附件2 廣西食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的測(cè)定（征求意見(jiàn)稿） 編制說(shuō)明目錄一、工作簡(jiǎn)況3（一）任務(wù)來(lái)源與合同編號(hào)、起草單位、主要起草人3（二）簡(jiǎn)要起草過(guò)程4二、與我國(guó)、我區(qū)有關(guān)法律法規(guī)和其他標(biāo)準(zhǔn)情況的關(guān)系4三、標(biāo)準(zhǔn)制定必要性、目的及意義情況說(shuō)明5四、標(biāo)準(zhǔn)的制訂原則5五、各項(xiàng)技術(shù)內(nèi)容的驗(yàn)證及說(shuō)明61 目標(biāo)化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)61.1 鉤吻堿和鉤吻堿子的理化性質(zhì)61.2 鉤吻堿和鉤吻堿子的應(yīng)用61.3 鉤吻堿和鉤吻堿子的毒理作用72 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及有效期驗(yàn)證82.1 標(biāo)準(zhǔn)品信息82.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制82.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液有效期驗(yàn)證83本標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)范圍及本方法檢測(cè)原理的說(shuō)明93.1 檢測(cè)范圍93.2 方法檢測(cè)原理94 高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法（方法一）104.1 質(zhì)譜測(cè)定條件104.2 液相測(cè)定條件124.3 前處理方法優(yōu)化144.4 精密度試驗(yàn)154.5 基質(zhì)效應(yīng)考察164.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線174.7 重復(fù)性試驗(yàn)184.8 回收率試驗(yàn)194.9 檢測(cè)方法的檢出限、定量限205 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)法（方法二）205.1 質(zhì)譜測(cè)定條件205.2 氣相測(cè)定條件215.3 前處理方法優(yōu)化225.4 精密度試驗(yàn)235.5 基質(zhì)效應(yīng)考察235.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線245.7 重復(fù)性試驗(yàn)255.8 回收率試驗(yàn)275.9 檢測(cè)方法的檢出限、定量限276 高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法（方法三）286.1 質(zhì)譜測(cè)定條件286.2 液相測(cè)定條件296.3 前處理方法316.4 檢測(cè)方法的靈敏度和專屬性31一、工作簡(jiǎn)況（一）任務(wù)來(lái)源與合同編號(hào)、起草單位、主要起草人本檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)的制訂工作，是受廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會(huì)委托，由梧州市食品藥品檢驗(yàn)所負(fù)責(zé)研制，合同編號(hào)為桂地標(biāo)食2019005。標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位為梧州市食品藥品檢驗(yàn)所。主要起草人為：羅達(dá)龍、陳學(xué)松、劉慧妍、黃蘅、葉小強(qiáng)、賴秀梅、王華、陳翠玲、姚泳成、鐘家良，詳見(jiàn)表1。表1 參加標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目人員情況研制人員姓名性別年齡職稱職務(wù)研究方向單位投入時(shí)間項(xiàng)目負(fù)責(zé)人羅達(dá)龍男36副主任藥師業(yè)務(wù)科主任兼科研管科主任食品藥品檢驗(yàn)梧州市食品藥品檢驗(yàn)所整個(gè)研究過(guò)程主要參加人員陳學(xué)松男46主任藥師所長(zhǎng)食品藥品檢驗(yàn)梧州市食品藥品檢驗(yàn)所整個(gè)研究過(guò)程劉慧妍女37副主任藥師食品室主任食品藥品檢驗(yàn)梧州市食品藥品檢驗(yàn)所整個(gè)研究過(guò)程黃蘅女47副主任藥師副所長(zhǎng)食品藥品檢驗(yàn)梧州市食品藥品檢驗(yàn)所整個(gè)研究過(guò)程葉小強(qiáng)男56副主任藥師副所長(zhǎng)食品藥品檢驗(yàn)梧州市食品藥品檢驗(yàn)所整個(gè)研究過(guò)程賴秀梅女37主管藥師藥品室主任食品藥品檢驗(yàn)梧州市食品藥品檢驗(yàn)所整個(gè)研究過(guò)程王華男26主管藥師檢驗(yàn)員食品藥品檢驗(yàn)梧州市食品藥品檢驗(yàn)所整個(gè)研究過(guò)程陳翠玲女32中藥師檢驗(yàn)員食品藥品檢驗(yàn)梧州市食品藥品檢驗(yàn)所整個(gè)研究過(guò)程姚泳成男28藥師檢驗(yàn)員食品藥品檢驗(yàn)梧州市食品藥品檢驗(yàn)所整個(gè)研究過(guò)程鐘家良男25藥師檢驗(yàn)員食品藥品檢驗(yàn)梧州市食品藥品檢驗(yàn)所整個(gè)研究過(guò)程（二）簡(jiǎn)要起草過(guò)程梧州市食品藥品檢驗(yàn)所接受制訂任務(wù)后，成立由實(shí)驗(yàn)室專業(yè)技術(shù)人員組成的研制小組，全面負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的研制計(jì)劃和工作安排。主要成員由正高1人，副高4人，中級(jí)職稱2人，初級(jí)職稱3人，共10人組成。制訂本標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)中華人民共和國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化法，GB/T 1.1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)、GB/T 27404-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)等標(biāo)準(zhǔn)或規(guī)范。制標(biāo)小組為做好標(biāo)準(zhǔn)的制定工作，廣泛收集國(guó)內(nèi)外有關(guān)的檢測(cè)技術(shù)資料、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、限量指標(biāo)，以及相關(guān)的法律、法規(guī)，召開(kāi)了有關(guān)座談會(huì)，聽(tīng)取各方建議。在研制過(guò)程中，遵循科學(xué)性、實(shí)用性和前瞻性等原則，尊重客觀規(guī)律，融合科學(xué)理論和標(biāo)準(zhǔn)化方法?？紤]到我國(guó)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分析方法應(yīng)逐步與國(guó)際接軌，以及分析方法應(yīng)有較強(qiáng)的可操作性的要求，確定了標(biāo)準(zhǔn)制定的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)本項(xiàng)目作了以下主要制訂：（1）確定了檢測(cè)項(xiàng)目為食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的測(cè)定；（2）制定了檢測(cè)方法為方法一：高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法、方法二：氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、方法三：高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法；（3）規(guī)定了檢測(cè)對(duì)象為蜂蜜、酒類及疑似鉤吻中毒的食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的測(cè)定，其它基質(zhì)食品可參照?qǐng)?zhí)行。