項(xiàng)目名稱：高等植物蛋白質(zhì)修飾與降解調(diào)控的分子機(jī)理研究首席科學(xué)家：謝旗 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所起止年限：2010.9至2015.9依托部門：中國科學(xué)院二、預(yù)期目標(biāo) (一) 總體目標(biāo)本項(xiàng)目將從鑒定主效基因及其功能研究、基因調(diào)控、蛋白質(zhì)組學(xué)、信號傳遞、決定生長發(fā)育及抗逆相關(guān)的重要農(nóng)藝性狀等入手，對相關(guān)的基因及農(nóng)藝性狀從分子生物學(xué)、遺傳學(xué)及生理學(xué)等多個學(xué)科的綜合研究，從蛋白質(zhì)定位、蛋白質(zhì)互作、蛋白質(zhì)表達(dá)及調(diào)控的生物學(xué)功能等整體網(wǎng)絡(luò)上揭示植物蛋白質(zhì)修飾與降解動態(tài)變化過程的分子機(jī)理，提高我國生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究水平,從而增強(qiáng)我國科技競爭力。通過本項(xiàng)目的實(shí)施，預(yù)計將在以下幾個方面取得突破：1. 闡明高等植物蛋白質(zhì)重要修飾過程與泛素降解調(diào)控機(jī)制和網(wǎng)絡(luò)，取得一批重大的原始創(chuàng)新性科學(xué)成果。2. 闡明植物蛋白質(zhì)修飾與降解過程中關(guān)鍵因子和底物作用的重要生物學(xué)效應(yīng)，發(fā)掘一批控制植物生長與耐性的重要功能基因，為我國農(nóng)作物品種改良等多性狀分子設(shè)計提供依據(jù)。3. 通過項(xiàng)目的實(shí)施，培育和造就一批在國際上具有影響力、在國內(nèi)具有引領(lǐng)作用的優(yōu)秀中青年研究人才，進(jìn)一步提升我國在植物科學(xué)的研究水平，使我們在該領(lǐng)域的研究進(jìn)入國際領(lǐng)先行列。 (二) 五年預(yù)期目標(biāo)利用已有的工作基礎(chǔ)，在植物蛋白質(zhì)重要修飾過程、泛素降解調(diào)控機(jī)制和網(wǎng)絡(luò)的分子機(jī)理及其重要生物學(xué)效應(yīng)等方面取得突破性進(jìn)展，使我國在植物蛋白質(zhì)科學(xué)的理論和應(yīng)用研究方面達(dá)到國際前沿水平，具體目標(biāo)包括：1) 明確多個受體類激酶、CDPKs、CIPKs類激酶和乙烯受體激酶的功能與作用，鑒定出與這些蛋白激酶互作的部分上、下游蛋白因子，提出2-3條通過RLK、CDPK、CIPK或乙烯受體調(diào)節(jié)的植物響應(yīng)逆境脅迫的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)途徑。2) 確定受蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去甲基化酶調(diào)控的靶基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；篩選鑒定擬南芥中與蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去甲基化酶相互作用的蛋白。3) 闡明調(diào)控植物蛋白在細(xì)胞膜-細(xì)胞核內(nèi)穿梭和定位的元件蛋白，及其在細(xì)胞內(nèi)定位與調(diào)控水稻穗型發(fā)育和產(chǎn)量的關(guān)系。分離和鑒定3-5個參與茉莉酸調(diào)控生長素極性運(yùn)輸?shù)腜IN蛋白內(nèi)吞和降解的分子調(diào)控元件并闡明其作用機(jī)理。4) 從分子生物學(xué)揭示泛素介導(dǎo)的蛋白降解途徑最重要的信號傳遞因子，包括調(diào)控與生長發(fā)育相關(guān)的植物激素JA、ABA和GA積累的信號傳遞調(diào)控的分子機(jī)制及與逆境脅迫應(yīng)答相關(guān)的信號傳遞的分子機(jī)理。5) 通過相關(guān)突變體的篩選，克隆蛋白質(zhì)重要修飾過程與泛素降解調(diào)控途徑相關(guān)的關(guān)鍵基因20-30個，并對其中的15-20個基因進(jìn)行詳細(xì)的基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控、基因功能等研究，建立相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)1-2個。6) 在國際著名學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表有較大學(xué)術(shù)影響的論文，發(fā)表SCI論文30篇、累計影響因子達(dá)150以上。申請專利5-7項(xiàng)。培養(yǎng)本領(lǐng)域的學(xué)術(shù)帶頭人6人以上。培養(yǎng)博士研究生60人，博士后20人。三、研究方案總體研究方案(一) 學(xué)術(shù)思想及技術(shù)路線蛋白質(zhì)功能的研究從過去的單一蛋白研究發(fā)展到現(xiàn)在的蛋白組學(xué)的研究，尤其在真核生物中蛋白質(zhì)翻譯后不同的修飾作用及復(fù)雜的相互交叉已被人們認(rèn)識。我們集中蛋白質(zhì)研究不同領(lǐng)域的力量，設(shè)計從重要蛋白的相應(yīng)基因的突變體入手，鑒定參與蛋白功能調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因。(1) 利用高表達(dá)、突變體研究基因及所編碼蛋白功能。利用酵母雙雜交及免疫共沉淀等方法分離相互作用蛋白，并進(jìn)一步利用體內(nèi)檢測方法（如BiFC）確定蛋白互作關(guān)系。采用植物容易轉(zhuǎn)基因的特點(diǎn)，在突變體的背景中高表達(dá)或敲除相互作用蛋白的基因，通過研究蛋白修飾水平的改變、定位的改變及降解特性的改變來研究蛋白功能。(2) 進(jìn)行功能位點(diǎn)的突變，將突變的蛋白在植物中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)，研究其功能及相互作用蛋白的動態(tài)變化及生物學(xué)效應(yīng)。(3) 根據(jù)植物基因組在進(jìn)化過程中產(chǎn)生的基因冗余的特點(diǎn)，我們在研究一個關(guān)鍵蛋白時，同時研究其家族蛋白的功能。根據(jù)植物基因表達(dá)位置的特異性及交叉性，研究家族成員之間的共性與特異性。這個思路將貫穿于本項(xiàng)目的課題一到課題四中，從蛋白的各種不同修飾到蛋白的定位及降解。研究方案技術(shù)路線圖如下： (二) 與國內(nèi)外同類研究相比本項(xiàng)目的創(chuàng)新性和特色1. 科學(xué)問題的前沿性：本項(xiàng)目以我國糧食安全重大需求為導(dǎo)向，瞄準(zhǔn)國際科學(xué)前沿，凝煉研究目標(biāo)，揭示控制植物修飾過程與泛素降解途徑的調(diào)控機(jī)理。集中開展重要農(nóng)藝性狀（產(chǎn)量）相關(guān)的分子基礎(chǔ)研究，闡明植物生長發(fā)育重要性狀的分子基礎(chǔ)。2. 新的總體研究方案：新的總體研究方案根據(jù)植物遺傳資源的特殊性及動物中生物化學(xué)技術(shù)的成熟發(fā)展，將遺傳學(xué)研究與分子生物學(xué)研究結(jié)合起來，充分利用生物信息，實(shí)現(xiàn)遺傳學(xué)研究和生物學(xué)研究的優(yōu)勢互補(bǔ)的整合。3. 新的研究策略：突破國內(nèi)外將蛋白的功能研究集中于單個蛋白功能的研究上，注重蛋白的各種修飾及相互作用蛋白的研究，研究各種修飾的競爭性及促進(jìn)作用。例如，我們可以結(jié)合染色質(zhì)免疫共沉淀和新一代高通量DNA 測序技術(shù)(Solexa)，使我們能在全基因組水平上揭示參與組蛋白共價修飾的靶基因和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。