1動物源性 I 型膠原蛋白成分測定 聚丙烯酰胺凝膠電泳法國家標準編 制 說 明（征求意見稿）一、任務來源本國家標準的制定任務列入國家標準化管理委員會國標委綜合201841 號 ，項目編號“20180923-T-424”。本項任務由中國標準化研究院提出并歸口，定于 2020 年完成。本標準由中國科學院海岸帶研究所等單位共同組成。二、目的和意義膠原蛋白（Collagen ）是多細胞生物中含量最豐富、分布最廣泛的蛋白質種類之一。在生物體內(nèi)，膠原蛋白與聚多糖等成分一起形成精密有序的細胞間網(wǎng)絡結構細胞外基質（extracellular matrix，ECM） ，對機體細胞的發(fā)育、遷移以及機體組織的形成和功能發(fā)揮等均產(chǎn)生重要作用。有關膠原的研究與應用歷史悠久。5000 多年前，當如毛發(fā)之類的材料首次作為醫(yī)用縫合線時，膠原“腸線” 便得到了相應的發(fā)展，并用于傷口縫合。人們最初是通過鞣制膠原將皮革和皮毛進行防腐處理，以便得到易于保存、干燥后仍能機械助軟的皮革。但是，由于膠原來源、結構與性能的復雜性，加上測試與研究設備的局限性，盡管人們已經(jīng)廣泛使用了膠原，但對其結構和性能的研究仍然不足。近年來，隨著現(xiàn)代科學與技術的發(fā)展，相關領域的研究不斷深入；同時分析與測試設備的日臻完善，也為膠原的深入研究創(chuàng)造了條件。另外，在資源、環(huán)境及可持續(xù)發(fā)展面臨的問題日益嚴峻的今天，作為一種可再生資源的膠原，備受人們的關注，表現(xiàn)在人們對膠原所進行的應用研究開發(fā)工作逐漸增多，也許多方面均有不少突破。膠原已廣泛應用于可食性包裝材料、可降解日用品材料、膠原蛋白合成纖維等領域，由于膠原蛋白具有良好的生物相容性并能促進機體細胞的生長、遷移和增生，因此被廣泛應用于生物醫(yī)學材料、醫(yī)學組織工程和醫(yī)學美容等領域。如膠原海綿在創(chuàng)傷修復、快速止血中的應用 ；膠原膠在面部皮膚除皺、靶向藥物制備及藥物緩釋中的應用；膠原復合材料在人造血管、人造皮膚和骨骼、人工眼角膜移植等醫(yī)學組織工程中的應用。 2018 年我國醫(yī)療器械市場 5650 億元，其中生物植入材料約 722 億，膠原基生物植入材料約 377 億（止血材料約 19 億） ，年復合增長率 21.67 %。2018 年我國化妝品市場規(guī)模 1800 億元，含膠原化妝品 125 億元(占 7 %)，2年增長率 12 %；市場已有含膠原化妝品 620 種，國產(chǎn)產(chǎn)品僅 32 種，約占 5 %。膠原的種類很多，到目前為止，已經(jīng)報道的基于化學結構上不同類型的膠原有 27 種，其中 I 型膠原占全部蛋白含量的 90%以上，因此，在生物醫(yī)學領域，研究最廣泛的是 I 型膠原。I 型膠原主要分布于骨、肌腱、韌帶、皮膚等組織，目前 I 型膠原大多數(shù)是從哺乳動物的皮膚、肌腱與骨骼中提取，例如牛皮、牛肌腱、以及豬和牛骨。另外，還有部分學者從海洋和水產(chǎn)魚類的皮膚中提取 I 型膠原。I 型膠原來源廣泛，價廉易得，且性能優(yōu)良，是一種不可多得的天然生物高分子材料 。I 型膠原的結構由 2 條相同的 1鏈和 1 條不同的 2鏈組成，33% 的甘氨酸、10% 的脯氨酸和的 10% 羥脯氨酸構成一條具有特征性的重復構型膠原肽鏈（ 鏈） ，這種獨特的氨基酸序列提供了一個 II 型聚脯氨酸的左手螺旋結構，在膠原形成的過程中，3 條平行的 II 型聚脯氨酸的左手螺旋結構互相旋轉纏繞形成一條右手三螺旋結構，被稱為原膠原分子，一個膠原纖維片段或是原纖維包含 5 個平行的原膠原分子，氫鍵提供螺旋結構最初的結合，共價鍵提供附加的穩(wěn)定。I 型膠原是一種最重要的細胞外基質蛋白，在支持與連接組織中起到重要的作用。由于其獨特的纖維狀結構及優(yōu)良的生物學特性，使其得到廣泛的關注。