2、 與我國(guó)、我區(qū)有關(guān)法律法規(guī)和其他標(biāo)準(zhǔn)情況的關(guān)系新制地方標(biāo)準(zhǔn)與相關(guān)法律、法規(guī)及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)一致，沒(méi)有沖突。第1， 新制地方標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)項(xiàng)目為食品中鉤吻堿和鉤吻堿子，國(guó)內(nèi)對(duì)于食品中鉤吻堿類生物堿中毒的應(yīng)急檢測(cè)仍未有相關(guān)的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和檢測(cè)方法。第2， 新制地方標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)范圍較寬。新制地方標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)對(duì)象為蜂蜜、酒類及疑似鉤吻中毒的食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的測(cè)定，其它基質(zhì)食品可參照?qǐng)?zhí)行。第三，新制地方標(biāo)準(zhǔn)的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度較優(yōu)。新制地方標(biāo)準(zhǔn)的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度等相關(guān)指標(biāo)滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)中的規(guī)定。第四，新制地方標(biāo)準(zhǔn)采用固相萃取凈化方法，運(yùn)用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜或氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)食品中鉤吻堿和鉤吻堿子進(jìn)行定性和定量測(cè)定，用高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜對(duì)食品中鉤吻堿和鉤吻堿子進(jìn)行篩查和定性確證。 三、標(biāo)準(zhǔn)制定必要性、目的及意義情況說(shuō)明鉤吻堿類生物堿主要存在于馬錢科植物胡蔓藤Gelsemium elegans(Gardn.et Champ.)Benth.中，習(xí)稱斷腸草，民間有用藥史，一般用于跌打損傷，骨折，皮膚濕疹等，因其有大毒，一般外用，誤服能致命。2015-2016 年梧州地區(qū)共發(fā)生2 起因誤食鉤吻（斷腸草）引起的生物堿中毒事件，造成6人中毒1人死亡。查閱文獻(xiàn)，報(bào)道國(guó)內(nèi)廣東茂名市公安局早期曾發(fā)表過(guò)鉤吻堿中毒40例尸檢分析的文章，文章稱其中利用鉤吻投毒致死15人、服鉤吻自殺20人、為治病服藥5人，由此可見(jiàn)因誤食鉤吻導(dǎo)致中毒或死亡的案例時(shí)有發(fā)生。梧州市食品藥品檢驗(yàn)所作為梧州市食品安全委員會(huì)辦公室成員中唯一應(yīng)急檢驗(yàn)單位，近四年參與的轄區(qū)內(nèi)應(yīng)急檢驗(yàn)，確證兩例共29批樣品含鉤吻成分，應(yīng)急處理中發(fā)現(xiàn)國(guó)標(biāo)和地標(biāo)均未有相關(guān)的食品鉤吻中毒的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，故很有必要在食品中毒領(lǐng)域上找到可行、規(guī)范、準(zhǔn)確的質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)，為食品中毒鉤吻的應(yīng)急處理提供一個(gè)依據(jù)和對(duì)中毒物質(zhì)的定性定量做出準(zhǔn)確的判斷，由于鉤吻中含有特征性成分鉤吻堿和鉤吻堿子，故本研究對(duì)食品中鉤吻堿和鉤吻堿子運(yùn)用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜或氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)食品中鉤吻堿和鉤吻堿子進(jìn)行定性和定量測(cè)定，并以高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜對(duì)疑似鉤吻中毒的樣品進(jìn)行篩查和定性確證。建立檢測(cè)法，制定明確標(biāo)準(zhǔn)，為中毒分析檢驗(yàn)提供法定依據(jù)，為人員搶救搶占時(shí)間。為醫(yī)院的后續(xù)治療處理或中毒物質(zhì)分析提供有效準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持。四、標(biāo)準(zhǔn)的制訂原則本標(biāo)準(zhǔn)的制定和起草工作遵循統(tǒng)一性、協(xié)調(diào)性、適用性、一致性和規(guī)范性。第一，本標(biāo)準(zhǔn)為現(xiàn)有檢測(cè)食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的唯一標(biāo)準(zhǔn)。第二，方法確認(rèn)和驗(yàn)證嚴(yán)謹(jǐn)、全面，適用性強(qiáng)。本標(biāo)準(zhǔn)選擇了蜂蜜、酒、保健湯（保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液）作為試樣進(jìn)行方法確認(rèn)，覆蓋鉤吻中毒事件中常見(jiàn)的食品。第三，標(biāo)準(zhǔn)按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)中的規(guī)定，要求進(jìn)行制定，具有一致性和規(guī)范性。五、各項(xiàng)技術(shù)內(nèi)容的驗(yàn)證及說(shuō)明1 目標(biāo)化合物的物理和化學(xué)性質(zhì)1.1 鉤吻堿和鉤吻堿子的理化性質(zhì) 鉤吻堿和鉤吻堿子詳見(jiàn)表1-1表1-1鉤吻堿和鉤吻堿子的理化性質(zhì)名稱鉤吻堿鉤吻堿子 別稱鉤吻素甲鉤吻素子英文名稱GelsemineKoumine密度1.33 g/cm31.330.1 g/cm3沸點(diǎn)493.4C at 760 mmHg493.4C at 760 mmHg熔點(diǎn)178C181-183C分子式C20H22N2O2C20H22N2O分子量322.4306.4CAS號(hào)509-15-91358-76-5精確分子量322.1681306.1732儲(chǔ)存條件應(yīng)放有毒有害保險(xiǎn)箱常溫保存應(yīng)放有毒有害保險(xiǎn)箱常溫保存分子結(jié)構(gòu)式1.2鉤吻堿和鉤吻堿子的應(yīng)用1.2.1鉤吻堿應(yīng)用文獻(xiàn)記載鉤吻堿是治療部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎（PSNL）小鼠的神經(jīng)性疼痛和睡眠障礙的有效藥物。鉤吻堿（4 mg / kg）對(duì)PSNL誘導(dǎo)的機(jī)械異常性疼痛和熱痛覺(jué)過(guò)敏產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。