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高中生物 第四章 生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)實踐 第10課時 分子生物學(xué)技術(shù)同步備課課件 蘇教版選修1

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1、第10課時分子生物學(xué)技術(shù)第四章生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)實踐學(xué)習(xí)導(dǎo)航1.結(jié)合教材了解PCR技術(shù)的基本操作。2.理解PCR擴(kuò)增DNA片段的原理。3.結(jié)合教材,嘗試進(jìn)行目的DNA片段的體外擴(kuò)增。重難點擊1.了解PCR技術(shù)的基本操作。2.理解PCR的原理。一、使用PCR儀的安全措施和PCR反應(yīng)程序二、目的DNA片段的體外擴(kuò)增與鑒定內(nèi)容索引當(dāng)堂檢測一、使用PCR儀的安全措施和PCR反應(yīng)程序1.DNA分子的分子的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)(1)寫出各個標(biāo)號的名稱: ; ; ; ; ; ; ; ; ; 。基礎(chǔ)梳理胞嘧啶腺嘌呤鳥嘌呤胸腺嘧啶脫氧核糖磷酸基團(tuán)胸腺嘧啶脫氧核苷酸氫鍵堿基對一條脫氧核苷酸鏈(2)DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱?/p>

2、行的,為了明確表示DNA鏈的方向,通常將DNA的羥基末端稱為3端,將磷酸基團(tuán)的末端稱為5端,按此原則在圖上方框內(nèi)標(biāo)出兩條鏈的方向。答案答案左鏈上5端,下3端;右鏈上3端,下5端。答案2.細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制條件分析復(fù)制條件分析條件組分作用模板DNA的 條單鏈提供復(fù)制的模板原料四種_合成DNA子鏈的原料酶解旋酶打開_DNA聚合酶催化_能量_為解螺旋和合成子鏈供能引物RNA為DNA聚合酶提供合成的 起點兩脫氧核苷酸DNA雙螺旋合成DNA子鏈ATP3端3.PCR技術(shù)技術(shù)(1)概念:在 快速擴(kuò)增 的技術(shù)稱為PCR技術(shù)。(2)物質(zhì)條件: 、 、 、 。(3)PCR反應(yīng)的過程及結(jié)果PCR反應(yīng)程序a. :

3、在94 高溫下,作為模板的 解旋成為 。b. :反應(yīng)體系的溫度降至 ,引物與作為模板的單鏈DNA上的 相互配對。體外特定基因或DNA序列(目的DNA片段)DNA模板四種脫氧核苷酸TaqDNA聚合酶引物變性雙鏈DNA單鏈DNA退火(復(fù)性)55 特定部位c. :反應(yīng)體系的溫度回升到 ,按照單鏈DNA上的脫氧核苷酸序列,4種脫氧核苷酸根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則,在TaqDNA聚合酶的作用下連接到引物之后,使引物鏈延伸,形成互補(bǔ)的 。結(jié)果a.PCR擴(kuò)增一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán),每次循環(huán)都包括_ 三步。b.兩引物之間的固定長度的DNA序列呈 擴(kuò)增。延伸72 左右DNA雙鏈變性、退火、延伸指數(shù)問題探究1.PCR原

4、理PCR反應(yīng)與體內(nèi)DNA復(fù)制的引物在化學(xué)本質(zhì)上是否相同?請分析原因。答案答案不相同。體內(nèi)DNA復(fù)制所需引物為RNA聚合酶合成的一小段RNA,但PCR反應(yīng)時所用引物一般是人工加入的一小段單鏈DNA。答案2.PCR反應(yīng)過程(1)PCR反應(yīng)中需要解旋酶和DNA聚合酶嗎?若需要,則與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制有何區(qū)別?答案答案PCR反應(yīng)不需要解旋酶,但需要DNA聚合酶。由于PCR反應(yīng)中需要高溫使DNA解旋,因此PCR所需的DNA聚合酶能耐高溫。(2)PCR的每次循環(huán)中應(yīng)如何控制溫度?請分析原因。答案答案每次循環(huán)中先高溫解旋,再低溫使引物與模板結(jié)合,最后適當(dāng)升溫有利于Taq DNA聚合酶發(fā)揮作用。答案(3)結(jié)合下

