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1國家市場監(jiān)督管理總局中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會ICS 07.080A 21中 華 人 民 共 和 國 國 家 標(biāo) 準(zhǔn)GB/T XXXXX—201X 微生物誘變育種致遺傳物質(zhì)損傷強(qiáng)度檢測FACS-umu 測試法Quantification of microbial DNA damage caused by mutagenesisFACS-umu-test（征求意見稿）201X-XX-XX 發(fā)布 201X-XX-XX 實施發(fā) 布發(fā) 布GB/T ××××—201× 前 言本標(biāo)準(zhǔn)按照 GB/T 1.1—2009 給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位： 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人： GB/T ××××—201×1微生物誘變育種致遺傳物質(zhì)損傷強(qiáng)度測定 umu法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了微生物誘變育種致遺傳物質(zhì)損傷強(qiáng)度測定 umu 法的原理、試劑或材料、儀器設(shè)備、測定步驟和結(jié)果分析。本標(biāo)準(zhǔn)適用于物理誘變源和化學(xué)誘變源造成的微生物遺傳物質(zhì)損傷測定。2 規(guī)范性引用文件 GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法YY/T 0588 流式細(xì)胞儀3 術(shù)語與定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1 誘變 mutagenesis通過人為的措施誘導(dǎo)遺傳基因產(chǎn)生變異的過程。注：常用的誘變方法包括物理誘變和化學(xué)誘變等。3.2 遺傳物質(zhì)損傷 DNA damage化學(xué)或物理誘變源對遺傳物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的改變。3.2 遺傳物質(zhì)損傷強(qiáng)度 DNA damage strength當(dāng)細(xì)胞受到 DNA 損傷時會發(fā)生應(yīng)急修復(fù)（SOS 修復(fù)） ，使其以突變?yōu)榇鷥r繼續(xù)存活下去。4 原理在 DNA 發(fā)生損傷時，細(xì)菌通過 lexA 和 recA 的共同作用，引起體內(nèi)的 SOS 響應(yīng)。DNA 損傷程度越高，SOS 響應(yīng)越強(qiáng)。通過將 SOS 系統(tǒng)調(diào)控基因與指示基因相融合，檢測指示基因編碼蛋白活性或信號強(qiáng)度，即可得到 SOS 基因的表達(dá)強(qiáng)度，表征 DNA 損傷強(qiáng)度和環(huán)境致癌物質(zhì)濃度。在 umu 測試中，將編碼 DNA 聚合酶 V 中重要組分的 umuC 基因與編碼 β-半乳糖苷酶的 lacZ 基因融合，導(dǎo)入到Salmonella typhimurium 中，通過顯色法檢測 β-半乳糖苷酶活性來測定 SOS 誘導(dǎo)強(qiáng)度。然而，由于誘變過程會造成細(xì)胞的死亡，死細(xì)胞會對測試誘變損傷能力的評估造成影響。為排除這一影響，F(xiàn)ACS-umu 測試方法利用流式細(xì)胞分選技術(shù)測定活細(xì)胞遺傳物質(zhì)損傷強(qiáng)度，其測試原理為：熒光素-2-β-D-半乳糖苷（FDG ）本身不具有熒光，其被 β-半乳糖苷酶水解后的產(chǎn)物熒光素具有熒光。碘化丙啶GB/T ××××—201×2（Propidium iodide，PI）是一種 DNA 熒光染料，只能進(jìn)入失去細(xì)胞膜選擇通透性的細(xì)胞，即死細(xì)胞中，因此可以用于區(qū)分活死細(xì)胞。采用 FDG 作為 β-半乳糖苷酶的熒光底物，利用 PI 作為死細(xì)胞染料，通過采用流式細(xì)胞儀測定誘變后活細(xì)胞的 β-半乳糖苷酶活性，從而得到活細(xì)胞的 DNA 損傷強(qiáng)度。5 試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。5.1 水：GB/T6682二級。5.2 菌種：鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium），包含表達(dá) umuC’-’lacZ 基因和氨芐青霉素抗性基因的 pSK1002 質(zhì)粒。5.3 TGA 培養(yǎng)基稱取胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，HEPES 11.9 g，加入980 ml 水溶解，pH調(diào)整為7.0 ± 0.2，定溶到1000 ml。121℃，15 min高壓滅菌。