在PSNL小鼠中，鉤吻堿（4mg / kg）使機(jī)械閾值增加4小時(shí)并延長(zhǎng)熱潛伏期3小時(shí)。此外，鉤吻堿能增加非快速眼動(dòng)（非REM，NREM）睡眠，減少覺(jué)醒，但在前3小時(shí)內(nèi)不影響快速眼動(dòng)（REM）睡眠在PSNL小鼠。免疫組織化學(xué)研究表明，PSNL可增加前扣帶皮層神經(jīng)元中c-Fos的表達(dá)，而鉤吻堿（4 mg / kg）可使c-Fos表達(dá)降低58。具有興奮中樞神經(jīng)作用，由于毒性很大，很少作藥用。1.2.2鉤吻堿子應(yīng)用 鉤吻堿子是從鉤吻中得到的生物堿，具有高效抗腫瘤活性，在腫瘤細(xì)胞中能夠增加Bax/Bcl-2 的蛋白比例和 caspase-3 的表達(dá)。鉤吻堿子具有抗焦慮、抗應(yīng)激、抗銀屑病和鎮(zhèn)痛活性。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中，鉤吻堿子能夠預(yù)防關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。1.3鉤吻堿和鉤吻堿子的毒理作用1.3.1鉤吻堿主要抑制延腦的呼吸中樞，引起呼吸中樞麻痹，呼吸衰竭而死亡，同時(shí)作用于迷走神經(jīng)和心肌，引起血液循環(huán)障礙，從而加劇了肝、腎等臟器的損害。1.3.2鉤吻堿子毒理作用與鉤吻堿相似。1.3.3鉤吻生物堿的危害鉤吻常見(jiàn)于廣東、廣西、貴州等地區(qū)，由于其型與金銀花相似，導(dǎo)致民間多見(jiàn)誤食鉤吻而導(dǎo)致鉤吻中毒，中毒患者多見(jiàn)為飲用含鉤吻中藥材的自釀中藥藥酒而導(dǎo)致中毒，或誤把鉤吻當(dāng)做藥用食材用于烹飪方面。鉤吻全株都有大毒，根、莖、枝、葉含有8種鉤吻生物堿，而當(dāng)中鉤吻堿和鉤吻堿子是毒理研究最多的成分，也是鉤吻的最具代表性成分。服食鉤吻堿過(guò)量，即導(dǎo)致消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的強(qiáng)烈反應(yīng)，腸發(fā)黑粘連。中毒癥狀包括流涎、惡心、口渴、吞咽困難、發(fā)熱、嘔吐、口吐白沫、抽搐、四肢麻木、肌肉無(wú)力、肌肉纖維顫動(dòng)、舌硬、言語(yǔ)不清、煩躁不安、心律失常等。1.3.4 鉤吻的小鼠半數(shù)致死量洪息君、陸文光等在斷腸草不同部位毒性的研究中指出用鉤吻植物的不同部位以1:10的煎劑來(lái)測(cè)定小鼠的半數(shù)致死量（LD50）植物中各部位的LD50分別為：鉤吻根0.0798g /kg，老莖1.309 g/kg，嫩莖1.830 g/kg，葉0.255 g/kg，花0.458 g/kg，果實(shí)1.275 g/kg。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道鉤吻根3g左右或嫩芽7個(gè)，或流浸膏3.5mL，或鉤吻堿0.150.3g經(jīng)口攝入可使人致死。鉤吻堿攝入量在0.150.3g，人體即有中毒跡象。張永志、何宏源等在鉤吻素甲對(duì)小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)研究中指出使用鉤吻堿灌胃的小鼠30分鐘內(nèi)半數(shù)致死濃度為78.23mg/kg，95%置信區(qū)間69.7587.75mg/kg，而使用51.2mg/kg濃度灌胃的小鼠30分鐘內(nèi)小鼠無(wú)死亡，并且較低濃度的鉤吻堿子（10mg/kg）亦對(duì)小鼠具有抗焦慮的治療作用，說(shuō)明低劑量的鉤吻堿與鉤吻堿子對(duì)機(jī)體基本無(wú)毒性影響。 2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及有效期驗(yàn)證2.1 標(biāo)準(zhǔn)品信息鉤吻堿和鉤吻堿子標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)廣州分析測(cè)試中心，詳見(jiàn)表2-1 表2-1 鉤吻堿、鉤吻堿子標(biāo)準(zhǔn)品信息名稱別稱貨號(hào)狀態(tài)純度劑型劑量生產(chǎn)單位鉤吻堿鉤吻素甲NACC60513粉末98%20mg/瓶中國(guó)廣州分析測(cè)試中心鉤吻堿子鉤吻素子NACC60512粉末98%20mg/瓶中國(guó)廣州分析測(cè)試中心2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制2.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1mg/mL）分別精密稱取鉤吻堿、鉤吻堿子標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用甲醇溶解并稀釋至10mL，搖勻，制成濃度為1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。-20 避光貯存，有效期6個(gè)月。2.2.2混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作溶液（1 g/mL）分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1mg/mL）（2.2.1）各0.10 mL，用甲醇稀釋至100mL，搖勻，制成1 g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液。2.2.3混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液（1 g/mL）（2.2.2）適量，用甲醇稀釋，搖勻，作為系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，各化合物濃度依次為1 g/L200 g/L，臨用新制或依儀器響應(yīng)情況配制適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液有效期驗(yàn)證分別取適量標(biāo)準(zhǔn)品粉末（對(duì)照組）、儲(chǔ)存時(shí)間為1個(gè)月的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（含單標(biāo)和混標(biāo)）和儲(chǔ)存時(shí)間為6個(gè)月的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（含單標(biāo)和混標(biāo)），分別按“2.2”的方法配制成10g/L標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)組設(shè)置3個(gè)平行。在相同條件下同時(shí)進(jìn)樣檢測(cè)，每組單標(biāo)和每組混標(biāo)均檢測(cè)鉤吻堿、鉤吻堿子。分析比較不同儲(chǔ)存時(shí)間的每種單標(biāo)同時(shí)檢測(cè)兩種化合物的峰面積結(jié)果。該結(jié)果提示鉤吻堿、鉤吻堿子在正常儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液不影響定量。分析比較不同儲(chǔ)存時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)混合液檢測(cè)兩種化合物的峰面積結(jié)果，詳見(jiàn)表2-2，存儲(chǔ)1個(gè)月和6個(gè)月的各個(gè)化合物的峰面積與對(duì)照組的峰面積比較，均沒(méi)有顯著性差異（p > 0.05）。結(jié)果表明鉤吻堿、鉤吻堿子可以穩(wěn)定儲(chǔ)存于甲醇等介質(zhì)中，高濃度的儲(chǔ)備液有效期至少為6個(gè)月，標(biāo)準(zhǔn)中間液有效期至少為1個(gè)月。