4. 新的研究方法：在大規(guī)模蛋白質(zhì)表達(dá)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用最新的蛋白芯片系統(tǒng)進(jìn)行篩選，從而實(shí)現(xiàn)制備的規(guī)模化和高通量化。在借助自動化、快速、高通量的相互作用技術(shù)平臺分析之后，還需要結(jié)合其它輔助的技術(shù)平臺協(xié)同驗(yàn)證這些相互作用，主要有細(xì)胞雙雜交技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)和表面等離子體共振技術(shù)。針對不同蛋白相互作用的研究采用不同的研究方法。例如，對膜蛋白的相互作用蛋白的分離我們采用泛素重組的雙雜交系統(tǒng)，而對定位我們采用熒光蛋白加上photobleaching的新技術(shù)來進(jìn)行研究。5. 關(guān)鍵科學(xué)問題的創(chuàng)新性：我們的研究重點(diǎn)在于不同植物激素調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)功能及效應(yīng)。這是因?yàn)橹参锏纳L發(fā)育、生殖以及環(huán)境的相互作用從根本上來說都是由不同的植物激素的調(diào)控來完成的，所以我們將研究的關(guān)鍵問題集中于解析植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵蛋白及其互作蛋白的功能，同時考慮到不同植物激素交叉調(diào)節(jié)研究關(guān)鍵蛋白的功能。6. 研究材料的獨(dú)特性：本研究主要利用已知基因組序列、遺傳背景清楚、大量突變體積累的模式植物水稻和擬南芥的為研究材料。(三) 本研究項(xiàng)目實(shí)現(xiàn)預(yù)期目標(biāo)的可行性1. 研究優(yōu)勢：近年來分子生物學(xué)研究飛速發(fā)展，擬南芥及水稻基因組已相繼完成測序。其它主要作物的基因組測序工作也在籌劃或正在進(jìn)行。這些基礎(chǔ)平臺可有力推進(jìn)本項(xiàng)目的順利開展。2. 資源優(yōu)勢：植物蛋白質(zhì)修飾與動態(tài)變化基礎(chǔ)生物學(xué)的研究已開展多年，目前已克隆了大量與蛋白功能有關(guān)的基因，大量突變體的積累提供了非常有力的保障。目前我們擁有一大批與項(xiàng)目有關(guān)的擬南芥突變體、部分水稻突變體以及各種蛋白雙雜交文庫（核系統(tǒng)、膜系統(tǒng)）。本項(xiàng)目實(shí)施的前兩年里我們在克隆有關(guān)基因的同時，還會進(jìn)行與有關(guān)基因相互作用蛋白的突變體的高通量篩選，保證本項(xiàng)目在整個執(zhí)行階段都有高產(chǎn)出的科研成果。3. 技術(shù)優(yōu)勢：本項(xiàng)目所提出的所有研究內(nèi)容都是建立在以往的工作基礎(chǔ)之上。實(shí)驗(yàn)中所需要的所有條件都已具備。此外，分子生物學(xué)和生物化學(xué)所有的技術(shù)和方法，如生物信息技術(shù)、突變體篩選技術(shù)、差異顯示技術(shù)、DNA芯片技術(shù)、常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)、常規(guī)生化技術(shù)、蛋白分離與分析技術(shù)、信號蛋白檢測技術(shù)、瞬時表達(dá)技術(shù)、雙雜交技術(shù)、顯微操作和定位技術(shù)等都是項(xiàng)目組有關(guān)成員多年來經(jīng)常采用的技術(shù)。泛素體內(nèi)分析系統(tǒng)、蛋白細(xì)胞內(nèi)相互作用實(shí)時熒光測定技術(shù)為項(xiàng)目的順利進(jìn)行提供了保障。4. 人才優(yōu)勢：項(xiàng)目組主要成員有多年從事植物遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等研究的經(jīng)驗(yàn)，在Cell, Nature, Science, Nautre Genetics，Genes & Development, PNAS, Plos Genetics，Plant Cell, Plant Journal，Plant Physiology等國際期刊上發(fā)表多篇蛋白功能相關(guān)的論文。此外，這些人員大部分都曾在國際上著名的從事植物分子生物學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)室中工作多年，和國際權(quán)威人士建立了良好的關(guān)系。國際間信息和物質(zhì)的交流必將大大提高工作的效率，對本項(xiàng)目的開展是一個有力的支持。同時本項(xiàng)目在已有優(yōu)勢人才的基礎(chǔ)上，圍繞關(guān)鍵科學(xué)目標(biāo)進(jìn)一步優(yōu)化了現(xiàn)有隊(duì)伍，建立起優(yōu)勢互補(bǔ)、聯(lián)合攻關(guān)的協(xié)作團(tuán)隊(duì)。課題設(shè)置本項(xiàng)目將實(shí)行首席科學(xué)家全權(quán)負(fù)責(zé)制，組織我國在植物蛋白基礎(chǔ)研究上具有長期研究基礎(chǔ)及特色的單位參加，按照“有所為，有所不為”的原則，從國家的經(jīng)濟(jì)發(fā)展需求出發(fā)，瞄準(zhǔn)國際發(fā)展前沿，突出研究幾個重要問題。根據(jù)總體研究計劃及研究內(nèi)容，選擇優(yōu)勢單位中長期從事本項(xiàng)目的專家承擔(dān)研究任務(wù)，成立項(xiàng)目核心成員管理委員會，進(jìn)行課題的組織、分解、經(jīng)費(fèi)協(xié)調(diào)，充分保證各課題間的有機(jī)協(xié)作，互通有無，提高效率。在科技部的領(lǐng)導(dǎo)下，采取中期評估、滾動管理的方式，監(jiān)督項(xiàng)目按預(yù)定計劃順利完成，對不能按期完成計劃的課題，首席科學(xué)家有重新調(diào)整的權(quán)利。首席科學(xué)家將充分發(fā)揮課題負(fù)責(zé)人的作用及學(xué)術(shù)帶頭人作用。按照科學(xué)問題，進(jìn)行課題的設(shè)置:課題1、植物蛋白的重要修飾過程與調(diào)控機(jī)理設(shè)置思路：本課題擬圍繞植物生長發(fā)育的特異性及其與環(huán)境的互作,著重研究細(xì)胞中重要功能蛋白的磷酸化、甲基化和糖基化修飾過程在植物植物生長發(fā)育的不同階段及在植物響應(yīng)干旱、高鹽、營養(yǎng)（磷鉀）虧缺等環(huán)境脅迫的分子調(diào)控機(jī)理的特異性及生物學(xué)效應(yīng)。主要研究內(nèi)容：主要以擬南芥和水稻為材料，綜合利用遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和蛋白組學(xué)等手段，重點(diǎn)研究磷酸化過程中的LRR-RLKs的磷酸化和鈣信號感受器中CDPK、CIPK類激酶調(diào)控機(jī)理和網(wǎng)絡(luò)，初步闡明它們與其它途徑互作的分子機(jī)制；尋找與蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去甲基化酶相互作用的蛋白以及它們作用的底物和靶基因，確定受蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去甲基化酶調(diào)控的靶基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；明確精氨酸甲基化和組蛋白去甲基化所參與的基因和蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。具體包括：1) LRR-RLKs的磷酸化如何受體內(nèi)、外各種因子的調(diào)控和揭示LRR-RLKs 的生物學(xué)功能，闡明SERKs是如何通過特異性磷酸化來激活多條信號途徑的分子機(jī)理。