溶解2g葡萄糖在20ml去離子水中單獨滅菌。滅菌后按等比例混合兩個溶液，無菌條件下每升冷卻的TGA培養(yǎng)基中加入50mg 氨芐青霉素。改溶液可以在-20℃保存4周。5.4 10×TGA培養(yǎng)基包含10倍濃度的TGA溶液，可以在4℃保存14天。5.5 熒光素-2-β- D-吡喃半乳糖苷（ Fluorescein di-β-D-galactopyranoside，F(xiàn)DG）溶液在10 ml含體積比為1% DMSO和1%乙醇的水中溶解13.13 mgFDG，F(xiàn)DG終濃度為2mM，分裝后保存在-20℃冰箱中。使用前在37 ℃預(yù)熱15 min以上。5.6 碘化丙啶（Propidium iodide，PI）溶液在10 mlPBS溶液中溶解6.68 mgPI，配成濃度為1mM的PI溶液。用移液槍吸取10 ul濃度為1 mM的PI儲備液，溶于10 mlPBS溶液中，配成濃度1 uM的PI溶液，作為PI工作液。于4℃保存，使用前在冰上放置預(yù)冷。6 儀器設(shè)備6.1 恒溫水浴鍋（37±1）℃；6.2 pH 計；0.1；6.3 電子天平；0.01；6.4 高速離心機(jī)；6.5 流式細(xì)胞儀；6.6 恒溫震蕩搖床，溫度可實現(xiàn)（28±1）℃和（37±1）℃，轉(zhuǎn)速在 125r/min 到 150r/min；7 測定步驟GB/T ××××—201×37.1 測試菌過夜培養(yǎng)物制備在三角瓶中裝入2 0ml TGA培養(yǎng)基用透氣無菌瓶塞封口，滅菌儲存；融化凍存的測試菌，在凍存管中加入1 ml TGA培養(yǎng)基，3 000 g離心凍存管中的測試菌10 min，丟棄上清液，用1 mLTGA培養(yǎng)基重懸測試菌，用0.5 ml測試菌重懸液接種到含TGA培養(yǎng)基的三角瓶中，在（37±1）℃搖動培養(yǎng)過夜（不超過12 h）。7.2 誘變測試微生物樣品制備用新鮮的TGA培養(yǎng)基（37℃）將過夜培養(yǎng)的測試菌稀釋10倍。繼續(xù)在37±1）℃搖動培養(yǎng)1.5天。在（600±20）nm用1 cm比色皿檢測光密度，以TGA培養(yǎng)基作為空白對照，誘變測試微生物樣品應(yīng)處于對數(shù)生長期。7.3 誘變7.3.1 化學(xué)誘變根據(jù)測試需求，宜通過文獻(xiàn)等資料或設(shè)置預(yù)實驗，確定化學(xué)誘變劑的種類和濃度。將10 ul不同濃度的化學(xué)誘變劑加入到1 ml誘變樣品（9.2 ）中，置于1.5 ml的EP管，在37±1℃，200 r/min震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。對照為在1ml TGA培養(yǎng)基中加入10ul DMSO。7.3.2 物理誘變根據(jù)測試需求，宜通過文獻(xiàn)等資料或設(shè)置預(yù)實驗，確定物理誘變條件。取100 ul 接種物（9.2）進(jìn)行物理誘變處理，對照為沒有進(jìn)行物理誘變處理的樣品。處理后的樣品和對照轉(zhuǎn)移到1.5 ml EP管中，在 37±1℃，200 r/min震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2 h。7.4 FDG和PI染色取化學(xué)或物理誘變后的測試樣品50 ?l置于1.5 ml的EP 管中，在37 ℃預(yù)熱5 min，加入37 ℃預(yù)熱的FDG溶液 50 ul，迅速溫和混勻后，置于 37 ℃水浴中2 min，使FDG滲透進(jìn)入細(xì)胞。之后迅速加入500 ?l的PI溶液，將混合液放置于冰上反應(yīng)1 h，在進(jìn)行流式細(xì)胞測定前一直置于冰上。7.5 流式細(xì)胞儀測定使用流式細(xì)胞儀對染色后樣品進(jìn)行流式分析。采用激發(fā)波長為488 nm，對于FDG水解產(chǎn)物熒光素的熒光強(qiáng)度測定接收波長為525±30 nm （FL-1通道），PI 染色熒光測定接收波長為670 nm （FL-2通道）。測定細(xì)胞總數(shù)為5000到10000個細(xì)胞。8 結(jié)果分析8.1 閾值設(shè)定通過前向角散射光FSC和側(cè)向角散射光SSC圈出目標(biāo)菌體，以去除多細(xì)胞粘連對結(jié)果的影響。通過單獨的PI 染色，測定FL-1通道和FL-2通道的熒光值，其FL-1通道熒光值作為背景值，即為FDG染色GB/T ××××—201×4陰性細(xì)胞。通過單獨的FDG染色，測定FL-1通道和FL-2通道的熒光值，其FL-2通道熒光值作為背景值，即為PI染色陰性細(xì)胞。對于FDG和PI同時染色的樣品，選取FDG染色和PI染色陽性為目標(biāo)細(xì)胞群，用于后續(xù)數(shù)據(jù)處理。8.2 結(jié)果計算按照式（1）進(jìn)行計算：……………………………………………………………（1）????=????/????式中：Fi——SOS誘導(dǎo)系數(shù)；Am——誘變源處理樣品的平均FDG水解產(chǎn)物熒光素相對熒光值；Ac——對照樣品的平均FDG水解產(chǎn)物熒光素相對熒光值。_________________________________