表2-2 不同儲(chǔ)存時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)混合液檢測(cè)結(jié)果儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)照組1個(gè)月6個(gè)月化合物名稱Area 1Area 2Area 3Area 1Area 2Area 3P值A(chǔ)rea 1Area 2Area 3P值鉤吻堿2878929547312013100131520304110.2213014129898301120.789鉤吻堿子3025931544322113044329201319850.4662921029985321440.4433本標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)范圍及本方法檢測(cè)原理的說(shuō)明3.1 檢測(cè)范圍3.1.1 酒基質(zhì)和保健湯基質(zhì)的選取2015年，在梧州地區(qū)發(fā)生一起農(nóng)民工中毒事件，通過(guò)檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)收集疑似引起中毒材料，包括鉤吻植物、鉤吻植物泡制的酒、以及中毒時(shí)農(nóng)民工所飲用的用鉤吻作為食材煮的“保健湯”，最終確認(rèn)為鉤吻中毒，據(jù)相關(guān)人員反饋，農(nóng)民工在山上采集的“鉤吻”植物誤認(rèn)為雞血藤，繼而通過(guò)泡酒，煲湯，以想達(dá)到活血補(bǔ)血，舒筋活絡(luò)等功效，但由于植物鑒定知識(shí)和技能限制，誤認(rèn)植物而引起了食物中毒。而鉤吻最長(zhǎng)用的誤服途徑為泡酒和煲湯，所以本標(biāo)準(zhǔn)選取了酒基質(zhì)和保健湯基質(zhì)為主要研究對(duì)象。3.1.2 蜂蜜基質(zhì)的選取2016年，在梧州地區(qū)也發(fā)生一起食品中毒事件，經(jīng)過(guò)檢測(cè)與有關(guān)部門的調(diào)查，其中毒樣品為野生蜂蜜，蜜蜂經(jīng)采集蜂巢附近的鉤吻花蜜回巢形成了有毒蜂蜜，從而引起采集野生蜂蜜中毒事件，故本標(biāo)準(zhǔn)也選取了蜂蜜基質(zhì)作為主要研究對(duì)象。由于近年來(lái)，我們接收到的案件樣品有蜂蜜基質(zhì)、酒基質(zhì)和保健湯基質(zhì)等。規(guī)定了檢測(cè)對(duì)象為蜂蜜、酒類及疑似鉤吻中毒的食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的測(cè)定，其它基質(zhì)食品可參照?qǐng)?zhí)行。3.2 方法檢測(cè)原理由于鉤吻含鉤吻堿、鉤吻堿子等生物堿，其可在酸性條件下形成非離子狀態(tài)，更容易溶解于水中，繼而經(jīng)過(guò)與強(qiáng)陽(yáng)離子交換反相吸附劑固相萃取柱的作用吸附，用水與有機(jī)相淋洗除去雜質(zhì)后，用堿性溶液洗脫，收集洗脫液，達(dá)到凈化的作用。由于高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜為實(shí)驗(yàn)室常配儀器，故本標(biāo)準(zhǔn)還采用了高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分別作為方法一和方法二使用，根據(jù)歐盟委員會(huì)2002/ 657/ EC 決議的“四分法原則”，高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法選取一個(gè)母離子和兩個(gè)子離子可得到較好的定性，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法選取四個(gè)特征離子也可得到較好的定性，同時(shí)該兩個(gè)方法也是常用的定量方法，經(jīng)方法適用性考察后，兩個(gè)方法的定性與定量效果也能滿足日常使用要求，且兩個(gè)方法的檢出限與定量限設(shè)定遠(yuǎn)低于鉤吻堿和鉤吻堿子的經(jīng)口攝入中毒劑量，能滿足食品中鉤吻堿和鉤吻堿子的常量與痕量分析。由于高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜可得到目標(biāo)物的準(zhǔn)確分子量，根據(jù)歐盟委員會(huì)2002/ 657/ EC 決議的“四分法原則”，只需有2個(gè)準(zhǔn)確分子匹配，即可快速、準(zhǔn)確的定性，故本標(biāo)準(zhǔn)方法三僅作為定性方法。經(jīng)優(yōu)化，本標(biāo)準(zhǔn)選用試樣經(jīng)1%鹽酸超聲提取，經(jīng)MCX柱凈化后，運(yùn)用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜或氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)食品中鉤吻堿和鉤吻堿子進(jìn)行定性和定量測(cè)定，用高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質(zhì)譜對(duì)食品中鉤吻堿和鉤吻堿子進(jìn)行篩查和定性確證。4 高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法（方法一）4.1 質(zhì)譜測(cè)定條件本試驗(yàn)使用質(zhì)譜儀為Agilent QQQ-6490儀器購(gòu)于安捷倫科技有限公司。用溶劑50%甲醇水（含0.1%甲酸）分別配制鉤吻堿、鉤吻堿子，濃度分別為1g/mL。在儀器調(diào)諧通過(guò)后分別對(duì)上述兩個(gè)物質(zhì)進(jìn)行全掃描，得到全掃描一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)后再進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，對(duì)所得到的子離子的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行逐個(gè)優(yōu)化，最終儀器參數(shù)如下：離子源為ESI源，MRM正離子模式；毛細(xì)管電壓3000V；離子源溫度150；干燥氣流量15L/min；霧化氣壓力25Psi；鞘氣溫度350；鞘氣（N2）流量12L/min?；衔镔|(zhì)譜參數(shù)詳見(jiàn)表4-1，二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4-24-3。表4-1化合物名稱、分子式、母離子、子離子、碎裂電壓、碰撞電壓序號(hào)化合物名稱分子式母離子(m/z)子離子(m/z)碎裂電壓/V碰撞能量/V1鉤吻堿C20H22N2O2323.170.0a/236.138035/252鉤吻堿子C20H22N2O307.2220.1a/180.038035/40注：a為定量離子圖4-2鉤吻堿二級(jí)質(zhì)譜圖圖4-3鉤吻堿子二級(jí)質(zhì)譜圖4.2 液相測(cè)定條件4.2.1色譜柱條件色譜柱：ACE UltraCore 2.5m C18 2.1x75 mm；柱溫: 35。4.2.2 流動(dòng)相選擇本試驗(yàn)使用液相色譜儀為Agilent LC-1290儀器購(gòu)于安捷倫科技有限公司。使用溶劑50%甲醇水（含0.1%甲酸）配制100 ng/mL和1000 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，每個(gè)濃度設(shè)置6平行（進(jìn)樣量0.5 L）。在液相色譜儀上以乙腈為有機(jī)相，0.1%甲酸水溶液為水相，泵系統(tǒng)自動(dòng)灌注10 min，初始流動(dòng)相平衡30 min后進(jìn)樣。待進(jìn)樣完畢后，以100%乙腈沖洗柱子30 min，然后更換0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L甲酸銨）為水相，泵系統(tǒng)自動(dòng)灌注10 min，初始流動(dòng)相平衡30 min后重復(fù)進(jìn)樣。