第第5章章 植物的組織植物的組織培養(yǎng)培養(yǎng)實驗?zāi)康模簩嶒災(zāi)康模?.掌握植物組織培養(yǎng)基掌握植物組織培養(yǎng)基(MS)的配制的配制(Murashige and Skoog)植物組織培養(yǎng)基的配制植物組織培養(yǎng)基的配制煙草愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系的建立煙草愈傷組織的誘導(dǎo)及再生體系的建立實驗用品：實驗用品：1.儀器和用品：儀器和用品：500 ml試劑瓶試劑瓶1個；個；100 ml試劑瓶試劑瓶5個；個； 250 ml試劑瓶試劑瓶4個；高壓滅菌鍋；電子天平；個；高壓滅菌鍋；電子天平；燒杯（大、中、小各燒杯（大、中、小各2個）、玻璃棒、移液管、個）、玻璃棒、移液管、搪瓷缸、培養(yǎng)瓶、電爐、搪瓷缸、培養(yǎng)瓶、電爐、pH計或精密計或精密pH試紙、試紙、容量瓶（大、中、小各容量瓶（大、中、小各1個）個）2.化學(xué)藥品及試劑化學(xué)藥品及試劑 漢語名漢語名 分子式分子式 生產(chǎn)公司生產(chǎn)公司 分子量分子量 純度純度 硝酸銨硝酸銨 NH4NO3 上海通亞精細(xì)化工廠上海通亞精細(xì)化工廠 80.04 分析純分析純 磷酸二氫鉀磷酸二氫鉀 KH2PO4 中國江蘇南京中山集團公司化工廠中國江蘇南京中山集團公司化工廠 136.09 硝酸鉀硝酸鉀 KNO3 上海鑫達(dá)精細(xì)化工有限公司上海鑫達(dá)精細(xì)化工有限公司 101.10 硫酸鎂硫酸鎂 MgSO4.7H2O 山東省化工研究院山東省化工研究院 246.47 氯化鈣氯化鈣 CaCl2.2H2O (上海上海)四聯(lián)化工廠四聯(lián)化工廠 147.03 硫酸錳硫酸錳 MnSO4.4H2O 上海試劑工廠上海試劑工廠 169.02 硫酸鋅硫酸鋅 ZnSO4.7H2O 山東濰坊市試劑廠山東濰坊市試劑廠 287.54 硼酸硼酸 H3BO3 濟南化學(xué)試劑廠濟南化學(xué)試劑廠 61.83 碘化鉀碘化鉀 KI 上?；瘜W(xué)采購站上?；瘜W(xué)采購站 166.064 鉬酸鈉鉬酸鈉 Na2MoO4.2H2O 北京五十六北京五十六0一化工廠一化工廠 241.95 分析純分析純 氯化鈣氯化鈣 CaCl2.6H2O 濟南試劑總廠濟南試劑總廠 237.93 五水硫酸銅五水硫酸銅 CuSO4.5H2O 濟南化學(xué)試劑廠濟南化學(xué)試劑廠 249.68 漢語名漢語名 分子式分子式 生產(chǎn)公司生產(chǎn)公司 分子量分子量 純度純度 乙二胺四乙酸鈉乙二胺四乙酸鈉 Na2-EDTA.2H2O 濟南試劑總廠濟南試劑總廠 372.24 分析純分析純 硫酸亞鐵硫酸亞鐵 FeSO4.7H2O 山東博山化學(xué)試劑廠山東博山化學(xué)試劑廠 278.01 分析純分析純 甘氨酸甘氨酸 C2H5NO2 中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所 75.07 分析純分析純 鹽酸吡哆醇鹽酸吡哆醇 C8H11O3N.HCl 中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑站中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑站 205.64 鹽酸硫胺素鹽酸硫胺素 C12H17ClH4OS.HCl 中國新興化工試劑研究所中國新興化工試劑研究所 337.27 煙酸煙酸 C6H5NO2 北京芳草醫(yī)藥化工研制公司北京芳草醫(yī)藥化工研制公司 123.11 化學(xué)純化學(xué)純 肌醇肌醇 C6H12O6 中國政翔化學(xué)試劑研究所中國政翔化學(xué)試劑研究所 180.16 3-吲哚乙酸吲哚乙酸IAA（b-Indoleacetic acid） 天津天泰精細(xì)化工品有限公司天津天泰精細(xì)化工品有限公司 125.1 分析純分析純 萘乙酸萘乙酸 NAA C12H10O2 中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司 186.21 化學(xué)純化學(xué)純?nèi)~酸葉酸 C19H19O6N7 上海化學(xué)試劑廠上?