其優(yōu)點可以集中體現(xiàn)為：良好的生物相容性、移除端肽后較低的抗原性、具有一定的粘附性和纖維不松脆性、吸水性、可縫合、較高的孔隙率可以為新生組織提供空間、其纖維可以整合進新生組織基質、可以與其他材料相結合、液壓可以被轉導等。膠原支架或凝膠如果應用于體內(nèi)的話，會承受來自人體的生理或病理狀態(tài)下的機械載荷，因此，保持它們結構和功能就顯得尤為重要，另外，三螺旋結構完整性的 I 型膠原，具備較低的細胞毒性、更優(yōu)良的生物相容性和生物可降解性，對于其在功能化妝品、功能食品和生物醫(yī)用材料和組織工程如軟骨組織工程、血管組織工程、人工皮膚肌腱等商業(yè)、生物領域的應用具有重要意義。目前，對于膠原三股螺旋完整性構象的檢測方法眾多，但或多或少都會有一定的局限性，急需建立統(tǒng)一有效的的標準化檢測方法。三、標準制定原則（一）標準編制原則本標準按照 GB/T1.1-2009 給出的規(guī)則起草。標準編制遵循 “統(tǒng)一性、協(xié)調(diào)性、適用性、一致性、規(guī)范性”的原則。本標準是在廣泛調(diào)查研究的基礎上制定的。（二）標準制訂主要依據(jù)31、標準編寫遵循 GB1.1-2009標準化工作導則 第 1 部分：標準的結構和編寫規(guī)則的有關要求。2、標準編寫內(nèi)容參考我國與農(nóng)產(chǎn)品相關的法規(guī)、標準，包括 GB/T 9695.23 肉與肉制品羥脯氨酸含量測定、GB/T 23527 蛋白酶制劑、GB/T 6682-2008 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法、GB 6011988 標準滴定溶液的配制和標定、 NYT 1663-2008 乳與乳制品中 -乳球蛋白的測定 聚丙烯酰胺凝膠電泳法、 YY/T 1453-2016 組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 型膠原蛋白表征方法等。四、標準主要技術內(nèi)容1 術語與定義I 型膠原是指在廣泛存在于動物體中的一種結構蛋白，起到支撐作用并能聚集成纖維，是膠原纖維組分中的一部分。它來源于表達在膠原 鏈上的 COLIA1 和 COLIA2 基因。所有的膠原均具有由三條聚肽鏈單元組成的三螺旋結構，其分子結構中具有典型的“Gly-X-Y”三肽重復序列（脯氨酸經(jīng)常占據(jù) X 位，羥脯氨酸占據(jù) Y 位） 。I 型膠原富含甘氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸和 4-羥脯氨酸，含少量的硫且不含 L-色氨酸。羥脯氨酸是一種膠原蛋白特有的氨基酸，約占膠原蛋白的 9% - 13%，I 型膠原蛋白纖維能自然的溶解在稀酸和稀堿中。加熱到 40以上后膠原蛋白可變性成單 -鏈（明膠） 。I 型膠原的三螺旋結構是由三條 鏈組成的右手三螺旋結構，形成螺旋結構的三條 鏈可以是相同的，也可以由兩種或三種不同的 鏈組成，三條鏈依次交錯排列，以右手螺旋圍繞中心軸線形成一種三螺旋結構。如果三螺旋結構在提取過程中沒有因為酶、熱等原因發(fā)生解螺旋情況，則稱其具有三螺旋結構，相對應，部分解螺旋的膠原用百分含量表示。2 型膠原的檢測原理I 型膠原最典型的結構特征是三螺旋結構，在 鏈圍繞中心軸線形成 的三螺旋結構中，所有的甘氨酸位于螺旋的中心，體積較大的側鏈占據(jù)外圍區(qū)域。這種氨基酸組成有利于三條單鏈圍繞軸線緊密纏繞。自然的三螺旋具有抵抗如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的能力，只能被特異的膠原酶水解。因此可以用酶法判斷 I 型膠原三股螺旋結構。3 測定步驟43.1 試樣制備3.1.1 膠原原樣的試樣前處理方法稱取 1g 樣品，精確到 0.1mg，加適量 0.5M 乙酸溶解，定容至 10mL。