我們將利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法深入揭示這種特異識別過程在磷酸化水平上的分子機(jī)理。2) CDPK、CIPK類激酶基因缺失或過量表達(dá)時植物對逆境脅迫響應(yīng)的表型及生理生化差異分析；與CDPK、CIPK類激酶互作的上、下游蛋白因子的篩選鑒定，并進(jìn)一步對這些因子的遺傳、表型及對逆境脅迫的反應(yīng)進(jìn)行分析； CDPK、CIPK類激酶對下游蛋白因子的體內(nèi)、外磷酸化作用及調(diào)節(jié)分析，明確CDPK、CIPK類激酶對下游蛋白因子的體內(nèi)、外磷酸化作用。3) 研究NTHK1的各結(jié)構(gòu)域和激酶活性是否調(diào)控植物生物學(xué)反應(yīng)。鑒定相互作用蛋白，用Pulldown及共定位實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證；研究乙烯受體及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白NTHK1, OsETR2和MHZ1等的激酶活性是否調(diào)控植物生物學(xué)反應(yīng)。鑒定相互作用蛋白，研究上述激酶是否磷酸化篩到的互作蛋白及是否調(diào)控相應(yīng)的生物學(xué)反應(yīng)。4) 明確蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶AtPRMT10和AtPRMT5在開花信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用；揭示組蛋白去甲基化酶AtJMJ14催化的表觀修飾調(diào)控植物生長和開花發(fā)育的分子機(jī)制。預(yù)期目標(biāo)：建立通過LRR-RLK、CDPK、CIPK類激酶和乙烯受體激酶磷酸化調(diào)控作用的植物響應(yīng)逆境脅迫及其它生物學(xué)反應(yīng)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型，為較全面地解析植物適應(yīng)環(huán)境脅迫的分子調(diào)控機(jī)理和抗逆性狀的分子遺傳網(wǎng)絡(luò)機(jī)制做出理論貢獻(xiàn)；闡明蛋白質(zhì)精氨酸甲基化和組蛋白去甲基化修飾對開花發(fā)育的調(diào)控作用機(jī)理。明確精氨酸甲基化和組蛋白去甲基化修飾的基因和蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為表觀遺傳調(diào)控機(jī)理提供理論依據(jù)。發(fā)表SCI論文9篇、累計影響因子大于45；培養(yǎng)研究生15名、博士后2人，申請專利2-3項(xiàng)。課題承擔(dān)單位：蘭州大學(xué)，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物研究所課題負(fù)責(zé)人： 黎家，教授，博士，蘭州大學(xué)主要學(xué)術(shù)骨干：楊淑華，教授，博士，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)曹曉風(fēng)，研究員，博士，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物研究所陳麗梅，副教授，博士，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)茍小平，教授，博士，蘭州大學(xué)經(jīng)費(fèi)比例：29%課題2、植物蛋白泛素化降解的機(jī)理與調(diào)控作用設(shè)置思路：盡管國內(nèi)外對泛素介導(dǎo)的蛋白降解途徑進(jìn)行了廣泛的研究，在生理生化、基因克隆和功能分析等方面已經(jīng)取得了重要的進(jìn)展，但是關(guān)于泛素蛋白降解機(jī)制及其參與植物正常生長發(fā)育與植物抵抗逆境脅迫的作用機(jī)制的研究剛剛起步，特別是蛋白質(zhì)其它修飾是如何影響泛素蛋白調(diào)控過程及在植物中的特異性還知道甚少。針對這些關(guān)鍵科學(xué)問題的重要性和緊迫性確定以下研究內(nèi)容。主要研究內(nèi)容:本課題擬將遺傳學(xué)與分子生物學(xué)研究相互結(jié)合、優(yōu)勢互補(bǔ)，以解析植物生長發(fā)育過程以及逆境信號傳導(dǎo)過程相關(guān)的泛素介導(dǎo)的蛋白降解途徑中主效基因的功能為主要研究線索，以植物生長發(fā)育及逆境引起的上游信號傳遞研究為突破口，對植物體內(nèi)蛋白降解機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的研究。具體包括：1) 擬南芥中泛素蛋白體系中26S蛋白酶體組成在植物的不同發(fā)育階段、組織特異性及環(huán)境適應(yīng)性方面的特異性功能和調(diào)控，鑒定特殊組織和特異環(huán)境中植物中新的復(fù)合體及調(diào)控功能。2) 植物泛素結(jié)合酶 (E2) 家族不同成員的功能特異性、與泛素連接酶 (E2) 的特異性互作在底物識別中的調(diào)控作用以及特異性互作的生物學(xué)效應(yīng)。3) 泛素連接酶體SCF復(fù)合體和單亞基RING(U-box) E3 介導(dǎo)的底物泛素化及泛素化降解的機(jī)制和調(diào)控。底物的泛素化位點(diǎn)的鑒定及底物的穩(wěn)定性的生物學(xué)調(diào)控。4) 植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的蛋白降解 (ERAD) 途徑中DOA和HRD復(fù)合體在植物激素信號傳導(dǎo)途徑和植物對生物和非生物逆境響應(yīng)中的特異調(diào)控。5) 蛋白的泛素化修飾及其介導(dǎo)的蛋白降解途徑在植物有性生殖以及胚胎發(fā)育過程中的作用卻了解甚少。擬以分離到的RING的突變體為切入點(diǎn)，來研究蛋白泛素化修飾在植物配子體發(fā)育及胚胎發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制。6) 構(gòu)建擬南芥赤霉素相關(guān)的突變體庫，分離鑒定能夠改變GID1-DELLA-SCFSLY1蛋白復(fù)合體親合力進(jìn)而影響DELLA蛋白的降解，或者影響DELLA蛋白的生物功能活性的res突變體。進(jìn)一步基因克隆和后續(xù)蛋白功能分析，揭示RES基因在提高赤霉素信號傳導(dǎo)中的作用機(jī)理。預(yù)期目標(biāo)：初步揭示并完善植物中泛素介導(dǎo)的蛋白降解途徑相關(guān)的遺傳學(xué)及分子生物學(xué)基礎(chǔ)。從分子生物學(xué)揭示泛素介導(dǎo)的蛋白降解途徑最重要的信號傳遞因子，包括調(diào)控與生長發(fā)育相關(guān)的植物激素JA和GA積累的信息傳遞調(diào)控機(jī)制及與逆境脅迫應(yīng)答相關(guān)的信息傳遞的分子機(jī)理。發(fā)表SCI論文7篇、累計影響因子大于35；培養(yǎng)研究生15名、博士后2人，申請專利1-2項(xiàng)。課題承擔(dān)單位：中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物研究所，北京大學(xué)課題負(fù)責(zé)人： 謝旗，研究員，博士，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物研究所主要學(xué)術(shù)骨干：瞿禮嘉，教授，博士，北京大學(xué)楊小元，副研究員，博士，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物研究所劉敬婧，副研究員，博士，北京大學(xué)高利艷，助理研究員 博士，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物研究所經(jīng)費(fèi)比例：25%（3%組織協(xié)調(diào)和數(shù)據(jù)庫建設(shè)）課題3、植物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸與定位的動態(tài)變化機(jī)制設(shè)置思路：高等植物生長發(fā)育變化適應(yīng)環(huán)境改變的分子機(jī)制目前仍不清楚，但植物內(nèi)源激素及其信號傳導(dǎo)途徑在適應(yīng)環(huán)境過程中扮演著極其重要的功能。