；瘜W(xué)試劑廠 441.42 2,4-D （2,4-dichlorophenoxyacetic acid ）上海雪滿生物科技有限公司）上海雪滿生物科技有限公司 6-BA（N6-benzylaminopurine） 上海伯奧生物科技有限公司上海伯奧生物科技有限公司 225.25 蔗糖蔗糖 sucrose 天津市廣成化學(xué)試劑有限公司天津市廣成化學(xué)試劑有限公司 342.29 分析純分析純 瓊脂瓊脂 Agar 國藥集團化學(xué)試劑有限公司國藥集團化學(xué)試劑有限公司 B.RMS培養(yǎng)基配制表培養(yǎng)基配制表 MS母液配制用量母液配制用量g.L-1每升培養(yǎng)基取用量每升培養(yǎng)基取用量mL/L大量元素大量元素(20倍倍)KNO338 NH4NO33350MgSO47H2O7.4KH2PO43.4CaCl2 H2O8.8微量元素微量元素(200倍倍)MnSO4 4H2O4.465ZnSO47H2O1.72H3BO31.24KI0.166NaMoO42 H2O O0.05CuSO45 5H2O0.005CoCl6 6H2O0.005鐵鹽鐵鹽Na2-EDTA2 H2O O7.465FeSO47H2O5.56有機附加物有機附加物(200倍倍)甘氨酸甘氨酸(氨基乙酸氨基乙酸)0.25VB60.05VB10.01煙酸煙酸0.05肌醇肌醇0.01生長素類生長素類 在組培中的作用：誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化。在組培中的作用：誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化。 常用種類及作用：常用種類及作用：IAA(吲哚乙酸吲哚乙酸)、 NAA、 IBA、NOA（萘氧乙酸）、（萘氧乙酸）、 2.4D、 2.4.5T（三氯苯（三氯苯氧乙酸）氧乙酸） 使用時先配成母液，母液的濃度一般為使用時先配成母液，母液的濃度一般為0.1 mg/ml或或1 mg/ml；配時一般先將其粉末溶于；配時一般先將其粉末溶于95乙醇乙醇或或0.1 mol/L的的NaOH中，再定容。中，再定容。細(xì)胞分裂素類細(xì)胞分裂素類 在組培中的作用：促進細(xì)胞分裂和由在組培中的作用：促進細(xì)胞分裂和由callus或器官上或器官上分化不定芽。分化不定芽。 常用種類及作用：常用種類及作用：BAP（芐氨基嘌呤）、（芐氨基嘌呤）、6BA（芐（芐基腺嘌呤），基腺嘌呤），zip（異戊烯氨（異戊烯氨 基嘌呤）和基嘌呤）和KN（激動素）（激動素） 使用時先配成母液，母液的濃度一般為使用時先配成母液，母液的濃度一般為0.1 mg/ml或或 1 mg/ml；配時一般溶于；配時一般溶于0.5或或1 mol/L的的HCl或稀薄或稀薄的的NaOH中，再定容。中，再定容。實驗步驟：實驗步驟：1.母液的配制：母液的配制： 見見MS培養(yǎng)基配制表培養(yǎng)基配制表2.培養(yǎng)基的配制：培養(yǎng)基的配制：1）稱取一定量的蔗糖，溶解于適量蒸餾水中（不能太）稱取一定量的蔗糖，溶解于適量蒸餾水中（不能太多），倒入多），倒入500ml容量瓶中。容量瓶中。2）吸取各種母液（吸取量根據(jù)培養(yǎng)基的最終體積決）吸取各種母液（吸取量根據(jù)培養(yǎng)基的最終體積決定），加入到上述容量瓶中。定），加入到上述容量瓶中。3）吸取各種激素（所配制的培養(yǎng)基是：）吸取各種激素（所配制的培養(yǎng)基是：MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L ），加入到上述容量瓶中。），加入到上述容量瓶中。4) 定容到定容到500 ml。5）將上述溶液調(diào)）將上述溶液調(diào)pH值到值到5.8-6.0。6) 將上述溶液加入瓊脂后，于電爐上煮沸。將上述溶液加入瓊脂后，于電爐上煮沸。7）將上述培養(yǎng)基冷卻至）將上述培養(yǎng)基冷卻至40-50 攝氏度后，將其分裝到攝氏度后，將其分裝到100 ml三角瓶中。三角瓶中。8）將三角瓶用封口膜封口。并對不同的培養(yǎng)基做好標(biāo)）將三角瓶用封口膜封口。并對不同的培養(yǎng)基做好標(biāo)記。記。3.滅菌：滅菌： 通常培養(yǎng)基應(yīng)在汽相通常培養(yǎng)基應(yīng)在汽相121攝氏度的條件下在攝氏度的條件下在高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌20 min。 在高壓滅菌鍋的加熱過程中，在氣壓指針在高壓滅菌鍋的加熱過程中，在氣壓指針上升到上升到0.05 Mpa時，放一次氣，然后在溫度達(dá)時，放一次氣，然后在溫度達(dá)121攝氏度時，保持此壓力滅菌攝氏度時，保持此壓力滅菌15-20 min。滅。滅菌完成后，待滅菌鍋的壓力降到菌完成后，待滅菌鍋的壓力降到0時，打開滅菌時，打開滅菌鍋，取出培養(yǎng)基，放平，待培養(yǎng)基凝固后備用。