5、圖分析PCR過程中DNA復(fù)制的方向是怎樣的?答案答案答案DNA的羥基(OH)末端為3端;磷酸基團(tuán)的末端為5端。當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合后,DNA聚合酶就能從引物的3端開始延伸DNA鏈,DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸。PCR擴(kuò)增與DNA復(fù)制的異同歸納總結(jié)歸納總結(jié)項目DNA復(fù)制PCR擴(kuò)增不同點時期有絲分裂間期或減數(shù)第一次分裂的間期任何時期場所活細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞外酶解旋酶、DNA聚合酶耐高溫的Taq DNA聚合酶引物有轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生RNA作引物,無需人工加入無轉(zhuǎn)錄,無引物產(chǎn)生,需人工加入兩種DNA引物特點邊解旋邊復(fù)制先全部解旋后開始復(fù)制緩沖液不需緩沖液配制緩沖液代替細(xì)胞核液設(shè)備無控制

6、溫度變化的溫控設(shè)備相同點原理嚴(yán)格遵循堿基互補(bǔ)配對原則引物都需要分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物模板DNA的兩條鏈為模板特點半保留復(fù)制原料游離的四種脫氧核苷酸解析解析DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,故DNA復(fù)制需要引物。DNA聚合酶只能從3端延伸DNA鏈,而不能從5端延伸DNA鏈。引物通過堿基互補(bǔ)配對原則與DNA母鏈相結(jié)合。PCR擴(kuò)增的對象是DNA,不是氨基酸序列。拓展應(yīng)用1.下列關(guān)于DNA復(fù)制和PCR技術(shù)的描述中,正確的是A.DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,只能從5端延伸DNA鏈B.DNA復(fù)制不需要引物C.引物與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對進(jìn)行結(jié)合D.PCR擴(kuò)增的對象是氨基酸序列答案解析

7、解析解析PCR技術(shù)中用高溫使DNA分子中的氫鍵打開,從而解旋,其原理是DNA的熱變性原理。2.PCR技術(shù)有效地解決了因為樣品中DNA含量太低難以對樣品進(jìn)行研究的問題,而被廣泛應(yīng)用,與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制相比,PCR可以快速擴(kuò)增所需的DNA片段,請分析回答下列有關(guān)問題:(1)體內(nèi)DNA復(fù)制過程中用解旋酶打開雙鏈DNA,而PCR技術(shù)中的解旋原理是 。答案解析DNA的熱變性原理(2)此過程需要一種Taq DNA聚合酶。該酶是從 中分離的。解析解析Taq DNA聚合酶是從水生耐熱細(xì)菌Taq中提取的。(3)與普通DNA聚合酶相比,Taq DNA聚合酶具有的特性是 。解析解析與普通DNA聚合酶相比,Taq

8、DNA聚合酶在90 以上的環(huán)境中不變性,具有耐高溫的特性。(4)與體內(nèi)DNA復(fù)制相比較,PCR反應(yīng)要在 中才能進(jìn)行,并且要嚴(yán)格控制 條件。解析解析PCR反應(yīng)需要適宜的溫度和pH,因此PCR反應(yīng)要在一定的緩沖溶液中進(jìn)行,并需嚴(yán)格控制好溫度條件。答案解析水生耐熱細(xì)菌Taq耐高溫一定的緩沖溶液溫度(5)PCR中加入的引物有 種,加入引物的作用是 。解析解析PCR需要兩種引物,引物的識別位點決定了PCR擴(kuò)增的DNA片段。PCR中加入的引物一般是一小段單鏈DNA,作用是引導(dǎo)DNA復(fù)制,可以使游離的脫氧核苷酸與之結(jié)合形成磷酸二酯鍵,成為DNA復(fù)制的起點。答案解析2作為DNA復(fù)制的起點細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制需要