最近通過模式植物擬南芥的根系發(fā)育的研究發(fā)現(xiàn)，逆境脅迫時，擬南芥控制植物激素運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白在細(xì)胞中的定位和質(zhì)量控制發(fā)生改變，從而導(dǎo)致一系列的根系發(fā)育變化。但對于如何通過內(nèi)吞小泡使轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白快速從細(xì)胞一側(cè)運(yùn)送到另一側(cè)的調(diào)控機(jī)理不清楚。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的質(zhì)量控制是由于新合成的蛋白不能定位到質(zhì)膜上，還是由于不能正確折疊或折疊不完全而被降解所致的分子機(jī)理也不清楚。針對這些關(guān)鍵科學(xué)問題的重要性確定以下研究內(nèi)容。主要研究內(nèi)容：本課題擬將遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)研究相結(jié)合，在植物在生長發(fā)育以及環(huán)境互作過程中，以控制植物生長發(fā)育和激素分布的關(guān)鍵功能蛋白在細(xì)胞內(nèi)穿梭、定位以及其質(zhì)量控制為主要研究突破口，明確與細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核定位的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，重點(diǎn)研究蛋白質(zhì)的修飾和互作蛋白結(jié)合對其定位和蛋白質(zhì)量控制的影響，揭示植物蛋白質(zhì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和動態(tài)定位變化的分子調(diào)控機(jī)制。具體包括：1) 前期研究發(fā)現(xiàn)DEP1蛋白是一個能在細(xì)胞膜與細(xì)胞核之間穿梭的蛋白，在不同發(fā)育階段和不同組織中也有不同的定位模式，通過遺傳篩選影響DEP1-GFP蛋白在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和定位的red突變體（Repressor of dep-1)，克隆RED基因并研究其生物學(xué)功能。2) 通過DEP1蛋白不同功能域的突變、缺失和置換研究影響DEP1蛋白細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和定位的關(guān)鍵功能域，通過酵母雜交篩選和鑒定DIP（DEP1-interacting proteins）蛋白，深入研究DIP的生物學(xué)功能，明確DIP- DEP1互作共同實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸與定位的蛋白作用機(jī)理。3) 前期研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控生長素運(yùn)輸和水稻分蘗角度的重要蛋白LAZY1 (LA1)是一個在細(xì)胞膜與細(xì)胞核之間穿梭的蛋白，其膜定位和核定位對于LA1的功能都是必需的。在此基礎(chǔ)上，通過基因突變研究確定LA1定位的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域；利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與LA1互作共同實(shí)現(xiàn)穿梭的蛋白因子；分析LA1轉(zhuǎn)錄后修飾和LA1互作蛋白的結(jié)合如何調(diào)控LA1蛋白的定位模式及其穿梭的機(jī)制。4) 茉莉酸和生長素互作調(diào)控PIN蛋白內(nèi)吞和降解的機(jī)制。前期研究發(fā)現(xiàn)茉莉酸既可通過ASA1基因上調(diào)生長素生物合成，又可以通過影響PIN蛋白在質(zhì)膜和胞內(nèi)體(endosome)之間的運(yùn)輸而下調(diào)生長素極性運(yùn)輸，從而精細(xì)調(diào)控植物側(cè)根發(fā)生以增強(qiáng)對外界環(huán)境的適應(yīng)性。通過遺傳篩選獲得了8個抑制asa1-1突變體表型的soa (suppressor of asa1-1)突變體。我們將克隆這些SOA基因并闡明其作用機(jī)理。預(yù)期目標(biāo)：明確LA1被修飾的特性及這種修飾對LA1在細(xì)胞膜與細(xì)胞核之間穿梭的作用，鑒定1-2個與LA1互作共同實(shí)現(xiàn)穿梭的重要因子；分離擬南芥中參與茉莉酸介導(dǎo)的生長素轉(zhuǎn)運(yùn)的新基因，并研究其調(diào)控PIN蛋白內(nèi)吞和降解的機(jī)制；著重研究2-3個影響DEP1蛋白的運(yùn)輸與定位的新調(diào)控元件；初步揭示并完善轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的定位與質(zhì)量控制及其調(diào)控高等植物生長發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)的分子機(jī)制。發(fā)表SCI論文7篇，累計影響因子大于35，培養(yǎng)研究生15名、博士后2人，申請專利1-2項(xiàng)。課題承擔(dān)單位：中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物研究所，蘭州大學(xué)課題負(fù)責(zé)人： 傅向東，研究員，博士，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物研究所主要學(xué)術(shù)骨干：李傳友，研究員，博士，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物研究所王永紅，研究員，博士，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物研究所劉學(xué)英, 助理研究員,博士，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物研究所經(jīng)費(fèi)比例：24%課題、蛋白修飾和降解調(diào)控植物生長發(fā)育的分子機(jī)制設(shè)置思路：蛋白特異性修飾和降解信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究是近年基礎(chǔ)生物學(xué)研究的前沿領(lǐng)域。目前，盡管國內(nèi)外對蛋白修飾和降解途徑進(jìn)行了廣泛的研究，在生理生化、基因克隆和功能分析等方面已經(jīng)取得了重要的進(jìn)展，但是一方面關(guān)鍵元件知道甚少，另一方面如何調(diào)控植物生長發(fā)育及逆境耐性的重要生物學(xué)功能還不清楚，因而極大地限制了通過基因工程提高植物抗逆性在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。針對目前存在以上科學(xué)問題，確定以下研究內(nèi)容。主要研究內(nèi)容：本項(xiàng)目擬將遺傳學(xué)與分子生物學(xué)研究相互結(jié)合、優(yōu)勢互補(bǔ)，以植物生長發(fā)育過程以及逆境信號傳導(dǎo)過程相關(guān)的蛋白降解途徑中主效基因的功能為主要研究線索，以植物生長發(fā)育及逆境引起的上游信號傳遞及降解復(fù)合體如何構(gòu)成的關(guān)鍵問題為研究突破口，對植物體內(nèi)蛋白降解機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的研究。