ICS 07.080A 21中 華 人 民 共 和 國 國 家 標(biāo) 準(zhǔn)GB/T XXXXXXXXX基因表達(dá)的測定 蛋白印跡法Determination of gene expression-Western blot（征求意見稿）XXXX - XX - XX 發(fā)布 XXXX - XX - XX 實施GB/T XXXXXXXXX1前言本標(biāo)準(zhǔn)按照 GB/T 1.12009 給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：GB/T XXXXXXXXX2GB/T XXXXXXXXX3基因表達(dá)的測定 蛋白印跡法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了蛋白印跡（Western blot）法檢測目的基因表達(dá)的原理、試劑或材料、儀器設(shè)備、測定步驟和結(jié)果分析。本標(biāo)準(zhǔn)適用動植物組織或體外培養(yǎng)細(xì)胞目的基因表達(dá)的檢測。2 規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3 術(shù)語、定義和縮略語下列術(shù)語、定義和縮略語適用于本文件。3.1 術(shù)語和定義3.1.1 基因表達(dá) gene expression將儲存在 DNA 分子中的遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子的過程。3.2 縮略語3.2.1 Tris：三羥甲基氨基甲烷。3.2.2 SDS：十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate）。3.2.3 SDS-PAGE：十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）。3.2.4 ECL：電化學(xué)發(fā)光（electrogenerated chemiluminescence）。3.2.5 BSA：牛血清白蛋白（bull serum albumin）。4 原理SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)印膜上后，先用抗目的蛋白質(zhì)的第一抗體（一抗）與轉(zhuǎn)印膜上的蛋白質(zhì)反應(yīng)，然后利用帶標(biāo)記的抗一抗的第二抗體（二抗）與一抗反應(yīng)，最根據(jù)二抗標(biāo)記物的特性，檢測出微量蛋白質(zhì)的方法，即蛋白印跡法（Western blot）。GB/T XXXXXXXXX45 試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。5.1 水：GB/T6682二級。5.2 RIPA裂解液（適用于動物組織或細(xì)胞）：見附錄A中A.1。5.3 植物提取液將10 mL TCA和70 µL -巰基乙醇加入到70 mL丙酮中，并定容至100 mL。5.4 植物裂解液（適用于植物組織或細(xì)胞）：見附錄A中A.2。5.5 1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8將18.15 g Tris-base加入80 mL水溶解，用1 mol/L HCl調(diào)pH至8.8，然后用水定容至100 mL。5.6 1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8稱取12.1g Tris-base加入80 mL水溶解，用1 mol/L HCl調(diào)pH至6.8，然后用水定容至100 mL。5.7 30%（m/v）丙烯酰胺貯存液稱取29 g丙烯酰胺單體和1 g N, N-甲叉雙丙烯酰胺，加水溶解并定容至100 mL，過濾，置于棕色瓶，4 º C避光保存，2個月內(nèi)使用。5.8 10%（m/v）SDS稱取10 g SDS，加水溶解并定容至100 mL，室溫保存。5.9 10%（m/v）過硫酸銨稱取1 g過硫酸銨，加水溶解并定容至10 mL。5.10 考馬斯亮藍(lán)溶液稱100 mg考馬斯亮蘭 G250，溶于 50 mL 95%的乙醇后，再加入120 mL 85%的磷酸，用水稀釋至1 L，濾紙過濾，4保存。5.11 BSA溶液稱量干燥的BSA 10 mg，用生理鹽水配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。5.12 5×SDS上樣緩沖液取 5 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）緩沖液、2 g SDS、1.2 mL -巰基乙醇、8 mL甘油、0.02 g溴酚藍(lán)加入水中溶解，加水定容至40 mL。5.13 5×SDS-PAGE電泳緩沖液貯存液稱取23.5 g 甘氨酸和3.775 g Tris-base，加水溶解，定容至250 mL。使用時按如下比例稀釋至使用濃度：取133 mL 5×SDS-PAGE電泳緩沖液，7 mL 10 % SDS溶液，水定容至700 mL。5.14 轉(zhuǎn)膜緩沖液貯存液稱取5.82 g Tris-base，2.93 g甘氨酸，0.375 g SDS，加水溶解，定容至800mL，再加200mL甲醇混勻，4 °C保存。