的作用是_。僅根據(jù)圖、圖2可知，上述甲、乙、丙三種蛋白中，若缺少_（填“A”“B”“C”“D”或“E”）片段所編碼的肽段，則會(huì)降低其刺激T淋巴細(xì)胞增殖的效果?！敬鸢浮浚?）編碼乙的DNA序列起始端無(wú)ATG，轉(zhuǎn)錄出的mRNA無(wú)起始密碼子（2）模板 dNTP（3）進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng) 維持培養(yǎng)液是的pH C【解析】（1）題干信息基因序列（TTCG)，結(jié)合轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的堿基配對(duì)原則，可知其轉(zhuǎn)錄出的mRNA上沒(méi)有起始密碼子AUG。（2）PCR需要的條件包括引物、耐高溫的DNA聚合酶、模板、四種脫氧核糖核苷酸。（3）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞具有貼壁生長(zhǎng)以及接觸抑制的特點(diǎn)，因此若要使T淋巴細(xì)胞繼續(xù)增殖，在培養(yǎng)中需要用胰蛋白酶處理貼壁的細(xì)胞并進(jìn)行分瓶培養(yǎng)，分瓶后的培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)；動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中加入CO2，作用是維持培養(yǎng)液的pH。據(jù)圖分析，丙與對(duì)照接近，甲和乙都有較大影響，在甲、乙中存在但在丙中不存在的片段是C，所以缺少C片段會(huì)降低效果。3.人血清白蛋白(HSA) 具有重要的醫(yī)用價(jià)值，只能從血漿中制備。下圖是以基因工程技術(shù)獲取重組HSA（rHSA）的兩條途徑。（1）獲取HSA基因，首先需采集人的血液，提取_合成總cDNA，然后以cDNA為模板，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增HSA基因。下圖中箭頭表示一條引物結(jié)合模板的位置及擴(kuò)增方向，請(qǐng)用箭頭在方框內(nèi)標(biāo)出標(biāo)出另一條引物的位置及擴(kuò)增方向。（2）啟動(dòng)子通常具有物種及組織特異性，構(gòu)建在水稻胚乳細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)rHSA的載體，需要選擇的啟動(dòng)子是_（填寫(xiě)字母，單選）。A.人血細(xì)胞啟動(dòng)子 B.水稻胚乳細(xì)胞啟動(dòng)子 C.大腸桿菌啟動(dòng)子 D.農(nóng)桿菌啟動(dòng)子 （3）利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻受體細(xì)胞的過(guò)程中，需添加酚類物質(zhì)，其目的是_。（4）人體合成的初始HSA多肽，需要經(jīng)過(guò)膜系統(tǒng)加工形成正確的空間結(jié)構(gòu)才能有活性。與途徑II相比，選擇途徑I獲取rHSA的優(yōu)勢(shì)是_。（5）為證明rHSA具有醫(yī)用價(jià)值，須確認(rèn)rHSA與_的生物學(xué)功能一致?！敬鸢浮靠俁NA （或mRNA）（2）B （3）吸引農(nóng)桿菌移向水稻受體細(xì)胞，有利于目的基因成功轉(zhuǎn)化（4）水稻是真核生物，具有膜系統(tǒng)，能對(duì)初始rHSA多肽進(jìn)行高效加工 （5）HAS【解析】（1）合成總cDNA需提取細(xì)胞中所有的mRNA，然后通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增HSA基因時(shí)，兩條引物分別與模板鏈的5端結(jié)合，擴(kuò)增方向相反。（2）根據(jù)啟動(dòng)子通常具有物種及組織特異性，在水稻胚乳細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)rHSA，需選擇水稻胚乳細(xì)胞啟動(dòng)子。（3）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻受體細(xì)胞的過(guò)程中，酚類物質(zhì)可以吸引農(nóng)桿菌移向水稻受體細(xì)胞，有利于目的基因的轉(zhuǎn)移。（4）水稻是真核生物，具有膜系統(tǒng)，能對(duì)初始rHSA多肽進(jìn)行高效加工，而大腸桿菌是原核生物，細(xì)胞中不具有膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器。（5）為證明rHSA具有醫(yī)用價(jià)值，須確認(rèn)rHSA與天然的HSA生物學(xué)功能一致。五、分層訓(xùn)練 能力進(jìn)階 【基礎(chǔ)達(dá)標(biāo)】1.已知生物體內(nèi)有一種蛋白質(zhì)（P），該蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由305個(gè)氨基酸組成。