比較分析乙腈+0.1%甲酸水溶液和乙腈+0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L甲酸銨）兩組流動(dòng)相下各檢測(cè)項(xiàng)目的峰面積，結(jié)果以乙腈+0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L甲酸銨）作為流動(dòng)相時(shí)鉤吻堿的峰面積明顯高于乙腈+0.1%甲酸水溶液組，而鉤吻堿子無(wú)明顯差異，因此本檢測(cè)方法選擇乙腈+0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L甲酸銨）作為流動(dòng)相。4.2.3洗脫程序優(yōu)化以乙腈為有機(jī)相（A），以0.1%甲酸水溶液（含5mmol/L甲酸銨）為水相（B）。經(jīng)過(guò)優(yōu)化的最終流動(dòng)相洗脫程序詳見(jiàn)表4-4，0 min有機(jī)相為5%，為初平衡；01.00 min有機(jī)相由5%升至10%，1.001.50 min有機(jī)相由10%升至35%，1.502.50 min有機(jī)相由35%升至90%為分離階段；2.503.00 min有機(jī)相升到95%，為沖洗階段；3.015.50 min有機(jī)相降至5%；為后平衡。在該條件下各物質(zhì)的峰形對(duì)稱、銳利，能完全分離，保留時(shí)間落在2.02.3 min，詳見(jiàn)圖4-54-7。表4-4 梯度洗脫程序表梯度時(shí)間/min流動(dòng)相A/%流動(dòng)相B/%0.005951.0010901.5035652.5090103.009553.015955.50595圖4-5鉤吻堿提取離子色譜圖 圖4-6鉤吻堿子提取離子色譜圖 圖4-7鉤吻堿、鉤吻堿子提取離子色譜疊加圖4.3 前處理方法優(yōu)化4.3.1提取液優(yōu)化 我們對(duì)比了純化水、0.5%鹽酸水溶液、1%鹽酸水溶液、1.5%鹽酸水溶液和2%鹽酸水溶液對(duì)同一株鉤吻莖的粉碎樣進(jìn)行鉤吻堿和鉤吻堿子堿同步提取、稀釋后，通過(guò)比較在高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜上測(cè)得的響應(yīng)值來(lái)對(duì)比提取效率，由于鉤吻堿和鉤吻堿子均為生物堿物質(zhì)，在酸性溶液提取下物質(zhì)轉(zhuǎn)為非離子化狀態(tài)，使其在水中不易解離，提高了其溶解性。本試驗(yàn)結(jié)果表明用1%鹽酸水溶液提取的鉤吻堿和鉤吻堿子響應(yīng)最高，故選用1%鹽酸水溶液作為提取溶劑。不同溶劑提取下的響應(yīng)值詳見(jiàn)表4-8。表4-8不同溶劑提取下的響應(yīng)值溶劑鉤吻堿響應(yīng)值鉤吻堿子響應(yīng)值純化水110650135230.5%鹽酸水溶液200650208991%鹽酸水溶液277056315691.5%鹽酸水溶液266044305472%鹽酸水溶液26694530449 4.3.2凈化方法優(yōu)化我們對(duì)比了1%鹽酸水直接提取樣品（無(wú)凈化）、經(jīng)MCX固相萃取柱凈化和C18固相萃取柱凈化后的樣品。結(jié)果顯示，在1%鹽酸水直接提取的基礎(chǔ)上通過(guò)MCX固相萃取柱將生物堿成分富集后再凈化的效果非常明顯，C18固相萃取柱使生物堿損失量較大，生物堿含量明顯低于用MCX凈化的樣品；而1%鹽酸水直接提取樣品（無(wú)凈化），則干擾物質(zhì)較多，且酸水作為提取溶劑對(duì)氣相用毛細(xì)管色譜柱損傷較大，因此不宜采用。本實(shí)驗(yàn)最后采用MCX固相萃取柱作為凈化方式。MCX固相萃取柱以混合型強(qiáng)陽(yáng)離子交換反相吸附劑為基礎(chǔ)，由PLS吸附劑鍵合磺酸基團(tuán)得到，兼具陽(yáng)離子交換和反相兩種保留模式，適用于其共軛酸的pKa值處于210之間的堿性化合物。其保留機(jī)理以強(qiáng)陽(yáng)離子交換相互作用和非極性相互作用為主，極性相互作用為次。適用于堿性化合物萃取。通過(guò)把待測(cè)物富集在MCX柱上，用水、甲醇淋洗除去除去試樣中的糖和酯類等非極性干擾物，用堿性溶液洗脫收集，濃縮后溶解上機(jī)測(cè)定，最終優(yōu)化的前處理方法如下： 對(duì)無(wú)結(jié)晶的蜂蜜樣品，將其攪拌均勻。對(duì)有結(jié)晶的樣品，在密閉情況下，置于不超過(guò) 60的水浴中溫?zé)幔袷?，待樣品全部融化后攪勻，迅速冷卻至室溫，分出0.5kg作為試樣置于樣品瓶中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，室溫保存，待用。保健湯樣品應(yīng)將湯與湯渣混合均勻后作為試樣。制備均勻的試樣應(yīng)置于樣品瓶中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，置于28保存，待用。 稱取1g（精確至0.01g）制備均勻的樣品置于100mL一次性離心管中，加入1%鹽酸水溶液至50mL，渦旋振蕩2min后超聲處理（100 W，40 kHz）30分鐘，3000r/mim離心5分鐘，吸取上清液5.00mL到已活化的Creole MCX柱（MCX柱依次用甲醇3mL、水3mL活化），依次用水5mL、甲醇5mL淋洗，棄去全部流出液，抽干MCX柱，用5%氨化甲醇5mL洗脫，收集洗脫液，并于40氮吹至干，加入溶劑50%甲醇水（含0.1%甲酸）1.00mL溶解殘?jiān)?，過(guò)0.22m有機(jī)濾膜，備用?；蚋鶕?jù)實(shí)際濃度適當(dāng)稀釋，備用。MCX填料結(jié)構(gòu)詳見(jiàn)圖4-9。圖 4-9 MCX填料圖4.4 精密度試驗(yàn)鉤吻堿在2870g/kg、鉤吻堿子在2050g/kg（蜂蜜基質(zhì)、酒基質(zhì)、保健湯基質(zhì)）低、中、高3個(gè)加標(biāo)濃度，連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，鉤吻堿的蜂蜜基質(zhì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%3.0%，酒基質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%2.5%，保健湯基質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%2.5%；鉤吻堿子的蜂蜜基質(zhì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%2.7%，酒基質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%2.2%，保健湯基質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%3.2%。該試驗(yàn)中3種基質(zhì)的精密度試驗(yàn)RSD均小于5%，說(shuō)明儀器精密度良好。結(jié)果詳見(jiàn)表4-10。表4-10高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法精密度試驗(yàn)基質(zhì)類型蜂蜜酒 保健湯*物質(zhì)種類添加濃度/（g/kg）相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)鉤吻堿283.0%2.5%2.5%562.7%1.1%2.0%700.9%0.6%1.0%鉤吻堿子202.7%2.2%3.2%402.5%1.0%1.7%500.8%0.7%1.5%*保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液。4.5 基質(zhì)效應(yīng)考察基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)是指在樣品測(cè)試過(guò)程中，目標(biāo)化合物以外的其他物質(zhì)直接或間接影響質(zhì)譜檢測(cè)的現(xiàn)象。目前一般采用空白樣品前處理凈化后添加標(biāo)準(zhǔn)品的方法來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)ME10，提示基質(zhì)效應(yīng)較小，可用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量；當(dāng)10<ME50，提示基質(zhì)效應(yīng)較大，若用溶劑外標(biāo)法定量回收率達(dá)不到要求，則需要用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量以消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響；當(dāng)ME> 50，提示基質(zhì)效應(yīng)很強(qiáng)，嚴(yán)重影響定量，需要重新優(yōu)化樣品前處理方法。