9、適宜的溫度和pH嗎?若需要,是如何實現(xiàn)的?答案答案需要。細(xì)胞內(nèi)的適宜溫度和pH與內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)有關(guān),低等生物與環(huán)境因素有關(guān)。答案一題多變一題多變與與PCR原理有關(guān)的三個易錯點原理有關(guān)的三個易錯點(1)酶的作用位點:解旋酶的作用是使DNA兩條鏈之間的氫鍵斷開;DNA聚合酶與DNA連接酶的作用都是催化形成磷酸二酯鍵。不要誤認(rèn)為解旋酶也作用于磷酸二酯鍵。(2)DNA聚合酶和DNA連接酶:DNA聚合酶是將單個核苷酸連接到已有的單鏈片段的3端上,需要模板;而DNA連接酶連接的是兩條DNA片段的缺口,不需要模板。(3)PCR中的解旋過程:PCR過程中不需要解旋酶,需要升高溫度才能打開氫鍵,但此時的溫度不會破

10、壞磷酸二酯鍵,因此,DNA加熱變性后變?yōu)閱捂?,并未分解成單體。易錯提醒易錯提醒二、目的DNA片段的體外擴(kuò)增與鑒定基礎(chǔ)梳理1.DNA片段的片段的PCR擴(kuò)增擴(kuò)增(1)準(zhǔn)備器材:PCR儀、臺式高速離心機(jī)、0.2 mL PCR微量離心管、自動取液器、模板DNA等。(2)在0.2 mL PCR微量離心管中加入 緩沖液,_ 的溶液各5 L, 模板DNA, 引物1和5 L引物2, 雙蒸水。(3)煮沸 之后冰浴 , 低速離心, 按照1單位/L加入 。(4)擴(kuò)增DNA片段的反應(yīng)程序:將微量離心管放入PCR儀中,蓋上樣品池蓋。在 的條件下預(yù)熱5 min, 再設(shè)置反應(yīng)程序為: , ,_ , (以上過程循環(huán)30次)。

11、最后一次延伸條件為 , 。(5)按照PCR儀器操作要求運行反應(yīng)程序。5 L 10倍濃縮的PCR4種脫氧核苷酸1 L5 L29 L5 min2 minTaqDNA聚合酶94 94 30 s55 30 s72 1 min72 1 min2.DNA分子的測定分子的測定(1)配制二苯胺試劑:分別配制A液(1.5 g二苯胺溶于100 mL 中,再加入1.5 mL濃硫酸,用棕色瓶保存)和B液(體積分?jǐn)?shù)為0.2%的 溶液)。將0.1 mL B液加入10 mL A液中,混勻。(2)條件:取一定量擴(kuò)增前和擴(kuò)增后的溶液分別放入等量的二苯胺試劑,混勻后觀察顏色變化。用 加熱上述溶液。(3)現(xiàn)象:出現(xiàn) 現(xiàn)象。3.定量

12、分析方法定量分析方法: 如果需要進(jìn)行定量分析, 可以采用 或_ 。前者需要使用 ,后者需要使用 等。冰醋酸乙醛沸水浴藍(lán)色紫外分光光度法瓊脂糖凝膠電泳法紫外分光光度計電泳儀問題探究1.實驗過程分析(1)離心的目的是什么?在離心的過程中,微量離心管的蓋子為什么一定要蓋嚴(yán)?答案答案離心的目的是使反應(yīng)液集中在離心管底部,提高反應(yīng)效率。微量離心管的蓋子一定要蓋嚴(yán),防止實驗中脫落或液體外溢。(2)在離心前要用手輕輕彈擊管的側(cè)壁,目的是什么?答案答案離心前用手輕輕彈擊管的側(cè)壁目的是使反應(yīng)液混合均勻。答案(3)PCR實驗中使用的微量離心管、取液器、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓蒸汽滅菌,為什么這樣操作