鍋，取出培養(yǎng)基，放平，待培養(yǎng)基凝固后備用。注意事項：注意事項：1.實驗中所用的各種容器一定要洗凈、烘干。實驗中所用的各種容器一定要洗凈、烘干。2.用電子天平稱量藥品時，一定要用稱量紙，對于有腐蝕性的用電子天平稱量藥品時，一定要用稱量紙，對于有腐蝕性的藥品，應(yīng)將其放在小燒杯中稱量。藥品，應(yīng)將其放在小燒杯中稱量。3.各種母液應(yīng)保存在各種母液應(yīng)保存在2-4攝氏度的冰箱中，以免變質(zhì)、長霉。攝氏度的冰箱中，以免變質(zhì)、長霉。4.用高壓滅菌鍋時，一定要先檢查一下其中的水是否合適。用高壓滅菌鍋時，一定要先檢查一下其中的水是否合適。接種：接種： 在無菌的條件下，取煙草無菌苗的葉片，剪成（在無菌的條件下，取煙草無菌苗的葉片，剪成（0.51cm）*(0.51cm)大小的小塊，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基大小的小塊，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L中誘導(dǎo)愈傷組織，在此培養(yǎng)基上能中誘導(dǎo)愈傷組織，在此培養(yǎng)基上能誘導(dǎo)出愈傷組織并能夠誘導(dǎo)出不定芽。誘導(dǎo)出愈傷組織并能夠誘導(dǎo)出不定芽。不定芽生根：不定芽生根： 將在愈傷組織中生成的不定芽移栽到將在愈傷組織中生成的不定芽移栽到1/2 MS培養(yǎng)基中，其培養(yǎng)基中，其目的是誘導(dǎo)不定芽生根，使其發(fā)育成煙草小植株。目的是誘導(dǎo)不定芽生根，使其發(fā)育成煙草小植株。 植物材料滅菌的常用藥品和原理植物材料滅菌的常用藥品和原理1.乙醇：乙醇： 原理：脫水作用和溶脂性，從而使原理：脫水作用和溶脂性，從而使Protein脫水、變脫水、變性、沉淀及質(zhì)膜破損、透性增加，使微生物致死。性、沉淀及質(zhì)膜破損、透性增加，使微生物致死。 使用濃度：使用濃度：70（V/V） 滅菌時間：滅菌時間：560 s2.次氯酸鹽：次氯酸鹽： 原理：在水中形成次亞氯酸（原理：在水中形成次亞氯酸（HClO），），HClO分解分解后形成鹽酸和新生態(tài)氧后形成鹽酸和新生態(tài)氧（ HClOHCl+O-），）， O-具有很強的具有很強的 氧化性而具有殺菌作用。氧化性而具有殺菌作用。 使用濃度：使用濃度：0.52.5的有效氯的有效氯 滅菌時間：滅菌時間：515 min3.升汞（升汞（HgCl2）：）：原理：汞離子可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使菌原理：汞離子可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使菌體蛋白變性，酶失活。其殺菌效力極強。體蛋白變性，酶失活。其殺菌效力極強。 使用濃度：使用濃度：0.1-0.2（W/V）滅菌時間：滅菌時間：10 min4.新潔爾滅：新潔爾滅：原理：廣譜表面活性滅菌劑。原理：廣譜表面活性滅菌劑。 使用濃度：使用濃度：1：200（V/V）滅菌時間：滅菌時間：30 min或更長或更長 接種第一天接種第一天 接種第二天，因為外植體細(xì)胞開始被誘導(dǎo)脫分化，接種第二天，因為外植體細(xì)胞開始被誘導(dǎo)脫分化，并不斷分裂增殖，造成葉片中央與邊緣的細(xì)胞分并不斷分裂增殖，造成葉片中央與邊緣的細(xì)胞分裂不均勻，因此，葉片中央凸起。裂不均勻，因此，葉片中央凸起。接種第五天，脫分化細(xì)胞不斷分裂增殖，形成愈傷組織，接種第五天，脫分化細(xì)胞不斷分裂增殖，形成愈傷組織，表現(xiàn)為葉片邊緣泛黃增厚，葉片中央進一步凸起。表現(xiàn)為葉片邊緣泛黃增厚，葉片中央進一步凸起。接種第九天，脫分化細(xì)胞不斷增值，愈傷組織接種第九天，脫分化細(xì)胞不斷增值，愈傷組織不斷增厚，整個葉片都翹起，并且已經(jīng)開始再不斷增厚，整個葉片都翹起，并且已經(jīng)開始再分化形成綠色生長點。分化形成綠色生長點。第九天（誘導(dǎo)生成愈傷組織）第九天（誘導(dǎo)生成愈傷組織） 接種第十九天，綠色生長點進一步發(fā)育形成了不定芽，接種第十九天，綠色生長點進一步發(fā)育形成了不定芽，不定芽長度最長可達(dá)不定芽長度最長可達(dá)1 cm 。 第十九天（長出幼葉）第十九天（長出幼葉） 將不定芽在無菌條件下，從芽的基部切下，然后插入生根培養(yǎng)基將不定芽在無菌條件下，從芽的基部切下，然后插入生根培養(yǎng)基中（中（1/2 MS），誘導(dǎo)生根。），誘導(dǎo)生根。 芽的生根情況芽的生根情況