將空白基質(zhì)試樣按標(biāo)準(zhǔn)前處理方法進(jìn)行提取、凈化后獲得空白基質(zhì)提取液，分別使用空白基質(zhì)提取液和50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶劑將鉤吻堿和鉤吻堿子配制為濃度2 ng/mL、8ng/mL、20ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液；進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果都在95%105%范圍內(nèi)，說(shuō)明經(jīng)本方法提取和凈化后，基質(zhì)效應(yīng)不明顯，故標(biāo)準(zhǔn)曲線用50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)系列濃度也適用于本標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)。考察結(jié)果詳見(jiàn)表4-11。表4-11基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果基質(zhì)類型蜂蜜酒 保健湯*項(xiàng)目添加濃度(ng/mL)S+空白基質(zhì)/S /%S+空白基質(zhì)/S /%S+空白基質(zhì)/S /%鉤吻堿2101.799.798.7899.698.697.510102.398.799.6鉤吻堿子2104.7102.399.28101.4101.6101.510102.6100.7100.6*保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液。4.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線鉤吻堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液工作曲線在14g/kg284g/kg（濃度為1.4ng/mL28.4ng/mL）線性關(guān)系良好，線性方程y=5116.072769x-1015.616631，相關(guān)系數(shù)R=0.999；鉤吻堿子標(biāo)準(zhǔn)品溶液工作曲線在10g/kg200g/kg（濃度為1.0ng/mL20.0ng/mL）線性關(guān)系良好，線性方程y=644.826518x- 56.355908，相關(guān)系數(shù)R=0.999，詳見(jiàn)圖4-12，圖4-13。 圖4-12鉤吻堿標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖4-13鉤吻堿子標(biāo)準(zhǔn)工作曲線4.7重復(fù)性試驗(yàn)分別稱取三種基質(zhì)各5份1.00g樣品置于離心管中，分別加入標(biāo)準(zhǔn)液使鉤吻堿含量為280g/kg，鉤吻堿子含量為200g/kg。按4.3.2前處理方法，提取，凈化并檢測(cè)。結(jié)果蜂蜜基質(zhì)中鉤吻堿的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%，酒基質(zhì)中鉤吻堿的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%，保健湯基質(zhì)中鉤吻堿的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%；蜂蜜基質(zhì)中鉤吻堿子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.2%，酒基質(zhì)中鉤吻堿子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%，保健湯基質(zhì)中鉤吻堿子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%。該試驗(yàn)中3種基質(zhì)的重復(fù)性試驗(yàn)RSD均小于5%，說(shuō)明方法重現(xiàn)性良好。詳見(jiàn)表4-14。表4-14重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果蜂蜜基質(zhì)名稱CF1CF2CF3CF4CF5取樣量m/g1.001.001.001.001.00鉤吻堿檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)265260259270266RSD/%1.8鉤吻堿子檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)190188185196200RSD/%3.2酒基質(zhì)名稱CF1CF2CF3CF4CF5取樣量m/g1.001.001.001.001.00鉤吻堿檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)258276 269 262 273 RSD/%2.9鉤吻堿子檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)201 198 203 209 194 RSD/%2.8保健湯基質(zhì)（保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液）名稱CF1CF2CF3CF4CF5取樣量m/g1.001.001.001.001.00鉤吻堿檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)259269272282277RSD/%3.2鉤吻堿子檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)210 210 208 200 204 RSD/%2.24.8 回收率試驗(yàn)鉤吻堿在28280g/kg、鉤吻堿子在20200g/kg（蜂蜜基質(zhì)、酒基質(zhì)、保健湯基質(zhì)）低、中、高3個(gè)加標(biāo)濃度回收率詳見(jiàn)下表4-15，該試驗(yàn)中3種基質(zhì)的回收率試驗(yàn)RSD均小于5%，說(shuō)明方法準(zhǔn)確度高。表4-15 鉤吻堿、鉤吻堿子在不同基質(zhì)中的回收率基質(zhì)類型蜂蜜酒 保健湯*物質(zhì)種類添加濃度/（g/kg）回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)鉤吻堿2889.3%95.9%2.0%3.9%90.3%95.0%1.3%2.9%89.6%93.0%2.5%3.6%5691.0%96.1%2.0%3.4%94.1%98.1%1.1%2.4%90.2%96.0%2.3%3.4%28092.3%98.1%2.0%2.9%96.2%98.1%1.0%2.0%91.6%98.1%2.1%2.8%鉤吻堿子2086.2%91.2%2.2%4.0%89.9%95.1%1.1%3.0%85.9%92.1%1.7%3.8%4088.2%93.2%2.2%3.5%90.2%96.2%1.2%2.8%88.2%94.1%1.6%2.9%20089.6%95.1%2.1%2.8%91.0%97.3%1.1%2.2%90.0%95.4%1.7%2.1%*保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液。4.9 檢測(cè)方法的檢出限、定量限以加標(biāo)試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行方法靈敏度的確定。以鉤吻堿、鉤吻堿子定性離子信噪比3來(lái)確定檢出限，經(jīng)試驗(yàn)鉤吻堿檢出濃度可做到0.28ng/mL（2.8g/kg），鉤吻堿子檢出濃度可做到0.2ng/mL（2g/kg）。