取 10mL 液體樣品，磁力攪拌器攪拌 4h，離心 5min，取上清液分裝，在 4保存，備用。3.1.2 膠原制品的試樣前處理方法支架材料：將膠原支架裁剪成尺寸為 10 mm×10 mm×24 mm 的試樣，浸泡在 PBS 溶液中，以備實驗使用。按 7.1.1 操作。 補片：將膠原補片裁剪成尺寸為 10 mm×10 mm×24 mm 的試樣；再將裁剪后的試樣清洗浸泡在 0.1%40% (W/V)的堿溶液中，浸泡 0.5 24h。清洗至 PH 為 5 8 后生理鹽水浸泡約 0.5 - 48h，瀝去多余水分，2 8組織搗碎后分散進酶解液中， 2 40環(huán)境酶解1 72h；酶解完畢后調(diào) PH 值至 7 13，2 - 40靜置 2 24h；30150 目濾網(wǎng)過濾，去除未酶解物。20%-50%(W/V) 鹽溶液鹽析，收集固形物，截留分子量為 40008000 的透析袋透析，去除多余離子和雜質，獲得多型膠原，最后將多型膠原混合物分散至水中，調(diào) pH值至 15，30150 目濾網(wǎng)過濾，去除析出物，將濾液鹽析后透析，即可得到膠原。按7.1.1 操作。敷料：將膠原敷料裁剪成尺寸為 10 mm×10 mm×24 mm 的試樣，浸泡在 PBS 溶液中，以備實驗使用。按 7.1.1 操作。3.2 前處理將待測的 7.1 的樣品平均分成兩組，每組兩只試管。一組于 60水浴進行加熱30min，稱 A 管，另一組暫不做處理，稱為 B 管。將兩組樣品中分別加入 10 000 20 000 U/g 胃蛋白酶溶液，在 20（酶最適溫度）反應 5min 后取出。取 A、B 反應液，加入樣品制備液，100加熱 5min 以使蛋白質變性，制備電泳樣品。3.3 分離膠制備按表 1 配制 12%分離膠 20mL，混勻后加入到長短玻璃間的縫隙中，約 60mm70mm高。沿長玻璃板板壁緩慢注入約 5mm 高的水，進行水封。約 30min 后，凝膠與水封層間出現(xiàn)折射率不同的界線，則表示凝膠完全聚合，傾倒去水封層的水，再用濾紙條吸去多5余水分。3.4 濃縮膠制備按表 1 配制 3 % 濃縮膠 10 mL，混勻后加入到已聚合的分離膠上方，直至距離短玻璃板上緣約 5mm 處。輕輕將樣品槽模板插入濃縮膠內(nèi)，約 30min 后凝膠聚合，再放置20min 30min，使凝膠老化。表 1 不連續(xù)凝膠的凝膠配方（垂直電泳）貯液 3%濃縮膠 12%分離膠丙烯酰胺單體貯備液 2.5 mL 12 mL濃縮膠緩沖液貯備液 0.6 mL /分離膠緩沖液貯備液 / 7.5 mL十二烷基磺酸鈉溶液 50 L 300 L水 1.82 mL 10 LN, N, N, N-四甲基乙二胺溶液 5 L 20 L過硫酸銨溶液 25 L 200 L五、主要工作過程1、組成標準起草小組標準制定任務下達后，2014 年 6 月，組成了標準起草工作組，明確了任務要求，安排了工作進度，成立了標準起草工作小組。會議研究討論了當前 I 型膠原三股螺旋完整性構象的多種檢測方法，但或多或少都會有一定的局限性，急需建立統(tǒng)一有效的的標準化檢測方法，并提出了聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定動物源性 I 型膠原蛋白三股螺旋結構的可行性。2、開展相關調(diào)研情況為了更好的確定動物源性 I 型膠原蛋白三股螺旋結構測定的方法，判定聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定動物源性 I 型膠原蛋白三股螺旋結構的可行性，從 2014 年中旬開始，起草工作小組歷時一年的時間，開展了國內(nèi)外相關法律法規(guī)及標準情況調(diào)研工作。在調(diào)研中，主要查閱了國內(nèi)外涉及膠原的相關標準。