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1《動物源性 I 型膠原蛋白成分測定 聚丙烯酰胺凝膠電泳法》國家標(biāo)準(zhǔn)編 制 說 明（征求意見稿）一、任務(wù)來源本國家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)列入國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會《國標(biāo)委綜合[2018]41 號》 ，項目編號“20180923-T-424”。本項任務(wù)由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口，定于 2020 年完成。本標(biāo)準(zhǔn)由中國科學(xué)院海岸帶研究所等單位共同組成。二、目的和意義膠原蛋白（Collagen ）是多細(xì)胞生物中含量最豐富、分布最廣泛的蛋白質(zhì)種類之一。在生物體內(nèi)，膠原蛋白與聚多糖等成分一起形成精密有序的細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)——細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM） ，對機(jī)體細(xì)胞的發(fā)育、遷移以及機(jī)體組織的形成和功能發(fā)揮等均產(chǎn)生重要作用。有關(guān)膠原的研究與應(yīng)用歷史悠久。5000 多年前，當(dāng)如毛發(fā)之類的材料首次作為醫(yī)用縫合線時，膠原“腸線” 便得到了相應(yīng)的發(fā)展，并用于傷口縫合。人們最初是通過鞣制膠原將皮革和皮毛進(jìn)行防腐處理，以便得到易于保存、干燥后仍能機(jī)械助軟的皮革。但是，由于膠原來源、結(jié)構(gòu)與性能的復(fù)雜性，加上測試與研究設(shè)備的局限性，盡管人們已經(jīng)廣泛使用了膠原，但對其結(jié)構(gòu)和性能的研究仍然不足。近年來，隨著現(xiàn)代科學(xué)與技術(shù)的發(fā)展，相關(guān)領(lǐng)域的研究不斷深入；同時分析與測試設(shè)備的日臻完善，也為膠原的深入研究創(chuàng)造了條件。另外，在資源、環(huán)境及可持續(xù)發(fā)展面臨的問題日益嚴(yán)峻的今天，作為一種可再生資源的膠原，備受人們的關(guān)注，表現(xiàn)在人們對膠原所進(jìn)行的應(yīng)用研究開發(fā)工作逐漸增多，也許多方面均有不少突破。膠原已廣泛應(yīng)用于可食性包裝材料、可降解日用品材料、膠原蛋白合成纖維等領(lǐng)域，由于膠原蛋白具有良好的生物相容性并能促進(jìn)機(jī)體細(xì)胞的生長、遷移和增生，因此被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)材料、醫(yī)學(xué)組織工程和醫(yī)學(xué)美容等領(lǐng)域。如膠原海綿在創(chuàng)傷修復(fù)、快速止血中的應(yīng)用 ；膠原膠在面部皮膚除皺、靶向藥物制備及藥物緩釋中的應(yīng)用；膠原復(fù)合材料在人造血管、人造皮膚和骨骼、人工眼角膜移植等醫(yī)學(xué)組織工程中的應(yīng)用。 2018 年我國醫(yī)療器械市場 5650 億元，其中生物植入材料約 722 億，膠原基生物植入材料約 377 億（止血材料約 19 億） ，年復(fù)合增長率 21.67 %。2018 年我國化妝品市場規(guī)模 1800 億元，含膠原化妝品 125 億元(占 7 %)，2年增長率 12 %；市場已有含膠原化妝品 620 種，國產(chǎn)產(chǎn)品僅 32 種，約占 5 %。膠原的種類很多，到目前為止，已經(jīng)報道的基于化學(xué)結(jié)構(gòu)上不同類型的膠原有 27 種，其中 I 型膠原占全部蛋白含量的 90%以上，因此，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，研究最廣泛的是 I 型膠原。I 型膠原主要分布于骨、肌腱、韌帶、皮膚等組織，目前 I 型膠原大多數(shù)是從哺乳動物的皮膚、肌腱與骨骼中提取，例如牛皮、牛肌腱、以及豬和牛骨。另外，還有部分學(xué)者從海洋和水產(chǎn)魚類的皮膚中提取 I 型膠原。I 型膠原來源廣泛，價廉易得，且性能優(yōu)良，是一種不可多得的天然生物高分子材料 。