13、?還有哪些操作與此目的相同?答案答案為避免外源DNA等的污染。在微量離心管中添加反應(yīng)成分時,每吸取一種試劑后,取液器上的槍頭都必須更換。答案2.結(jié)果檢測(1)實驗中為什么要測定DNA的含量?答案答案實際操作過程中會有許多因素影響DNA含量,所以需要對DNA含量進(jìn)行測定。(2)如何判斷DNA擴(kuò)增成功?答案答案可以通過計算DNA含量來評價擴(kuò)增的效果。電泳檢測的方法,可以通過在紫外線下直接觀察DNA帶的分布及粗細(xì)程度來評價擴(kuò)增的效果。(3)PCR擴(kuò)增過程可能會出現(xiàn)哪些異常結(jié)果?答案答案樣品產(chǎn)物少,或產(chǎn)生新的DNA。答案拓展應(yīng)用3.進(jìn)行PCR反應(yīng)的具體實驗操作順序應(yīng)為設(shè)計好PCR儀的循環(huán)程序按配方準(zhǔn)備

14、好各組分用微量移液器向微量離心管中依次加入各組分進(jìn)行PCR反應(yīng)離心使反應(yīng)液集中在離心管底部A. B.C. D.答案解析解析解析PCR反應(yīng)的操作步驟一般分為準(zhǔn)備(包括配制配方及將各配方放于實驗臺上) 移液 混合 離心 反應(yīng)。PCR儀是一種自動控制溫度的儀器,設(shè)計好循環(huán)程序就可以進(jìn)行反應(yīng)了。4.近20年來,PCR技術(shù)(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))成為分子生物學(xué)實驗室的一種常規(guī)實驗手段,其原理是利用DNA半保留復(fù)制,在試管中進(jìn)行DNA的人工復(fù)制(如圖),在短時間內(nèi),將DNA擴(kuò)增幾百萬倍甚至幾十億倍,從而使實驗室所需要的遺傳物質(zhì)不再受限于活的生物體。(1)加熱使DNA雙鏈間的 鍵完全打開,稱為 ;而在細(xì)胞中是在

15、酶的作用下進(jìn)行的。答案解析氫解旋解旋解析解析PCR技術(shù)利用熱變性原理使DNA雙鏈之間的氫鍵斷裂,稱為解旋,而在細(xì)胞內(nèi)是在解旋酶的作用下使氫鍵斷裂。答案解析(2)如果只需要大量克隆模板DNA中間的某個特定區(qū)段,應(yīng)該加入 種特定的引物。當(dāng)溫度降低至55 時,引物與兩條“舒展”的模板鏈的特定位置結(jié)合,在DNA聚合酶的作用下,只能在引物的 端連接脫氧核苷酸,兩條子鏈的延伸方向都是 。兩3從子鏈的5端向3端延伸解析解析PCR分為三個基本反應(yīng)步驟:變性(94 )、退火(55 )、延伸(72 ),其特異性依賴于與靶序列互補(bǔ)的引物,引物是兩段與待擴(kuò)增DNA序列互補(bǔ)的片段,兩引物之間的距離決定擴(kuò)增片段的長度。由

16、于DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,只能從引物的3端延伸DNA鏈,則DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸。解析解析PCR技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制不完全相同,除了需要模板、原料、酶以外,至少還需要液體環(huán)境(穩(wěn)定的緩沖溶液),每一個步驟都需要適宜的溫度和酸堿度等。答案解析(3)PCR技術(shù)的必需條件,除了模板、原料、酶之外,至少還有三個條件,即液體環(huán)境、適宜的 和 ,前者由 自動調(diào)控,后者則靠 來維持。溫度酸堿度PCR儀緩沖液解析解析一個DNA分子連續(xù)復(fù)制四次之后,形成16個DNA分子,15N標(biāo)記的DNA分子有2個,則15N標(biāo)記的DNA分子占全部DNA分子總數(shù)的比例為1/8。答案解析(4)通