如果將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸，改變后的蛋白質(zhì)（P1）不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列問(wèn)題：（1）從上述資料可知，若要改變蛋白質(zhì)的功能，可以考慮對(duì)蛋白質(zhì)的進(jìn)行改造。（2）以P基因序列為基礎(chǔ)，獲得P1基因的途徑有修飾基因或合成基因，所獲得的基因表達(dá)時(shí)是遵循中心法則的，中心法則的全部?jī)?nèi)容包括的復(fù)制；以及遺傳信息在不同分子之間的流動(dòng)，即：。（3）蛋白質(zhì)工程也被稱為第二代基因工程，其基本途徑是從預(yù)期蛋白質(zhì)功能出發(fā)，通過(guò)和，進(jìn)而確定相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列，據(jù)此獲得基因，在經(jīng)表達(dá)、純化獲得蛋白質(zhì)，之后還需要對(duì)蛋白質(zhì)的生物進(jìn)行鑒定?！敬鸢浮浚?）氨基酸序列（或結(jié)構(gòu)）（1分） （2）P P1 DNA和RNADNARNA、RNADNA、RNA蛋白質(zhì)（或轉(zhuǎn)錄、逆轉(zhuǎn)錄、翻譯）（3） 設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 推測(cè)氨基酸序列 功能【解析】（1）從上述資料可知，若要改變蛋白質(zhì)的功能，可以考慮對(duì)蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行改造。（2）以P基因序列為基礎(chǔ)，獲得P1基因的途徑有二：修飾P基因；合成P1基因所獲得的基因表達(dá)時(shí)遵循中心法則，中心法則的全部?jī)?nèi)容包括DNA和RNA復(fù)制；以及遺傳信息在不同分子之間的流動(dòng)，即DNARNA、RNADNA、RNA蛋白質(zhì)。（3）蛋白質(zhì)工程的過(guò)程為：預(yù)期蛋白質(zhì)功能設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)推測(cè)應(yīng)有氨基酸序列找到對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列（基因）據(jù)此獲得基因，再經(jīng)表達(dá)、純化獲得蛋白質(zhì)，之后還需要對(duì)蛋白質(zhì)的生物功能進(jìn)行鑒定。2.HIV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，是艾滋病的病原體?；卮鹣铝袉?wèn)題：（1）用基因工程方法制備HIV的某蛋白（目的蛋白）時(shí)，可先提取HIV中的，以其作為模板，在的作用下合成。獲取該目的蛋白的基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體，隨后導(dǎo)入受體細(xì)胞。（2）從受體細(xì)胞中分離純化出目的蛋白，該蛋白作為抗原注入機(jī)體后，刺激機(jī)體產(chǎn)生的可與此蛋白結(jié)合的相應(yīng)分泌蛋白是。該分泌蛋白可用于檢測(cè)受試者血清中的HIV，檢測(cè)的原理是。（3）已知某種菌導(dǎo)致的肺炎在健康人群中罕見(jiàn)，但是在艾滋病患者中卻多發(fā)。引起這種現(xiàn)象的根本原因是HIV主要感染和破壞了患者的部分細(xì)胞，降低了患者免疫系統(tǒng)的防衛(wèi)功能。（4）人的免疫系統(tǒng)有癌細(xì)胞的功能，艾滋病患者由于免疫功能缺陷，易發(fā)生惡性腫瘤?！敬鸢浮浚?）RNA 逆轉(zhuǎn)錄酶 DNA (2)抗體 抗原抗體特異性結(jié)合（4） T（或T淋巴） （4）監(jiān)控和清除【解析】（1）HIV是一種逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒，若要獲取HIV的某種蛋白質(zhì)，需將HIV的遺傳物質(zhì)RNA提取出來(lái)，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA分子即獲取該目的基因。（2）抗原注入機(jī)體后，會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體，抗體會(huì)和抗原發(fā)生特異性結(jié)合。HIV和抗體能特異性結(jié)合，因此可以用于檢測(cè)受試者血清中的HIV。（3）HIV主要感染和破壞了患者的部分免疫細(xì)胞，主要是T細(xì)胞，降低了患者免疫系統(tǒng)的防衛(wèi)功能。（4）人的免疫系統(tǒng)有監(jiān)控和清除癌細(xì)胞的功能。3.回答下列有關(guān)遺傳信息傳遞與表達(dá)的問(wèn)題。如圖A所示，質(zhì)粒pZHZ9上含有X抗生素抗性基因（XR）和Y抗生素抗性基因（YR）。其中XR內(nèi)部含有限制酶KasI識(shí)別序列，YR內(nèi)部含有限制酶FseI、HpaII、NaeI、NgoMIV識(shí)別序列，五種酶的識(shí)別序列如圖B（表示切割位點(diǎn)），且這些識(shí)別序列在整個(gè)質(zhì)粒上均僅有一處，目的基因內(nèi)部不存在這些識(shí)別序列。