I 型膠原的結(jié)構(gòu)由 2 條相同的 α1鏈和 1 條不同的 α2鏈組成，33% 的甘氨酸、10% 的脯氨酸和的 10% 羥脯氨酸構(gòu)成一條具有特征性的重復(fù)構(gòu)型膠原肽鏈（α 鏈） ，這種獨(dú)特的氨基酸序列提供了一個 II 型聚脯氨酸的左手螺旋結(jié)構(gòu)，在膠原形成的過程中，3 條平行的 II 型聚脯氨酸的左手螺旋結(jié)構(gòu)互相旋轉(zhuǎn)纏繞形成一條右手三螺旋結(jié)構(gòu)，被稱為原膠原分子，一個膠原纖維片段或是原纖維包含 5 個平行的原膠原分子，氫鍵提供螺旋結(jié)構(gòu)最初的結(jié)合，共價鍵提供附加的穩(wěn)定。I 型膠原是一種最重要的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在支持與連接組織中起到重要的作用。由于其獨(dú)特的纖維狀結(jié)構(gòu)及優(yōu)良的生物學(xué)特性，使其得到廣泛的關(guān)注。其優(yōu)點(diǎn)可以集中體現(xiàn)為：良好的生物相容性、移除端肽后較低的抗原性、具有一定的粘附性和纖維不松脆性、吸水性、可縫合、較高的孔隙率可以為新生組織提供空間、其纖維可以整合進(jìn)新生組織基質(zhì)、可以與其他材料相結(jié)合、液壓可以被轉(zhuǎn)導(dǎo)等。膠原支架或凝膠如果應(yīng)用于體內(nèi)的話，會承受來自人體的生理或病理狀態(tài)下的機(jī)械載荷，因此，保持它們結(jié)構(gòu)和功能就顯得尤為重要，另外，三螺旋結(jié)構(gòu)完整性的 I 型膠原，具備較低的細(xì)胞毒性、更優(yōu)良的生物相容性和生物可降解性，對于其在功能化妝品、功能食品和生物醫(yī)用材料和組織工程如軟骨組織工程、血管組織工程、人工皮膚肌腱等商業(yè)、生物領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。目前，對于膠原三股螺旋完整性構(gòu)象的檢測方法眾多，但或多或少都會有一定的局限性，急需建立統(tǒng)一有效的的標(biāo)準(zhǔn)化檢測方法。三、標(biāo)準(zhǔn)制定原則（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則本標(biāo)準(zhǔn)按照 GB/T1.1-2009 給出的規(guī)則起草。標(biāo)準(zhǔn)編制遵循 “統(tǒng)一性、協(xié)調(diào)性、適用性、一致性、規(guī)范性”的原則。本標(biāo)準(zhǔn)是在廣泛調(diào)查研究的基礎(chǔ)上制定的。（二）標(biāo)準(zhǔn)制訂主要依據(jù)31、標(biāo)準(zhǔn)編寫遵循 GB1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第 1 部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》的有關(guān)要求。2、標(biāo)準(zhǔn)編寫內(nèi)容參考我國與農(nóng)產(chǎn)品相關(guān)的法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)，包括 GB/T 9695.23 肉與肉制品羥脯氨酸含量測定、GB/T 23527 蛋白酶制劑、GB/T 6682-2008 分析實(shí)驗室用水規(guī)格和試驗方法、GB 601—1988 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的配制和標(biāo)定、 NYT 1663-2008 乳與乳制品中 β-乳球蛋白的測定 聚丙烯酰胺凝膠電泳法、 YY/T 1453-2016 組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 Ⅰ型膠原蛋白表征方法等。四、標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容1 術(shù)語與定義I 型膠原是指在廣泛存在于動物體中的一種結(jié)構(gòu)蛋白，起到支撐作用并能聚集成纖維，是膠原纖維組分中的一部分。它來源于表達(dá)在膠原 α鏈上的 COLIA1 和 COLIA2 基因。