以鉤吻堿、鉤吻堿子定量離子信噪比10來(lái)確定定量限，經(jīng)試驗(yàn)鉤吻堿檢出濃度可做到0.56ng/mL（5.6g/kg），鉤吻堿子檢出濃度可做到0.4ng/mL（4g/kg）。由于考慮各執(zhí)行單位儀器靈敏度的差異以及鉤吻堿和鉤吻堿子為常量檢測(cè)指標(biāo)，經(jīng)口攝入引起中毒量為毫克級(jí)，最終確定當(dāng)稱樣量為1 g（精確至0.01g），稀釋倍數(shù)為10時(shí)，本方法中鉤吻堿檢出限為14g/kg，鉤吻堿子檢出限為10g/kg，鉤吻堿定量限為28g/kg，鉤吻堿子定量限為20g/kg。詳見(jiàn)下表4-16。表4-16 鉤吻堿、鉤吻堿子在食品中的檢出限、定量限序號(hào)化合物名稱檢出限（g/kg）定量限（g/kg）1鉤吻堿14282鉤吻堿子10205 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)法（方法二）5.1 質(zhì)譜測(cè)定條件本試驗(yàn)使用質(zhì)譜儀為Agilent 7000C儀器購(gòu)于安捷倫科技有限公司。用溶劑甲醇分別配制鉤吻堿、鉤吻堿子，濃度分別為1g/mL。在儀器調(diào)諧通過(guò)后分別對(duì)上述兩個(gè)物質(zhì)在EI源70 eV轟擊下進(jìn)行全掃描記錄所產(chǎn)生的子離子，最終優(yōu)化得到的儀器參數(shù)如下：離子源電子轟擊源(EI) 70 eV；離子源溫度230 ；接口溫度280 ；四極桿溫度150 ； 全掃描（SCAN）質(zhì)量范圍40-350 amu；詳見(jiàn)表5-1，圖5-2。接口溫度需保證目標(biāo)物完全汽化到質(zhì)譜端，故選用280，而質(zhì)譜掃描范圍需盡可能包含兩個(gè)目標(biāo)物的碎片離子分子量，低質(zhì)量端從40amu開(kāi)始可避免采集如氧氣、氮?dú)獾瓤諝飧蓴_，高質(zhì)量端截止至350amu可包含了鉤吻堿的分子離子322amu。表5-1 化合物名稱、分子式、定量離子、定性離子序號(hào)化合物名稱分子式定量離子 （m/z）定性離子 （m/z）1鉤吻堿C20H22N2O2322.0279.0，251.0，108.02鉤吻堿子C20H22N2O306.0263.0，223.0，70.0 圖5-2鉤吻堿、鉤吻堿子全掃描圖5.2 氣相測(cè)定條件圖5-3鉤吻堿子提取離子色譜圖本試驗(yàn)使用氣相色譜儀Agilent GC 7890B儀器購(gòu)于安捷倫科技有限公司。用HP-5MS 0.25 mm30 m0.25 m 色譜柱在作為分離色譜柱通過(guò)調(diào)節(jié)氣相色譜條件使鉤吻堿和鉤吻堿子達(dá)到完全分離，最終儀器參數(shù)如下：色譜柱HP-5MS 0.25 mm30 m0.25 m；載氣高純氦氣；進(jìn)樣口溫度280；進(jìn)樣量1.0L不分流進(jìn)樣；程序升溫(初始溫度為150 ，保持2 min，然后15min-1升至280 ，保持4 min)，詳見(jiàn)圖5-35-5。圖5-4鉤吻堿提取離子色譜圖圖5-5鉤吻堿、鉤吻堿子提取離子色譜疊加圖5.3 前處理方法優(yōu)化考慮到含水的溶劑汽化后會(huì)體積膨脹引起過(guò)載，容易造成反沖，以致目標(biāo)物損失，另外含水的溶劑也容易造成非極性色譜柱（HP-5）的損害，故在方法氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)法中最后的定容溶劑選擇用甲醇替代50%甲醇水溶液（含0.1%甲酸），最終前處理方法為： 對(duì)無(wú)結(jié)晶的蜂蜜樣品，將其攪拌均勻。對(duì)有結(jié)晶的樣品，在密閉情況下，置于不超過(guò) 60的水浴中溫?zé)?，振蕩，待樣品全部融化后攪勻，迅速冷卻至室溫，分出0.5kg作為試樣置于樣品瓶中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，室溫保存，待用。保健湯樣品應(yīng)將湯與湯渣混合均勻后作為試樣。制備均勻的試樣應(yīng)置于樣品瓶中，密封，并標(biāo)明標(biāo)記，置于28保存，待用。 稱取1g（精確至0.01g）樣品置于100mL一次性離心管中，加入1%鹽酸水溶液至50mL，渦旋振蕩2min后超聲處理（100 W，40 kHz）30分鐘，3000r/mim離心5分鐘，吸取上清液5.00mL到已活化的Creole MCX柱（MCX柱依次用甲醇3mL、水3mL活化），依次用水5mL、甲醇5mL淋洗，棄去全部流出液，抽干MCX柱，用5%氨化甲醇5mL洗脫，收集洗脫液，并于40氮吹至干，加入溶劑甲醇1.00mL溶解殘?jiān)?，過(guò)0.22m有機(jī)濾膜，備用?；蚋鶕?jù)實(shí)際濃度適當(dāng)稀釋，備用。5.4 精密度試驗(yàn)鉤吻堿在140350g/kg、鉤吻堿子在100250g/kg（蜂蜜基質(zhì)、酒基質(zhì)、保健湯基質(zhì)）低、中、高3個(gè)加標(biāo)濃度，連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，鉤吻堿的蜂蜜基質(zhì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%3.7%，酒基質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%3.1%，保健湯基質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%2.9%；鉤吻堿子的蜂蜜基質(zhì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%3.8%，酒基質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%2.2%，保健湯基質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%3.1%。詳見(jiàn)表5-6。表5-6氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)法精密度試驗(yàn)基質(zhì)類型蜂蜜酒 保健湯*物質(zhì)種類添加濃度/（g/kg）相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)鉤吻堿1403.2%2.5%2.9%2803.7%3.1%2.4%3501.9%1.7%1.9%鉤吻堿子1003.8%2.2%2.8%2003.5%1.0%3.1%2501.6%1.8%1.9%*保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液。5.5 基質(zhì)效應(yīng)考察基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect，ME)是指在樣品測(cè)試過(guò)程中，目標(biāo)化合物以外的其他物質(zhì)直接或間接影響質(zhì)譜檢測(cè)的現(xiàn)象。目前一般采用空白樣品前處理凈化后添加標(biāo)準(zhǔn)品的方法來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)ME10，提示基質(zhì)效應(yīng)較小，可用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量；當(dāng)10<ME50，提示基質(zhì)效應(yīng)較大，若用溶劑外標(biāo)法定量回收率達(dá)不到要求，則需要用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量以消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響；當(dāng)ME> 50，提示基質(zhì)效應(yīng)很強(qiáng)，嚴(yán)重影響定量，需要重新優(yōu)化樣品前處理方法。