具體包括：1) 蛋白降解與水稻株型及種子發(fā)育的調(diào)控，研究F-box類蛋白初調(diào)控水稻株型及種子發(fā)育的機(jī)理，尋找降解過程受其調(diào)節(jié)的靶蛋白，深入研究該F-box蛋白調(diào)控水稻株型及發(fā)育性狀的分子調(diào)控機(jī)制。2) 擬南芥中泛素蛋白介導(dǎo)的植物激素茉莉素信號傳導(dǎo)途徑的研究, 研究SCFCOI1泛素連接酶復(fù)合體介導(dǎo)的植物雄性不育等生長發(fā)育過程的分子機(jī)制。進(jìn)一步鑒定與SCFCOI1泛素連接酶復(fù)合體介導(dǎo)的茉莉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)的重要基因和蛋白的功能。3) 擬南芥和水稻中參與生物和非生物逆境脅迫下植物防御反應(yīng)的基因功能及其參與的蛋白降解機(jī)制的研究。通過系統(tǒng)的分子和生物化學(xué)分析研究研究F-box蛋白DOR作用的分子機(jī)理，進(jìn)一步探討擬南芥干旱脅迫的分子機(jī)制，為利用該基因提高植物抗旱性提供理論依據(jù)。4) 研究闡明VER2通過影響FLC位點(diǎn)組蛋白修飾進(jìn)而調(diào)控擬南芥春化響應(yīng)及開花時間的分子及生化機(jī)制。研究植物細(xì)胞內(nèi)的O-GlcNAc信號及其與春化響應(yīng)表觀遺傳機(jī)制之間的關(guān)系，探討蛋白的O-GlcNAc修飾對春化相關(guān)蛋白活性的調(diào)控機(jī)制。預(yù)期目標(biāo)：克隆5-10個修飾和降解調(diào)控的靶基因并深入解析其功能和作用機(jī)制，同時評估2-3個基因的應(yīng)用價值，闡明南芥春化響應(yīng)及開花時間的分子及生化機(jī)制和進(jìn)一步探討擬南芥干旱脅迫和生物脅迫的分子機(jī)制，為利用該基因提高植物抗旱性和抗病蟲提供理論依據(jù)。發(fā)表SCI論文7篇，累計影響因子大于35；培養(yǎng)研究生15名、博士后2人，申請專利1-2項(xiàng)。課題承擔(dān)單位：清華大學(xué)，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物研究所，中國科學(xué)院植物研究所課題負(fù)責(zé)人： 謝道昕，教授，博士，清華大學(xué)主要學(xué)術(shù)骨干：刑利靜，副研究員，博士，中國科學(xué)院植物研究所張玉娥，副研究員，博士，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物研究所張貴友，副教授，博士，清華大學(xué)經(jīng)費(fèi)比例：22%根據(jù)本項(xiàng)目關(guān)鍵科學(xué)問題和總體設(shè)想，設(shè)立以上個相應(yīng)的研究課題。課題1著重于植物蛋白質(zhì)翻譯后加工、修飾的發(fā)生、調(diào)節(jié)及生理效應(yīng)基礎(chǔ)研究，目的是建立基礎(chǔ)平臺；課題著重于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的機(jī)理及脅迫條件下蛋白質(zhì)的行為和命運(yùn)；課題著重于蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和動態(tài)轉(zhuǎn)位的機(jī)理、調(diào)節(jié)和效應(yīng)；課題則是在前個課題的基礎(chǔ)上，或者說在已獲得有關(guān)主效基因的基礎(chǔ)上，研究如何通過一個到少數(shù)幾個基因的合理操縱即可實(shí)現(xiàn)動態(tài)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。本研究所涉及到的兩個主要關(guān)鍵科學(xué)問題，即高等植物蛋白質(zhì)修飾與動態(tài)變化，兩者是相互關(guān)聯(lián)，互為補(bǔ)充的。課題之間的相互關(guān)系如下：蛋白磷酸化途徑的調(diào)控 蛋白降解調(diào)節(jié)的機(jī)理 降解和修飾所調(diào)控的靶標(biāo) 植物蛋白質(zhì)功能研究 蛋白質(zhì)運(yùn)輸與定位的機(jī)理甲基化、蛋白糖基化 四、年度計劃年度研究內(nèi)容預(yù)期目標(biāo)第一年1. rmst1和red1突變體表型的具體分析；2. 通過PCR的方法檢驗(yàn)rmst1和red1突變體中突變基因的基因型是否與表型共分離；突變體的表型互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)；3. 完成克隆擬南芥中已克隆但未能表達(dá)的E2在植物活體中的表達(dá)和活性鑒定；4. 篩選水稻中有表型的E2的相關(guān)突變體；5. 鑒定26S蛋白酶體的特異性組裝；6. 利用酵母雙雜交和免疫共沉淀分離互作蛋白；篩選LA1的相互作用蛋白；7. 利用體內(nèi)檢測方法（如BiFC）確定5-10個重要蛋白互作關(guān)系；8. 構(gòu)建擬南芥赤霉素相關(guān)的突變體庫，并開展相關(guān)遺傳篩選；9. 利用EMS化學(xué)誘變，構(gòu)建DEP1-GFP轉(zhuǎn)基因水稻突變體庫，遺傳篩選red突變體；10. 創(chuàng)制DEP1蛋白不同結(jié)構(gòu)域突變、缺失和置換，并構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化水稻；11. 創(chuàng)制LA1蛋白不同結(jié)構(gòu)域突變的突變體，構(gòu)建植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化水稻；12. 完成soa突變體的遺傳分析及基本生物學(xué)特性的分析；13. 構(gòu)建2-3個SOA基因的遺傳作圖群體，并對SOA基因進(jìn)行圖位克??；14. 構(gòu)建2-3個SOA基因的遺傳作圖群體，并對SOA基因進(jìn)行圖位克?。?5. 分析LRR-RLKs的時空表達(dá)模式；16. 篩選LRR-RLKs的轉(zhuǎn)基因植株和缺失突變體；17. 篩選bak1-3 bkk1-1的遺傳抑制子；18. 利用酵母雙雜交檢驗(yàn)SERKs相互作用；19. 創(chuàng)建CDPK、CIPK類激酶基因缺失突變體；20. 創(chuàng)建CDPK、CIPK類激酶基因過量表達(dá)突變體；21. 參加國際會議，邀請?jiān)擃I(lǐng)域的相關(guān)專家來實(shí)驗(yàn)實(shí)進(jìn)行交流1. 明確rmst1和red1突變體突變體的表型；2. 獲得基因型與表型的對應(yīng)關(guān)系，檢驗(yàn)是否共分離；每個擬南芥突變體得到3-5個表型回復(fù)突變體并鑒定其表型回復(fù)程度；3. 明確12個E2的生物學(xué)功能4. 初步確定生物學(xué)功能并與雙子葉植物的相應(yīng)E2功能比較。5. 鑒定出1-2個特異性組裝的26S蛋白酶體亞基。6. 篩選獲得可能與目標(biāo)蛋白相互作用的因子；獲得多個LA1的候選相互作用蛋白；7. 分離和鑒定5-10個重要基因；8. 獲得擬南芥赤霉素相關(guān)的突變體；9. 獲得影響DEP1-GFP融合蛋白定位的red突變體；10. 獲得DEP1蛋白不同結(jié)構(gòu)域改變的轉(zhuǎn)基因水稻；11. 獲得LA1蛋白不同結(jié)構(gòu)域改變的轉(zhuǎn)基因水稻；12. 明確soa突變體在茉莉酸存在下側(cè)根發(fā)生情況及PIN蛋白的降解情況；13. 明確soa突變體在茉莉酸存在下側(cè)根發(fā)生情況及PIN蛋白的降解情況；14. 明確SOA基因的精細(xì)定位；15. 獲得LRR-RLKs的時空表達(dá)模式；16. 開始獲得LRR-RLKs的轉(zhuǎn)基因植株和缺失突變體；17. 開始獲得bak1-3 bkk1-1的遺傳抑制子；18. 