所有的膠原均具有由三條聚肽鏈單元組成的三螺旋結(jié)構(gòu)，其分子結(jié)構(gòu)中具有典型的“Gly-X-Y”三肽重復(fù)序列（脯氨酸經(jīng)常占據(jù) X 位，羥脯氨酸占據(jù) Y 位） 。I 型膠原富含甘氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸和 4-羥脯氨酸，含少量的硫且不含 L-色氨酸。羥脯氨酸是一種膠原蛋白特有的氨基酸，約占膠原蛋白的 9% - 13%，I 型膠原蛋白纖維能自然的溶解在稀酸和稀堿中。加熱到 40℃以上后膠原蛋白可變性成單 α-鏈（明膠） 。I 型膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)是由三條 α鏈組成的右手三螺旋結(jié)構(gòu)，形成螺旋結(jié)構(gòu)的三條 α鏈可以是相同的，也可以由兩種或三種不同的 α鏈組成，三條鏈依次交錯排列，以右手螺旋圍繞中心軸線形成一種三螺旋結(jié)構(gòu)。如果三螺旋結(jié)構(gòu)在提取過程中沒有因為酶、熱等原因發(fā)生解螺旋情況，則稱其具有三螺旋結(jié)構(gòu)，相對應(yīng)，部分解螺旋的膠原用百分含量表示。2 Ι 型膠原的檢測原理I 型膠原最典型的結(jié)構(gòu)特征是三螺旋結(jié)構(gòu)，在 α鏈圍繞中心軸線形成 的三螺旋結(jié)構(gòu)中，所有的甘氨酸位于螺旋的中心，體積較大的側(cè)鏈占據(jù)外圍區(qū)域。這種氨基酸組成有利于三條單鏈圍繞軸線緊密纏繞。自然的三螺旋具有抵抗如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的能力，只能被特異的膠原酶水解。因此可以用酶法判斷 I 型膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)。3 測定步驟43.1 試樣制備3.1.1 膠原原樣的試樣前處理方法稱取 1g 樣品，精確到 0.1mg，加適量 0.5M 乙酸溶解，定容至 10mL。取 10mL 液體樣品，磁力攪拌器攪拌 4h，離心 5min，取上清液分裝，在 4℃保存，備用。3.1.2 膠原制品的試樣前處理方法支架材料：將膠原支架裁剪成尺寸為 10 mm×10 mm×24 mm 的試樣，浸泡在 PBS 溶液中，以備實(shí)驗使用。按 7.1.1 操作。 補(bǔ)片：將膠原補(bǔ)片裁剪成尺寸為 10 mm×10 mm×24 mm 的試樣；再將裁剪后的試樣清洗浸泡在 0.1%~40% (W/V)的堿溶液中，浸泡 0.5 ~ 24h。清洗至 PH 為 5 ~ 8 后生理鹽水浸泡約 0.5 - 48h，瀝去多余水分，2 ~ 8℃組織搗碎后分散進(jìn)酶解液中， 2 ~ 40℃環(huán)境酶解1 ~ 72h；酶解完畢后調(diào) PH 值至 7 ~ 13，2 - 40℃靜置 2 ~ 24h；30~150 目濾網(wǎng)過濾，去除未酶解物。20%-50%(W/V) 鹽溶液鹽析，收集固形物，截留分子量為 4000~8000 的透析袋透析，去除多余離子和雜質(zhì)，獲得多型膠原，最后將多型膠原混合物分散至水中，調(diào) pH值至 1~5，30~150 目濾網(wǎng)過濾，去除析出物，將濾液鹽析后透析，即可得到膠原。按7.1.1 操作。敷料：將膠原敷料裁剪成尺寸為 10 mm×10 mm×24 mm 的試樣，浸泡在 PBS 溶液中，以備實(shí)驗使用。按 7.1.1 操作。3.2 前處理將待測的 7.1 的樣品平均分成兩組，每組兩只試管。一組于 60℃水浴進(jìn)行加熱30min，稱 A 管，另一組暫不做處理，稱為 B 管。將兩組樣品中分別加入 10 000 ~ 20 000 U/g 胃蛋白酶溶液，在 20℃（酶最適溫度）反應(yīng) 5min 后取出。取 A、B 反應(yīng)液，加入樣品制備液，100℃加熱 5min 以使蛋白質(zhì)變性，制備電泳樣品。3.3 分離膠制備按表 1 配制 12%分離膠 20mL，混勻后加入到長短玻璃間的縫隙中，約 60mm~70mm高。沿長玻璃板板壁緩慢注入約 5mm 高的水，進(jìn)行水封。約 30min 后，凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合，傾倒去水封層的水，再用濾紙條吸去多5余水分。3.4 濃縮膠制備按表 1 配制 3 % 濃縮膠 10 mL，混勻后加入到已聚合的分離膠上方，直至距離短玻璃板上緣約 5mm 處。輕輕將樣品槽模板插入濃縮膠內(nèi)，約 30min 后凝膠聚合，再放置20min ~ 30min，使凝膠老化。