17、過PCR技術(shù)使DNA分子大量復(fù)制,如果將一個用15N標(biāo)記的DNA分子放入試管中,以14N標(biāo)記的脫氧核苷酸為原料,連續(xù)復(fù)制四次之后,則15N標(biāo)記的DNA分子占全部DNA分子總數(shù)的比例是 。1/8問題導(dǎo)析問題導(dǎo)問題導(dǎo)析析(1)解旋是使DNA雙鏈間的 鍵斷裂,PCR技術(shù)是利用DNA的 原理,細(xì)胞內(nèi)是在 酶的作用下解旋。(2)DNA分子不論復(fù)制幾次,含有15N標(biāo)記的DNA分子都只有 個。答案返回上頁氫熱變性解旋2課堂小結(jié)放入PCR儀擴(kuò)增引物復(fù)性當(dāng)堂檢測1.PCR利用了DNA的哪種特性來控制DNA的解聚與結(jié)合A.特異性 B.穩(wěn)定性C.熱變性 D.多樣性23451答案2.符合PCR反應(yīng)條件的一項是穩(wěn)定的緩

18、沖液環(huán)境DNA模板合成引物四種脫氧核苷酸DNA聚合酶DNA解旋酶限制酶溫控設(shè)備A. B.C. D.答案解析23415解析解析PCR反應(yīng)模擬了生物細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的條件,只是無需解旋酶(可熱變性),也不需要基因工程的工具酶(限制酶)。解析解析PCR是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù),在高溫條件下,把DNA的雙鏈打開,緩慢冷卻后,又重新結(jié)合,需要耐高溫的DNA聚合酶,同時,還需要引物,從引物的3端連接脫氧核苷酸。3.下列關(guān)于PCR的描述中,正確的是PCR是一種酶促反應(yīng)引物決定了擴(kuò)增的特異性擴(kuò)增DNA利用了熱變性的原理擴(kuò)增的對象是氨基酸序列A. B.C. D.答案23415解析4.如圖所示為PCR擴(kuò)

19、增的產(chǎn)物,請分析此產(chǎn)物是哪次循環(huán)的產(chǎn)物A.第一次循環(huán) B.第二次循環(huán) C.第三次循環(huán) D.第四次循環(huán)解析2341答案5解析解析在PCR反應(yīng)中,以引物為標(biāo)記,第一次循環(huán)時,以加入的DNA為模板,兩條DNA鏈可分別由引物和引物與其結(jié)合并在DNA聚合酶的作用下延伸,所以形成的DNA中只有一種引物;從第二次循環(huán)開始,上次產(chǎn)生的DNA分子又可作為模板參與反應(yīng),所以會形成DNA分子兩端均含引物的情況,如下圖所示,因此題干中所出現(xiàn)的情況是第一次循環(huán)的產(chǎn)物。234155.多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。請回答下列問題:(1)DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?,通常?的末端稱為5端,當(dāng)引物

20、與DNA母鏈通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合后,DNA聚合酶就能從引物的 開始延伸DNA鏈。解析解析一條脫氧核苷酸鏈一端是游離的羥基,另一端是游離的磷酸基團(tuán),含羥基的一端是3端,含磷酸基團(tuán)的是5端。引物的5端與模板鏈的3端結(jié)合,然后沿著引物的3端延伸。耐高溫的Taq DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)是實現(xiàn)PCR的關(guān)鍵,該酶可以利用選擇培養(yǎng)基從一些微生物中分離出來。PCR一次循環(huán)要經(jīng)歷變性、退火和延伸三個階段。答案解析磷酸基團(tuán)3端23415(2)PCR利用了DNA的熱變性原理解決了打開DNA雙鏈的問題,但又導(dǎo)致了DNA聚合酶失活的新問題。到20世紀(jì)80年代,科學(xué)家從一種Taq細(xì)菌中分離到 ,它的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用解決了上述問題。要將Taq細(xì)菌從其他普通的微生物中分離出來,所用的培養(yǎng)基叫 。(3)PCR的每次循環(huán)可以分為 三步。假設(shè)在PCR反應(yīng)中,只有一個DNA片段作為模板,請計算在5次循環(huán)后,反應(yīng)物中大約有 個這樣的DNA片段。(4)簡述PCR技術(shù)的主要應(yīng)用:_ (要求至少答兩項)。23415答案耐高溫的Taq DNA聚合酶選擇培養(yǎng)基變性、退火和延伸32遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測定等

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