得到SERKs之間的相互作用關(guān)系圖；19. 獲得CDPK、CIPK類激酶基因缺失突變體；20. 獲得CDPK、CIPK類激酶基因過量表達(dá)突變體；21. 與相關(guān)專家進(jìn)行交流。第二年1. 表達(dá)目標(biāo)蛋白，并獲得其多克隆抗體；2. 利用高表達(dá)和突變體初步研究第一年度各個課題組所分離鑒定的基因及其編碼蛋白的功能；在突變體背景中高表達(dá)或敲除編碼相互作用的蛋白的基因；3. 初步研究VER2如何影響FLC位點(diǎn)組蛋白修飾；4. 表達(dá)目標(biāo)蛋白，通過體外泛素化實(shí)驗(yàn)檢測其E3活性；5. 通過GUS染色及GFP熒光觀察分析目標(biāo)基因的時空表達(dá)模式；6. 完成 E2與 E3蛋白家族之間特異性分析；7. 建立完整的植物泛素蛋白體外降解體系；8. 構(gòu)建單，雙突變體，研究鑒定出的特異性組裝的26S蛋白酶體亞基的功能；9. 篩選影響DELLA蛋白積累及功能的res突變體，并構(gòu)建遺傳作圖群體；10. 酵母雙雜交篩庫篩選DEP1的相互作用蛋白DIP，并利用BiFC方法進(jìn)行驗(yàn)證；11. 構(gòu)建2-3個RED基因的遺傳作圖群體，并開展RED基因的圖位克隆工作；12. 分析不同突變DEP1轉(zhuǎn)基因水稻表型及蛋白的細(xì)胞定位變化。13. 分析不同LA1突變體蛋白的定位。14. 利用BiFC方法驗(yàn)證LA1與候選互作蛋白的相互作用；同時構(gòu)建Co-IP植物材料。15. 對SOA基因進(jìn)行精細(xì)定位及測序；同時構(gòu)建另外2-3個SOA基因的遺傳作圖群體；16. 繼續(xù)篩選LRR-RLKs缺失突變體及超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物；17. 鑒定LRR-RLKs缺失突變體及超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物的表型；18. 繼續(xù)篩選bak1-3 bkk1-1的遺傳抑制子；19. 尋找SERKs之間相互作用的氨基酸位點(diǎn)；20. 構(gòu)建SERK家族的單基因缺失突變體和多重缺失突變體；21. 開始研究SERKs參與BR及胚胎發(fā)生的分子機(jī)理；22. 開始進(jìn)行SERKs調(diào)控擬南芥維管組織發(fā)育的研究；23. 篩選鑒定與CDPK、CIPK類激酶互作的上下游蛋白因子；24. 開始CDPK、CIPK類激酶基因缺失或過量表達(dá)時植物對逆境脅迫響應(yīng)的表型及生理生化差異分析；25. 尋找與蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去甲基化酶相互作用的蛋白以及它們作用的底物和靶基因；26. 參加國際會議和派研究人員參加蛋白新技術(shù)培訓(xùn)，進(jìn)行國際交流。27. 數(shù)據(jù)分析，論文撰寫。1. 獲得該基因的蛋白表達(dá)載體；2. 獲得相關(guān)的轉(zhuǎn)基因植株，對這些基因的功能有初步了解；3. 明確VER2影響FLC位點(diǎn)組蛋白修飾過程中1-2個基因的功能；4. 獲得該蛋白的E3活性數(shù)據(jù)；5. 獲得目標(biāo)基因表達(dá)的時空特異性數(shù)據(jù)及亞細(xì)胞定位數(shù)據(jù)；6. 得到E2與 E3蛋白家族之間特異性相互作用的圖譜；7. 得到不同處理?xiàng)l件下植物的泛素化蛋白圖譜；8. 初步闡明1-2特異性組裝的蛋白酶體亞基的功能；9. 獲得多個res突變體；10. 獲得多個DIPs候選蛋白；11. 獲得RED基因的精細(xì)定位；12. 初步確定DEP1蛋白定位的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。13. 確定LA1蛋白定位的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。14. 獲得1-2個LA1的互作蛋白。15. 獲得候選2-3個SOA基因。16. 完成篩選LRR-RLKs缺失突變體及超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物；17. 得到LRR-RLKs缺失突變體及超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物的表型分析結(jié)果；18. 獲得bak1-3 bkk1-1的遺傳抑制子；19. 獲得SERKs之間相互作用的氨基酸位點(diǎn)；20. 獲得SERK家族的單基因缺失突變體和多重缺失突變體；21. 明確SERKs之間的相互作用及磷酸化是否依賴于BR；明確SERKs影響胚胎發(fā)生的具體部位與時期；22. 明確SERKs是否與BRL1和BRL3相互作用；23. 獲得與CDPK、CIPK類激酶互作的上下游蛋白因子；24. 完成CDPK、CIPK類激酶基因缺失或過量表達(dá)時植物對逆境脅迫響應(yīng)的表型及生理生化差異分析；25. 得到與蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去甲基化酶相互作用的蛋白以及它們作用的底物和靶基因；26. 根據(jù)國際交流的信息向課題組進(jìn)行匯報。27. 申請專利，發(fā)表2-4篇論文。第三年1. 利用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，尋找與目標(biāo)蛋白相互作用的因子；利用體內(nèi)pull down的方法驗(yàn)證目標(biāo)蛋白與互作因子的相互作用；2. 對與相互作用的蛋白進(jìn)行保守序列分析，并對保守序列進(jìn)行功能為點(diǎn)的定點(diǎn)突變，構(gòu)建表達(dá)突變體蛋白的轉(zhuǎn)基因植株；研究RING蛋白和其它蛋白的識別位點(diǎn)；3. 研究各個ERAD系統(tǒng)基因之間的相互關(guān)系，加深對整個植物ERAD體系的了解；4. 研究ERAD與其他環(huán)境脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)之間的分子機(jī)制，找出其中的關(guān)鍵基因；5. 通過進(jìn)行突變體及轉(zhuǎn)基因表達(dá)的分析，研究基因的功能，并對同一亞組的E3連接酶進(jìn)行分析。6. 深入了解前兩年分離鑒定出的相互作用的蛋白的功能；7. 初步研究F-box類蛋白與水稻株型關(guān)系8. RES基因定位及克隆，并進(jìn)行互補(bǔ)驗(yàn)證；9. 利用Co-IP方法驗(yàn)證DEP1及LA1與互作蛋白的相互作用；構(gòu)建互作蛋白的植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化水稻；10. 構(gòu)建SOA基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥，并進(jìn)行功能研究；11. 對另外2-3個SOA基因進(jìn)行精細(xì)定位及測序，及互補(bǔ)驗(yàn)證和轉(zhuǎn)基因研究；12. 對RED基因進(jìn)行精細(xì)定位并測序分析，并構(gòu)建互補(bǔ)載體，轉(zhuǎn)化水稻；13. 通過生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)一步研究LA1轉(zhuǎn)錄后修飾分析；14. 突變DEP1蛋白轉(zhuǎn)基因水稻分析；15. 研究影響LRR-RLKs磷酸化的作用因子；16. 完成SERKs相互作用在BR信號途徑中的作用機(jī)理研究；17. 完成與CDPK、CIPK類激酶互作的上下游蛋白因子的篩選鑒定；18. 開始進(jìn)行CDPK、CIPK類激酶對下游蛋白因子的體內(nèi)外磷酸化作用及調(diào)節(jié)分析；19. 開始對篩選到的bak1-3 bkk1-1遺傳抑制子進(jìn)行深入的分子機(jī)理研究；20. 繼續(xù)研究SERKs參與BR及胚胎發(fā)生的分子機(jī)理；21. 