5.15 2 mol/L NaCl溶液將117 g NaCl加入水溶解，定容至1000 mL。5.16 1 mol/L Tris-HCl，pH 7.5將12.1 g Tris-base加入水溶解，用1 mol/L HCl調(diào)pH至7.5，然后用水定容至100 mL，然后高壓滅菌后常溫保存。5.17 TBS溶液量取 75 mL 2 mol/L NaCl溶液和10 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液，加水定容至1 L。5.18 TBST溶液量取 75 mL 2 mol/L NaCl溶液、10 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液和1 mL Tween-20，加水定容至1 L。GB/T XXXXXXXXX56 儀器設(shè)備6.1 電泳儀。6.2 轉(zhuǎn)膜儀。6.3 垂直電泳槽。6.4 天平：感量 0.001 g。6.5 脫色搖床。6.6 冷凍離心機(jī)：最大離心力 12000 rpm 以上。6.7 化學(xué)發(fā)光儀/紅外熒光成像系統(tǒng)。6.8 振蕩器。6.9 真空干燥器。7 測定步驟7.1 總蛋白的提取7.1.1 動物總蛋白的提取將20 mg體外培養(yǎng)的細(xì)胞或研碎的組織轉(zhuǎn)移至1.5 mL的Eppendorf 管中，加150250 L預(yù)冷的RIPA細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），振蕩器震蕩15 s，冰浴5 min，重復(fù)震蕩-冰浴30 min后，4 °C，12000 rpm離心10 min，上清液即為細(xì)胞總蛋白。7.1.2 植物總蛋白的提取在液氮中研磨植物材料/細(xì)胞，加入樣品體積3倍的提取液在-20的條件下過夜，4 ，8000 rpm離心20 min，棄上清；加入等體積的冰浴丙酮（含 0.07 %的-巰基乙醇），搖勻，4 ，8000 rpm離心20 min，然后真空干燥沉淀，備用；上樣前加入裂解液，室溫放置30 min，使蛋白充分溶解，15 ，8000 rpm離心1 h或更長時間，以沒有沉淀為標(biāo)準(zhǔn)。7.2 蛋白定量7.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確吸取適量 1.0 mg/mL 的 BSA 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，加水逐級稀釋，配制成質(zhì)量濃度為 0 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.06 mg/mL 、0.8 mg/mL 、1.0 mg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 0.1 mL 于試管中，加入考馬斯亮蘭 G250 溶液 5.0 mL，振蕩混勻，靜置 2 min。分光光度計測定標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在 595 nm 處光吸收值 A595。用標(biāo)準(zhǔn)工作溶液蛋白質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)，用吸光度值 A595 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。7.2.2 樣品檢測GB/T XXXXXXXXX6準(zhǔn)確移取樣品溶液0.1 mL于試管中，加入考馬斯亮藍(lán)G250溶液5.0 mL，振蕩混勻，室溫放置2 min。分光光度計上測定樣品在595 nm處的光吸收值A(chǔ)595 。超出標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度上限的樣品應(yīng)稀釋后測定。根據(jù)測定的樣品A595值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的蛋白質(zhì)含量。7.3 SDS-PAGE7.3.1 變性測完蛋白濃度后，計算含100 g總蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品于Eppendorf管中，加入5× SDS上樣緩沖液至終濃度為1×，將樣品于沸水中煮35 min使蛋白質(zhì)變性。7.3.2 制膠根據(jù)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量大小選擇相應(yīng)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠濃度，見附錄A中A.3和A.4。7.3.3 上樣取8.3.1的蛋白樣品上樣，相鄰齒道加上預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。7.3.4 電泳凝膠上所加電壓為8 V/cm，當(dāng)染料進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到15 V/cm，繼續(xù)電泳直到溴酚藍(lán)達(dá)到分離膠底部，然后關(guān)閉電源。