國內(nèi)相關產(chǎn)品標準有 GB/T 22729-2008海洋魚低聚肽粉 、YY/T 1453-2016 組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 型膠原蛋白表征方法 。國際上膠原的相關標準及檢測方法如下所示：標準號 標準名稱 備注6ASTMF2212-2009 作為組織工程醫(yī)療產(chǎn)品用外科植入物和底層原 材料的 I 型膠原特性的標準指南 美國材料實驗協(xié)會ASTMF2212-2011 醫(yī)用組織加固產(chǎn)品外科移植和培養(yǎng)基中作為開 始材料的類型 I 膠原質的特性描述標準指南 美國材料實驗協(xié)會DIN58924-2009 止血學 VWF 的膠原質粘合活性的測定用參考方 法 德國的標準化主管機 關（非政府）NFV04-415-2002 肉 ,肉制品和水產(chǎn)品.L 羥基脯氨酸含量的測定 法國標準（法國標準 化協(xié)會）NFV59-201-1988 骨膠原.羥基脯氨酸含量的測定 法國標準（法國標準 化協(xié)會）NFV59-202-1988 骨膠原.氮含量的測定 法國標準（法國標準 化協(xié)會）NFV59-203-1988 骨膠原.干物質的測定.脫水重量的損失 法國標準（法國標準 化協(xié)會）NFV59-204-1988 骨膠原.礦物質的測定.灰分 法國標準（法國標準 化協(xié)會）STAS9065/13-81 肉和肉品膠原蛋白含量檢測 羅馬尼亞標準可食用明膠檢測標準 美國明膠生產(chǎn)商院C.A.S.NO.9000-70-8 國際通用可食用明膠出口標準 國際食品添加劑出口 委員會標準 JECFACAC/GL 21 - 1997建立及應用食品微生物標準的指南和準則（Principles and Guidelines for the Establishmentand Application of Microbiological Criteria Related to Foods）國際法典標準日本膠原蛋白肽品質規(guī)格 日本明膠·膠原蛋白肽 工業(yè)協(xié)會3、標準起草完善過程依據(jù) GB/T 1.12000標準化工作導則 第 1 部分：標準的結構和編寫規(guī)則 、GB/T 1.22002標準化工作導則 第 2 部分：標準中規(guī)范性技術要素內(nèi)容的確定方法等標準編制要求，對動物源性 I 型膠原三股螺旋結構測定標準開展了研制工作，起草組分別于 2014 年 9 月、2015 年 4 月、2016 年 5 月、2017 年 8 月召開五次工作組會議，并以電話、郵件形式多次與相關專家進行溝通，先后討論了標準的地位、起草原則、框架、基本內(nèi)容、核心條款等內(nèi)容，并征求了企業(yè)、協(xié)會等相關單位意見，完成了動物源性 I型膠原三股螺旋結構測定聚丙烯酰胺凝膠電泳法國家標準（草案） 。在此基礎上，2018 年 11 月征求了專家意見，起草組按照專家意見對標準內(nèi)容進行了修改完善，形成了標準征求意見稿。六、方法驗證及結果7驗證單位 試樣 方法 結果山東省淡水漁業(yè)研究院多種淡水魚類提取的膠原試樣 聚丙烯酰胺凝膠電泳法 可行淮海工學院魚皮、魚鱗、魚骨酸溶性膠原蛋白及酶促溶性膠原試樣聚丙烯酰胺凝膠電泳法 可行七、與有關的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強制性國家標準的關系本標準符合國家現(xiàn)行法律、法規(guī)、規(guī)章和強制性國家標準的要求，本標準有助于動物源性 I 型膠原三股螺旋結構測定聚丙烯酰胺凝膠電泳法等相關法律、法規(guī)、規(guī)章和強制性國家標準的實施。本標準的實施不涉及對現(xiàn)行標準的廢止情況。八、標準屬性的建議本標準屬于基礎管理標準，建議作為推薦性標準批準發(fā)布。九、貫徹國家標準的要求和措施建議本標準可作為檢測動物源性 I 型膠原蛋白三螺旋結構完整性的推薦標準。