表 1 不連續(xù)凝膠的凝膠配方（垂直電泳）貯液 3%濃縮膠 12%分離膠丙烯酰胺單體貯備液 2.5 mL 12 mL濃縮膠緩沖液貯備液 0.6 mL /分離膠緩沖液貯備液 / 7.5 mL十二烷基磺酸鈉溶液 50 μL 300 μL水 1.82 mL 10 μLN, N, N’, N’-四甲基乙二胺溶液 5 μL 20 μL過硫酸銨溶液 25 μL 200 μL五、主要工作過程1、組成標(biāo)準(zhǔn)起草小組標(biāo)準(zhǔn)制定任務(wù)下達(dá)后，2014 年 6 月，組成了標(biāo)準(zhǔn)起草工作組，明確了任務(wù)要求，安排了工作進(jìn)度，成立了標(biāo)準(zhǔn)起草工作小組。會議研究討論了當(dāng)前 I 型膠原三股螺旋完整性構(gòu)象的多種檢測方法，但或多或少都會有一定的局限性，急需建立統(tǒng)一有效的的標(biāo)準(zhǔn)化檢測方法，并提出了聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定動物源性 I 型膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)的可行性。2、開展相關(guān)調(diào)研情況為了更好的確定動物源性 I 型膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)測定的方法，判定聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定動物源性 I 型膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)的可行性，從 2014 年中旬開始，起草工作小組歷時一年的時間，開展了國內(nèi)外相關(guān)法律法規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)情況調(diào)研工作。在調(diào)研中，主要查閱了國內(nèi)外涉及膠原的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。國內(nèi)相關(guān)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)有 GB/T 22729-2008《海洋魚低聚肽粉》 、YY/T 1453-2016 《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 Ⅰ型膠原蛋白表征方法》 。國際上膠原的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及檢測方法如下所示：標(biāo)準(zhǔn)號 標(biāo)準(zhǔn)名稱 備注6ASTMF2212-2009 作為組織工程醫(yī)療產(chǎn)品用外科植入物和底層原 材料的 I 型膠原特性的標(biāo)準(zhǔn)指南 美國材料實(shí)驗協(xié)會ASTMF2212-2011 醫(yī)用組織加固產(chǎn)品外科移植和培養(yǎng)基中作為開 始材料的類型 I 膠原質(zhì)的特性描述標(biāo)準(zhǔn)指南 美國材料實(shí)驗協(xié)會DIN58924-2009 止血學(xué) VWF 的膠原質(zhì)粘合活性的測定用參考方 法 德國的標(biāo)準(zhǔn)化主管機(jī) 關(guān)（非政府）NFV04-415-2002 肉 ,肉制品和水產(chǎn)品.L 羥基脯氨酸含量的測定 法國標(biāo)準(zhǔn)（法國標(biāo)準(zhǔn) 化協(xié)會）NFV59-201-1988 骨膠原.羥基脯氨酸含量的測定 法國標(biāo)準(zhǔn)（法國標(biāo)準(zhǔn) 化協(xié)會）NFV59-202-1988 骨膠原.氮含量的測定 法國標(biāo)準(zhǔn)（法國標(biāo)準(zhǔn) 化協(xié)會）NFV59-203-1988 骨膠原.干物質(zhì)的測定.脫水重量的損失 法國標(biāo)準(zhǔn)（法國標(biāo)準(zhǔn) 化協(xié)會）NFV59-204-1988 骨膠原.礦物質(zhì)的測定.