一 凝膠色譜法知識(shí)要點(diǎn) 1 凝膠色譜法的用途 2 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理 二 緩沖溶液知識(shí)要點(diǎn) 1 緩沖溶液的組成和作用機(jī)理 2 熟悉一般緩沖溶液的配制方法 3 緩沖溶液廣泛應(yīng)用于生化實(shí)驗(yàn) 微生物的培養(yǎng) 組織切片和細(xì)菌染色以及酶的研究等方面 三 電泳知識(shí)要點(diǎn) 1 電泳的基本原理 2 不同類(lèi)型的電泳 觀察你處理的血液樣品離心后是否分層 見(jiàn)教科書(shū)圖5 18 如果分層不明顯 可能是洗滌次數(shù)少 未能除去血漿蛋白的原因 此外 離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀 也得不到純凈的紅細(xì)胞 影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度 由于凝膠是一種半透明的介質(zhì) 因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈 檢查凝膠是否裝填得均勻 此外 還可以加入大分子的有色物質(zhì) 例如藍(lán)色葡聚糖 2000或紅色葡聚糖 觀察色帶移動(dòng)的情況 如果色帶均勻 狹窄 平整 說(shuō)明凝膠色譜柱的性能良好 如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡 輕輕敲打柱體以消除氣泡 消除不了時(shí)要重新裝柱 如果凝膠色譜柱裝填得很成功 分離操作也正確的話(huà) 能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻 狹窄 平整 隨著洗脫液緩慢流出 如果紅色區(qū)帶歪曲 散亂 變寬 說(shuō)明分離的效果不好 這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān) 你能從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密 均勻嗎 答 凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體 小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道 相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部 只能分布在顆粒之間 通過(guò)的路程較短 移動(dòng)速度較快 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道 通過(guò)的路程較長(zhǎng) 移動(dòng)速度較慢 因此 樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出 相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出 相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最后流出 從而使各種相對(duì)分子質(zhì)量不同的分子得以分離 如果凝膠裝填得不夠緊密 均勻 就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無(wú)效的空隙 使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過(guò) 攪亂洗脫液的流動(dòng)次序 影響分離的效果 答 凝膠色譜法也稱(chēng)為分配色譜法 它是根據(jù)分子量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一 所用的凝膠實(shí)際上是一些微小的多孔球體 這些小球體大多數(shù)是由多糖類(lèi)化合物構(gòu)成 小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道 當(dāng)一個(gè)含有各種分子的樣品溶液緩慢流經(jīng)時(shí) 各分子在色譜柱內(nèi)進(jìn)行兩種不同的運(yùn)動(dòng) 即垂直向下的運(yùn)動(dòng)和無(wú)規(guī)則的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng) 相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部 只能分布在顆粒之間 通過(guò)的路程較短 移動(dòng)速度較快 相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進(jìn)入凝膠內(nèi)的通道 通過(guò)的路程較長(zhǎng) 移動(dòng)速度較慢 因此 樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出 相對(duì)分子質(zhì)量中等的分子后流出 相對(duì)分子質(zhì)量最小的分子最后流出 這種現(xiàn)象又叫分子篩現(xiàn)象 此外 凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 相對(duì)分子質(zhì)量大的分子通過(guò)這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的空隙時(shí)阻力大 而相對(duì)分子質(zhì)量小的分子通過(guò)時(shí)阻力小 因此不同分子量的蛋白質(zhì)分子可以獲得分離 答 在一定范圍內(nèi) 能對(duì)抗外來(lái)少量強(qiáng)酸 強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液pH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用 具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液 緩沖溶液通常是由一或兩種化合物 緩沖劑 溶解于水中制得 調(diào)節(jié)緩沖劑的配比就可制得不同pH范圍的緩沖液 緩沖溶液的作用是維持反應(yīng)體系的pH不變 在生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)過(guò)程都是在精確的pH下進(jìn)行的 受到氫離子濃度的嚴(yán)格調(diào)控 為了在實(shí)驗(yàn)室條件下準(zhǔn)確地模擬生物體內(nèi)的天然環(huán)境 就必須保持體外生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程有與體內(nèi)過(guò)程完全相同的pH 答 電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程 許多重要的生物大分子 如氨基酸 多肽 蛋白質(zhì) 核苷酸 核酸等都具有可解離基團(tuán) 它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH下會(huì)帶上正電或負(fù)電 在電場(chǎng)的作用下 這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng) 電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下 利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小 形狀等性質(zhì)的差異 使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度 從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分離 鑒定或提純的目的 答 血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步 包括 樣品處理 粗分離 純化和純度鑒定 首先通過(guò)洗滌紅細(xì)胞 血紅蛋白的釋放 離心等操作收集到血紅蛋白溶液 即樣品的處理 再經(jīng)過(guò)透析去除分子量較小的雜質(zhì) 即樣品的粗分離 然后通過(guò)凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去 即樣品的純化 最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定 答 血紅蛋白是有色蛋白 因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過(guò)觀察顏色來(lái)判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液 這使血紅蛋白的分離過(guò)程非常直觀 大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作