將空白基質(zhì)試樣按標(biāo)準(zhǔn)前處理方法進(jìn)行提取、凈化后獲得空白提取液，分別使用空白基質(zhì)提取液和50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶劑將鉤吻堿和鉤吻堿子配制為濃度5 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液；進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果都在95%105%范圍內(nèi)，說(shuō)明經(jīng)本方法提取和凈化后，基質(zhì)效應(yīng)不明顯，故標(biāo)準(zhǔn)曲線用50%甲醇水（含0.1%甲酸）溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)系列濃度也適用于本標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)?？疾旖Y(jié)果詳見(jiàn)表5-7。表5-7基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果基質(zhì)類型蜂蜜酒 保健湯*項(xiàng)目添加濃度(ng/mL)S+空白基質(zhì)/S /%S+空白基質(zhì)/S /%S+空白基質(zhì)/S /%鉤吻堿5103.7102.4103.320100.2102.1102.52598.699.4100.6鉤吻堿子5103.4102.4101.620100.5100.3101.12599.498.697.3*保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液。5.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線鉤吻堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液工作曲線在142g/kg2842g/kg（濃度為14.2ng/mL284.2ng/mL）線性關(guān)系良好，線性方程y=1527.868234x+42475.917066，相關(guān)系數(shù)R=0.999；鉤吻堿子標(biāo)準(zhǔn)品溶液工作曲線在101g/kg2018g/kg（濃度為10.1ng/mL201.8ng/mL）線性關(guān)系良好，線性方程y=3138.588520x- 2940.386876，相關(guān)系數(shù)R=0.999，詳見(jiàn)圖5-8，圖5-9。圖5-8鉤吻堿標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖5-9鉤吻堿子標(biāo)準(zhǔn)工作曲線5.7 重復(fù)性試驗(yàn)分別稱取三種基質(zhì)各5份1.00g樣品置于離心管中，分別加入標(biāo)準(zhǔn)液使鉤吻堿含量為284g/kg，鉤吻堿子含量為201.6g/kg。按5.3前處理方法，提取，凈化并檢測(cè)。結(jié)果蜂蜜基質(zhì)中鉤吻堿的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%，酒基質(zhì)中鉤吻堿的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%，保健湯基質(zhì)中鉤吻堿的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%；蜂蜜基質(zhì)中鉤吻堿子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%，酒基質(zhì)中鉤吻堿子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%，保健湯基質(zhì)中鉤吻堿子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%，詳見(jiàn)表5-10。表5-10重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果蜂蜜基質(zhì)名稱CF1CF2CF3CF4CF5取樣量m/g1.001.001.001.001.00鉤吻堿檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)273268284278280RSD/%2.3鉤吻堿子檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)203206205192198RSD/%2.9酒基質(zhì)名稱CF1CF2CF3CF4CF5取樣量m/g1.001.001.001.001.00鉤吻堿檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)276280282280288RSD/%1.6鉤吻堿子檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)208 204 209 198 207 RSD/%2.2保健湯基質(zhì)（保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液）名稱CF1CF2CF3CF4CF5取樣量m/g1.001.001.001.001.00鉤吻堿檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)279 271 285 287 292 RSD/%2.9鉤吻堿子檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)檢出量/(g/kg)203 198195 199208 RSD/%2.55.8 回收率試驗(yàn)鉤吻堿在2802800g/kg、鉤吻堿子在2002000g/kg（蜂蜜基質(zhì)、酒基質(zhì)、保健湯基質(zhì)）低、中、高3個(gè)加標(biāo)濃度回收率詳見(jiàn)下表5-11，該試驗(yàn)中3種基質(zhì)的回收率試驗(yàn)RSD均小于5%，說(shuō)明方法準(zhǔn)確度高。表5-11 鉤吻堿、鉤吻堿子在不同基質(zhì)中的回收率基質(zhì)類型蜂蜜酒保健湯*物質(zhì)種類添加濃度/（g/kg）回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)回收率相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)鉤吻堿28084.3%90.9%2.0%4.2%85.3%91.2%2.0%3.5%83.9%91.2%2.7%3.8%56086.2%90.7%2.0%3.4%88.2%92.1%1.8%3.0%85.2%91.6%2.5%3.4%280090.2%93.6%2.0%3.0%89.8%93.9%1.9%2.6%88.5%93.1%2.1%2.9%鉤吻堿子20084.2%89.6%2.1%4.2%86.9%90.2%1.6%3.2%85.9%91.1%1.9%3.9%40086.3%91.2%2.3%3.7%87.2%91.3%1.5%2.9%87.3%92.2%1.8%3.5%200088.5%92.1%2.1%2.9%89.0%92.3%1.13%2.8%89.7%92.3%1.7%2.9%*保健湯為誤用鉤吻作為原材料加水煮熟后的汁液。5.9 檢測(cè)方法的檢出限、定量限以加標(biāo)試驗(yàn)來(lái)進(jìn)行方法靈敏度的確定。以鉤吻堿、鉤吻堿子定性離子信噪比3來(lái)確定檢出限，經(jīng)試驗(yàn)鉤吻堿檢出濃度可做到2.8ng/mL（28g/kg），鉤吻堿子檢出濃度可做到2.0ng/mL（20g/kg）。以鉤吻堿、鉤吻堿子定量離子信噪比10來(lái)確定定量限，經(jīng)試驗(yàn)鉤吻堿定量濃度可做到5.6ng/mL（56g/kg），鉤吻堿子定量濃度可做到4.0ng/mL（40g/kg），由于考慮各執(zhí)行單位儀器靈敏度的差異以及鉤吻堿和鉤吻堿子為常量檢測(cè)指標(biāo)，經(jīng)口攝入引起中毒量為毫克級(jí)，最終確定當(dāng)稱樣量為1 g（精確至0.01g），稀釋倍數(shù)為10時(shí)，本方法中鉤吻堿檢出限為140g/kg，鉤吻堿子檢出限為100g/kg，鉤吻堿定量限為280g/kg，鉤吻堿子定量限為200g/kg。詳見(jiàn)表5-12。表5-12 鉤吻堿、