7.4 轉(zhuǎn)膜7.4.1 聚丙烯酰胺凝膠的準(zhǔn)備將進(jìn)行完SDS-PAGE后的凝膠浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中15 min60 min。7.5.2 半干法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)將轉(zhuǎn)印膜和兩張與轉(zhuǎn)印膜相同尺寸的濾紙于轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5 min。由下至上安裝轉(zhuǎn)移裝置：陽極板-濾紙-轉(zhuǎn)印膜-凝膠-濾紙-陰極板，根據(jù)凝膠面積按0.65 mA/cm 2 接通電流，轉(zhuǎn)移1.5 h2 h。7.5 封閉用封閉液于平板搖床上搖動封閉1 h。7.6 一抗結(jié)合按0.1 mL/cm 2的量加入適當(dāng)比例稀釋的第一抗體，在室溫下持續(xù)搖動1 h以上或4 ºC緩慢搖動過夜。棄去一抗工作液，用TBST洗滌轉(zhuǎn)印膜5 min，更換TBST后再洗滌20 min，再次更換TBST后洗滌5 min，最后用TBS洗滌濾膜5 min。7.7 二抗結(jié)合加入二抗工作液室溫下持續(xù)搖動13 h。棄去二抗工作液，以TBST漂洗轉(zhuǎn)印膜三次，每次10 min，最后用TBS漂洗濾膜5 min。7.8 成像7.8.1 辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗的成像GB/T XXXXXXXXX7取ECL化學(xué)發(fā)光液A、B等量混勻，加在轉(zhuǎn)印膜上，避光顯色1 min5 min，化學(xué)發(fā)光儀成像。7.8.2 熒光標(biāo)記二抗的成像利用熒光成像系統(tǒng)的相應(yīng)光源激發(fā)后，接收發(fā)射光成像。8 結(jié)果分析成像圖片本底干凈，能看到印跡膜均勻的輕微背景輪廓，目的條帶清晰且不過曝，即可判為目的蛋白表達(dá)。GB/T XXXXXXXXX8A A附 錄 A試劑配制A.1 RIPA裂解液A.1.1 成分A.1.1.1 NaClA.1.1.2 TrisA.1.1.3 EDTAA.1.1.4 Triton X-100A.1.1.5 DeoxycholateA.1.1.6 SDSA.1.1.7 水A.1.1.8 AprotininA.1.1.9 LeupeptinA.1.1.10 PMSFA.1.1.11 釩酸鈉A.1.1.12 氟化鈉A.1.2 制法 A.1.2.1 溶液A：將Tris-base 0.158 g、NaCl 0.18 g、0.1 g Deoxycholate、0.02 g SDS 和0.2 mL Triton X-100加入10 mL水溶解，用1 mol/L HCl調(diào)pH至7.4。A.1.2.2 溶液B：0.93g EDTA·2Na溶于4 mL水中，再加入NaOH直至完全溶解，并定容至5 mL，終濃度為0.5 mol/L。A.1.2.3 溶液C：取40 uL 溶液B加入溶液A中并定容至20 mL，4 保存。A.1.2.4 溶液D：取1mg Aprotinin溶于1 mL水中，-20 保存A.1.2.5 溶液E：取1mg Leupeptin溶于1 mL水中，-20 保存A.1.2.6 溶液F：取34.84 mg PMSF溶于1 mL水中，4 保存A.1.2.7 溶液G：取36.78 mg釩酸鈉溶于1 mL水中，4 保存A.1.2.8 溶液H：取8.4 g氟化鈉溶于1 mL水中，4 保存GB/T XXXXXXXXX9A.1.2.9 溶液I：取20 µL溶液D，20 µL溶液E，100 µL溶液F，100 µL溶液G，100 µL溶液G加入到溶液C中，即為最終溶液。A.2 植物裂解液A.2.1 成分A.2.1.1 CHAPSA.2.1.2 尿素 A.2.1.3 DTTA.2.1.4 水A.2.2 制法A.2.2.1 溶液A：將2.7 g尿素0.2 g CHAPS溶于3 mL滅菌的水中。A.2.2.2 溶液 B：3.09 g DTT 溶于 20 mL 水中。A.2.2.3 取 325 µL 溶液 B 加入溶液 A 中，并定容至 5 mL。A.3 SDS-PAGE分離膠根據(jù)所需濃度不同，按照表A.1配置。表A.1 SDS-PAGE分離膠配制溶液成分（mL）凝膠濃度 1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）30% 丙烯酰胺溶液 10% SDS 溶液 10% 過硫酸銨溶液 TEMED 水6 % 2.5 2.0 0.1 0.1 0.008 5.38 % 2.5 2.7 0.1 0.1 0.006 4.610 % 2.5 3.3 0.1 0.1 0.004 4.012 % 2.5 4.0 0.1 0.1 0.004 3.315 % 2.5 5.0 0.1 0.1 0.004 2.3A.4 SDS-PAGE 濃縮膠按照表A.2配制SDS-PAGE濃縮膠。表A.25%SDS-PAGE分離膠配制溶液成分（mL）凝膠濃度 1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）30% 丙烯酰胺溶液 10% SDS 溶液 10% 過硫酸銨溶液 TEMED 水5 % 0.63 0.83 0.05 0.05 0.005 3.4GB/T XXXXXXXXX10_