繼續(xù)進(jìn)行SERKs調(diào)控擬南芥維管組織發(fā)育的研究；22. 利用蛋白質(zhì)組學(xué)如質(zhì)譜等方法確定蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去甲基化酶表觀修飾的位點(diǎn)。23. 數(shù)據(jù)分析，論文撰寫。1. 篩選獲得可能與目標(biāo)蛋白相互作用的因子；體內(nèi)條件下證明其相互作用的真實(shí)性；2. 獲得目標(biāo)蛋白與互作因子的相互作用位點(diǎn)；闡明其中2-3個基因的功能；3. 闡明1-2個ERAD系統(tǒng)基因的作用4. 找到其中的1-2個關(guān)鍵基因；5. 明確2-3個新的E3連接酶的功能。6. 了解其中部分基因的功能及其相互作用的動態(tài)變化和生物學(xué)效應(yīng)；7. 初步明確F-box類蛋白與水稻助興的關(guān)系；8. 獲得候選RES基因；9. 獲得DEP1及LA1的互作蛋白；10. 獲得另外2-3個SOA基因；11. 初步闡述SOA基因在茉莉酸與生長素互作調(diào)控PIN蛋白內(nèi)吞和降解的機(jī)制；12. 獲得候選RED基因；13. 進(jìn)一步證實(shí)LA1的轉(zhuǎn)錄后修飾；14. 明確DEP1蛋白各功能域?qū)Φ鞍锥ㄎ患捌渖飳W(xué)功能影響；15. 明確各種作用因子對LRR-RLKs磷酸化的影響；16. 明確SERKs及其相互作用對BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的作用機(jī)理；17. 獲得并驗(yàn)證與CDPK、CIPK類激酶互作的上下游蛋白因子；18. 明確CDPK、CIPK類激酶對下游蛋白因子的體內(nèi)外磷酸化作用及調(diào)節(jié)分析；19. 初步闡明篩選到的bak1-3 bkk1-1遺傳抑制子基因調(diào)控細(xì)胞死亡的分子機(jī)理；20. 獲得參與胚胎發(fā)生的SERKs相互作用蛋白；21. 獲得SERKs調(diào)控擬南芥維管組織發(fā)育的遺傳學(xué)證據(jù)；22. 確定蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去甲基化酶表觀修飾的位點(diǎn)；23. 發(fā)表6-8篇論文；24. 申請專利1-2項(xiàng)。第四年1. 體內(nèi)條件下檢測互作因子在目標(biāo)突變體中的胚胎發(fā)育或配子體發(fā)育過程中的表達(dá)變化情況；2. 通過轉(zhuǎn)基因植株的表型分析檢測其表達(dá)量的變化是否能夠造成胚胎發(fā)育或配子體發(fā)育相關(guān)的表型；3. 將目標(biāo)突變體與胚胎發(fā)育過程中表達(dá)的重要基因的marker line雜交，觀察marker基因的表達(dá)情況；4. 進(jìn)一步研究ERAD系統(tǒng)的作用機(jī)制及各基因間的相互關(guān)系。5. 系統(tǒng)深入進(jìn)行功能位點(diǎn)的突變，系統(tǒng)深入研究其功能及相互作用蛋白的動態(tài)變化及生物學(xué)效應(yīng)；6. 通過系統(tǒng)的分子和生物化學(xué)分析研究F-box蛋白DOR作用的分子機(jī)理；深入研究F-box類蛋白初調(diào)控水稻株型的機(jī)理；研究F-box類蛋白與種子發(fā)育的關(guān)系；7. 研究VER2通過影響FLC位點(diǎn)組蛋白修飾進(jìn)而調(diào)控擬南芥春化響應(yīng)及開花時間的分子及生化機(jī)制。8. 利用轉(zhuǎn)基因植物初步分析RES基因?qū)ELLA積累及穩(wěn)定性的影響；9. 通過對轉(zhuǎn)基因植物分析DIP對DEP1定位的影響；10. 對克隆到的3-5個SOA基因進(jìn)行系統(tǒng)的功能性研究；11. 系統(tǒng)分析RED基因功能；12. 分析LA1轉(zhuǎn)錄后修飾對LA1與互作蛋白的結(jié)合以及對LA1在細(xì)胞內(nèi)定位的作用。13. 繼續(xù)對SERKs調(diào)控擬南芥維管組織發(fā)育的研究；14. 繼續(xù)CDPK、CIPK類激酶對下游蛋白因子的體內(nèi)外磷酸化作用及調(diào)節(jié)分析；15. 繼續(xù)對篩選到的bak1-3 bkk1-1遺傳抑制子進(jìn)行深入的分子機(jī)理研究；16. 繼續(xù)研究SERKs參與調(diào)控BR及胚胎發(fā)生的分子機(jī)理；17. 通過遺傳和細(xì)胞生物學(xué)手段，闡明蛋白質(zhì)精氨酸甲基化和組蛋白甲基化動態(tài)修飾在開花發(fā)育中的作用18. 數(shù)據(jù)分析，論文撰寫。1. 獲得相互作用蛋白的缺失或過表達(dá)的表型數(shù)據(jù)，檢驗(yàn)是否與胚胎發(fā)育或者配子體發(fā)育相關(guān)；2. 獲得目標(biāo)突變體與相關(guān)marker line雜交的數(shù)據(jù)；3. 得到marker基因的表達(dá)數(shù)據(jù)；4. 深入闡明2-3個ERAD系統(tǒng)中基因的相互作用關(guān)系。5. 完成功能位點(diǎn)的突變，系統(tǒng)闡明其功能及相互作用蛋白的動態(tài)變化及生物學(xué)效應(yīng)；6. 初步闡明F-box蛋白DOR作用的分子機(jī)理；了解F-box類蛋白初調(diào)控水稻株型的機(jī)理；7. 初步闡明VER2通過影響FLC位點(diǎn)組蛋白修飾進(jìn)而調(diào)控擬南芥春化響應(yīng)及開花時間的分子及生化機(jī)制；8. 初步闡明RES基因在GA信號途徑中的位置及功能；9. 闡明DIP與DEP1相互作用調(diào)控水稻穗粒數(shù)和產(chǎn)量的機(jī)制；10. 闡明SOA基因在茉莉酸調(diào)控PIN蛋白內(nèi)吞和降解的分子調(diào)控系統(tǒng)中的作用；11. 明確RED基因功能，及其對DEP1定位的影響；12. 明確LA1轉(zhuǎn)錄后修飾對LA1定位及功能的影響。13. 完成SERKs調(diào)控擬南芥維管組織發(fā)育的研究；14. 完成CDPK、CIPK類激酶對下游蛋白因子的體內(nèi)外磷酸化作用及調(diào)節(jié)分析；15. 深入闡明篩選到的bak1-3 bkk1-1遺傳抑制子基因調(diào)控細(xì)胞死亡的分子機(jī)理；16. 獲得胚胎發(fā)生標(biāo)記基因在serks胚胎發(fā)育突變體中的表達(dá)模式；17. 明確蛋白質(zhì)精氨酸甲基化和組蛋白甲基化動態(tài)修飾在開花發(fā)育中的作用；18. 發(fā)表6-8篇論文。第五年1. 通過體外泛素化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證目標(biāo)蛋白是否能夠泛素化篩選出的相互作用因子；2. 結(jié)合已有的生化結(jié)果及目標(biāo)突變體與marker line雜交的結(jié)果，推斷目標(biāo)蛋白可能的作用機(jī)制； 3. 研究F-box蛋白調(diào)控植物育性的分子及生化機(jī)制；4. 研究植物細(xì)胞內(nèi)的O-GlcNAc信號及其與春化響應(yīng)表觀遺傳機(jī)制之間的關(guān)系；探討蛋白的O-GlcNAc修飾對春化相關(guān)蛋白活性的調(diào)控機(jī)制；深入研究擬南芥春化響應(yīng)及開花時間的分子及生化機(jī)制；5. 探討擬南芥干旱脅迫和生物脅迫的分子機(jī)制；6. 研究DEP1蛋白在細(xì)胞膜-細(xì)胞核穿梭和定位的調(diào)控機(jī)制；7. 利用前面獲得的材料和實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，詳細(xì)解析LA1運(yùn)輸、定位及功能；8. 綜合運(yùn)用分子遺傳學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等多種手段對克隆到的SOA基因進(jìn)行系統(tǒng)的功能性研究；9. 