（1）若要將結(jié)構(gòu)如圖28C所示的目的基因直接插入到Y(jié)R內(nèi)形成重組質(zhì)粒pZHZ10，則pZHZ9需用限制酶_切開(kāi)。（2）將上述切開(kāi)的質(zhì)粒溶液與目的基因溶液混合，加入DNA連接酶連接后，進(jìn)行大腸桿菌受體細(xì)胞導(dǎo)入操作。之后，受體細(xì)胞的類型（對(duì)兩種抗生素表現(xiàn)出抗性R或敏感性S）包含_（多選）。AXR、YR BXR、YS CXS、YRDXS、YS（3）若用KasI和FseI聯(lián)合酶切重組質(zhì)粒pZHZ 10（只含單個(gè)目的基因），則可能產(chǎn)生的酶切片段數(shù)為_(kāi)（多選）。A 1 B2C 3D 4（4）動(dòng)物基因工程通常以受精卵作為受體細(xì)胞的根本原因是_。A受精卵能使目的基因高效表達(dá)B受精卵可發(fā)育成動(dòng)物個(gè)體C受精卵基因組更易接受DNA的插入D受精卵尺寸較大，便于DNA導(dǎo)入操作【答案】（1）NgoMIV （2）ABD （3）ABC （4）B【解析】（1）比較五種限制酶的識(shí)別位點(diǎn)和露出的黏性末端，可以看出只有限制酶NgoMIV切割DNA分子后露出的黏性末端與目的基因兩端的黏性末端相同。因此，要將結(jié)構(gòu)如圖C所示的目的基因直接插入到Y(jié)R內(nèi)形成重組質(zhì)粒pZHZ10，則pZHZ9需用限制酶NgoMIV切開(kāi)。（2）將圖中切開(kāi)的質(zhì)粒溶液與目的基因溶液混合，加入DNA連接酶連接后，有的質(zhì)?？赡軟](méi)有導(dǎo)入目的基因，這種普通質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞后，由于XR、YR基因都沒(méi)有被破壞，因此兩種抗性都存在，故A正確；目的基因插入質(zhì)粒后，由于YR基因被破壞，因此重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞后，只具有XR抗性，表現(xiàn)XR、YS，故B正確；若是沒(méi)有導(dǎo)入質(zhì)粒，表現(xiàn)為XS、YS，沒(méi)有其他情況，故C錯(cuò)誤，D正確。（3）根據(jù)題意，XR內(nèi)部含有限制酶Kas識(shí)別序列，YR內(nèi)部含有限制酶Fse、Hpa、Nae、NgoM識(shí)別序列，五種酶的識(shí)別序列在整個(gè)質(zhì)粒上均僅有一處，目的基因內(nèi)部不存在這些識(shí)別序列。如果插入目的基因后，NgoM識(shí)別序列有兩處，根據(jù)題意，能夠被NgoM識(shí)別的序列都能被Fse識(shí)別，因此用Kas和Fse聯(lián)合酶切重組質(zhì)粒pZHZ10，最少可以切開(kāi)一個(gè)位點(diǎn)，得到一種DNA片段，最多切開(kāi)3個(gè)位點(diǎn)，得到三種DNA片段。故選ABC。（5）動(dòng)物體細(xì)胞的全能性受到限制，不能表現(xiàn)出來(lái)，而受精卵的全能性最高，因此轉(zhuǎn)基因動(dòng)物一般用受精卵作為受體細(xì)胞。故選：B?！灸芰μ嵘?.回答下列有關(guān)遺傳信息傳遞與表達(dá)的問(wèn)題。在圖27所示的質(zhì)粒PZHZ11（總長(zhǎng)為3.6kb，1kb=1000對(duì)堿基因）中，lacZ基因編碼-半乳糖苷酶，后者催化生成的化合物能將白色的大腸桿菌染成藍(lán)色。（1）若先用限制酶BamHI切開(kāi)pZHZ11，然后滅活BamHI酶，再加DNA連接酶進(jìn)行連接，最后將連接物導(dǎo)入足夠數(shù)量的大腸桿菌細(xì)胞中，則含3.1kb質(zhì)粒的細(xì)胞顏色為_(kāi)；含3.6kb質(zhì)粒的細(xì)胞顏色為_(kāi)。（2）若將兩端分別用限制酶BamHI和BglHI切開(kāi)的單個(gè)目的基因片段置換pZHZ11中0.5kb的BamHI酶切片段，形成4.9kb的重組質(zhì)粒，則目的基因長(zhǎng)度為_(kāi)kb。（3）上述4.9kb的重組質(zhì)粒有兩種形式，若用BamHI和EcoRI聯(lián)合酶切其中一種，只能獲得1.7kb和3.2kb兩種DNA片段；那么聯(lián)合酶切同等長(zhǎng)度的另一種重組質(zhì)粒，則可獲得_kb和_kb兩種DNA片段。（4）若將人的染色體DNA片段先導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中克隆并鑒定目的基因，然后再將獲得的目的基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞中表達(dá)，最后將產(chǎn)物的藥物蛋白注入小鼠體內(nèi)觀察其生物功能是否發(fā)揮，那么上述過(guò)程屬于（ ）。A.人類基因工程 B.動(dòng)物基因工程 C.植物基因工程 D.微生物基因工程【答案】（1）白色 白色和藍(lán)色/白色或藍(lán)色 （2）1.8 （3）1.43.5 （4）C【解析】（1）若先用限制酶BamH切開(kāi)pZHZ11，然后滅活BamHI酶，則破壞了lacZ基因，導(dǎo)致-半乳糖苷酶不能合成。而-半乳糖苷酶催化生成的化合物能將變色的大腸桿菌染成藍(lán)色，所以含3.1