灰分 法國標(biāo)準(zhǔn)（法國標(biāo)準(zhǔn) 化協(xié)會）STAS9065/13-81 肉和肉品膠原蛋白含量檢測 羅馬尼亞標(biāo)準(zhǔn)可食用明膠檢測標(biāo)準(zhǔn) 美國明膠生產(chǎn)商院C.A.S.NO.9000-70-8 國際通用可食用明膠出口標(biāo)準(zhǔn) 國際食品添加劑出口 委員會標(biāo)準(zhǔn) JECFACAC/GL 21 - 1997《建立及應(yīng)用食品微生物標(biāo)準(zhǔn)的指南和準(zhǔn)則》（《Principles and Guidelines for the Establishmentand Application of Microbiological Criteria Related to Foods》）國際法典標(biāo)準(zhǔn)日本膠原蛋白肽品質(zhì)規(guī)格 日本明膠·膠原蛋白肽 工業(yè)協(xié)會3、標(biāo)準(zhǔn)起草完善過程依據(jù) GB/T 1.1—2000《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第 1 部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》 、GB/T 1.2—2002《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第 2 部分：標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)范性技術(shù)要素內(nèi)容的確定方法》等標(biāo)準(zhǔn)編制要求，對《動物源性 I 型膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)測定》標(biāo)準(zhǔn)開展了研制工作，起草組分別于 2014 年 9 月、2015 年 4 月、2016 年 5 月、2017 年 8 月召開五次工作組會議，并以電話、郵件形式多次與相關(guān)專家進(jìn)行溝通，先后討論了標(biāo)準(zhǔn)的地位、起草原則、框架、基本內(nèi)容、核心條款等內(nèi)容，并征求了企業(yè)、協(xié)會等相關(guān)單位意見，完成了《動物源性 I型膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)測定—聚丙烯酰胺凝膠電泳法》國家標(biāo)準(zhǔn)（草案） 。在此基礎(chǔ)上，2018 年 11 月征求了專家意見，起草組按照專家意見對標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容進(jìn)行了修改完善，形成了標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿。六、方法驗證及結(jié)果7驗證單位 試樣 方法 結(jié)果山東省淡水漁業(yè)研究院多種淡水魚類提取的膠原試樣 聚丙烯酰胺凝膠電泳法 可行淮海工學(xué)院魚皮、魚鱗、魚骨酸溶性膠原蛋白及酶促溶性膠原試樣聚丙烯酰胺凝膠電泳法 可行七、與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系本標(biāo)準(zhǔn)符合國家現(xiàn)行法律、法規(guī)、規(guī)章和強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)的要求，本標(biāo)準(zhǔn)有助于《動物源性 I 型膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)測定—聚丙烯酰胺凝膠電泳法》等相關(guān)法律、法規(guī)、規(guī)章和強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施不涉及對現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的廢止情況。八、標(biāo)準(zhǔn)屬性的建議本標(biāo)準(zhǔn)屬于基礎(chǔ)管理標(biāo)準(zhǔn)，建議作為推薦性標(biāo)準(zhǔn)批準(zhǔn)發(fā)布。九、貫徹國家標(biāo)準(zhǔn)的要求和措施建議本標(biāo)準(zhǔn)可作為檢測動物源性 I 型膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)完整性的推薦標(biāo)準(zhǔn)。