系統(tǒng)解析RES基因的功能；10. 完成對篩選到的bak1-3 bkk1-1遺傳抑制子的分子機(jī)理研究；11. 完成SERKs參與BR及胚胎發(fā)生的分子機(jī)理的研究；12. 組織一個“Protein modification and plant development”小型國際會議；13. 數(shù)據(jù)整理，論文撰寫。14. 評估其中若干個基因的應(yīng)用價值；1. 獲得相互作用因子在體外被該蛋白泛素化并降解的數(shù)據(jù)；2. 推斷目標(biāo)蛋白介導(dǎo)的蛋白泛素化修飾調(diào)控胚胎發(fā)育及配子體發(fā)育的作用機(jī)制。3. 了解F-box蛋白調(diào)控水稻株型及發(fā)育性狀的分子調(diào)控機(jī)制；闡明SCFCOI1泛素連接酶復(fù)合體介導(dǎo)的植物雄性不育等生長發(fā)育過程的分子機(jī)制；4. 闡明VER2通過影響FLC位點(diǎn)組蛋白修飾進(jìn)而調(diào)控擬南芥春化響應(yīng)及開花時間的分子及生化機(jī)制5. 闡明F-box蛋白DOR作用的分子機(jī)理，進(jìn)一步探討擬南芥干旱脅迫的分子機(jī)制，為利用該基因提高植物抗旱性提供理論依據(jù)；6. 闡釋DEP1控制水稻穗粒數(shù)和提高產(chǎn)量的分子機(jī)制；7. 進(jìn)一步明確LA1在細(xì)胞核與細(xì)胞膜間穿梭控制水稻生長素運(yùn)輸及水稻分蘗數(shù)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；8. 揭示SOA基因參與PIN蛋白內(nèi)吞和降解的分子調(diào)控及其作用機(jī)理；9. 明確RES基因參與赤霉素信號途徑的分子機(jī)制；10. 最終闡明SERKs參與調(diào)控BR及胚胎發(fā)生的分子機(jī)理；11. 明確SERKs通過特異磷酸化調(diào)控多條信號通路的分子機(jī)理；12. 進(jìn)行國際交流13. 發(fā)表7-10篇論文；14. 申請專利3-5項(xiàng)；15. 累計培養(yǎng)博士后20名，博士生60名。一、研究內(nèi)容目前，盡管國內(nèi)外對植物系統(tǒng)中蛋白質(zhì)加工、修飾與動態(tài)變化進(jìn)行了廣泛的研究，在資源收集、生理生化以及基因克隆和遺傳轉(zhuǎn)化等方面已經(jīng)取得了重要的進(jìn)展，但是對與植物分子生物學(xué)和遺傳學(xué)密切相關(guān)的關(guān)鍵科學(xué)問題，特別是植物系統(tǒng)中蛋白質(zhì)加工、修飾與動態(tài)變化的調(diào)控及上游信號傳遞的了解不夠深入，極大地限制了我們的深入認(rèn)知。本項(xiàng)目擬將植物蛋白質(zhì)加工、修飾與動態(tài)變化的遺傳學(xué)與分子生物學(xué)研究相互結(jié)合、優(yōu)勢互補(bǔ)，以解析主效基因的功能為主要研究線索，以上游信號傳遞及作用機(jī)制研究為突破口，對植物蛋白質(zhì)加工、修飾與動態(tài)變化的機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的研究。主要研究內(nèi)容包括：1. 植物蛋白修飾的重要過程與調(diào)控機(jī)理；2. 植物蛋白泛素化降解調(diào)控的分子機(jī)理；3. 植物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸與定位的動態(tài)變化機(jī)制；4. 蛋白修飾和降解調(diào)控植物生長發(fā)育的分子機(jī)制。1、植物蛋白的重要修飾過程與調(diào)控機(jī)理本項(xiàng)目將圍繞植物蛋白質(zhì)的磷酸化、甲基化、糖基化等重要修飾形式，研究相關(guān)修飾的重要過程、調(diào)控機(jī)理及生物學(xué)功能。根據(jù)植物蛋白修飾的共性和特異性將研究分為兩個大的方面：（a）植物細(xì)胞重要功能蛋白磷酸化的作用及調(diào)控機(jī)理。蛋白磷酸化在植物信號的接受和傳導(dǎo)中起重要的調(diào)控作用。將著重研究受體類激酶（Receptor -LikeKinases，RLKs）和鈣信使感受器（Ca2+ Sensors）及其下游調(diào)控因子。本課題擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題：(1) LRR-RLKs在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育及響應(yīng)環(huán)境脅迫過程中的生物學(xué)功能；(2) CDPK和CIPK兩個家族中部分成員在植物響應(yīng)非生物逆境（干旱、高鹽、營養(yǎng)虧缺等）脅迫過程中的功能和作用及分子調(diào)控機(jī)理。（b）植物蛋白甲基化和蛋白糖基化的機(jī)理與作用。這方面將著重研究植物的甲基化和蛋白糖基化修飾與動物的共性及植物的特異性機(jī)制及功能。各種蛋白質(zhì)翻譯后修飾對植物開花發(fā)育的分子機(jī)制的影響目前研究得仍處于起步階段。擬以模式植物擬南芥為材料，重點(diǎn)研究蛋白質(zhì)精氨酸甲基化和組蛋白去甲基化在調(diào)控植物開花發(fā)育中的作用及其機(jī)制。主要研究內(nèi)容包括：1) LRR-RLKs的磷酸化如何受體內(nèi)外各種因子的調(diào)控；通過分析超表達(dá)、T-DNA插入突變體及顯性負(fù)調(diào)控突變體來揭示LRR-RLKs 的生物學(xué)功能；SERKs（LRR-RLKs的一亞類）通過特異性磷酸化來激活多條信號途徑的分子機(jī)理。2) CDPK、CIPK類激酶植物對逆境脅迫響應(yīng)的表型及生理生化差異分析；與CDPK、CIPK類激酶互作的上、下游蛋白因子的篩選鑒定；對下游蛋白因子的體內(nèi)、外磷酸化作用及調(diào)節(jié)分析；構(gòu)建通過CDPK、CIPK類激酶磷酸化調(diào)控植物響應(yīng)逆境脅迫的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型。3) 尋找與蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去甲基化酶相互作用的蛋白以及它們作用的底物和靶基因；利用蛋白質(zhì)組學(xué)如質(zhì)譜等方法確定這些表觀修飾的位點(diǎn)；通過遺傳和細(xì)胞生物學(xué)手段，闡明蛋白質(zhì)精氨酸甲基化和組蛋白甲基化動態(tài)修飾在開花發(fā)育中的作用。2、植物蛋白泛素化降解調(diào)控的分子機(jī)理信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是生物學(xué)的重大研究課題，泛素/蛋白酶復(fù)合體（Ubiquitin/26S proteasome）介導(dǎo)的蛋白降解信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究是近年基礎(chǔ)生物學(xué)研究的前沿領(lǐng)域。前期的研究證明利用植物系統(tǒng)易于進(jìn)行遺傳學(xué)操作的特點(diǎn)進(jìn)行泛素化調(diào)控機(jī)制的研究可推動人類的相關(guān)研究。盡管國內(nèi)外對泛素介導(dǎo)的蛋白降解途徑進(jìn)行了廣泛的研究，在生理生化、基因克隆和功能分析等方面已經(jīng)取得了重要的進(jìn)展，但是關(guān)于泛素蛋白降解機(jī)制及其參與植物正常生長發(fā)育和植物抵抗逆境脅迫的作用機(jī)制的研究剛剛起步，特別是對泛素蛋白在植物整個生命活動中起的調(diào)節(jié)作用的了解不夠深入，因而極大地限制了通過基因工程提高植物抗逆性在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。本項(xiàng)目擬將遺傳學(xué)與分子生物學(xué)研究相互結(jié)合、優(yōu)勢互補(bǔ)，以泛素蛋白酶體及降解途徑中主效基因的功能為主要研究線索，研究泛素蛋白的降解機(jī)制，并以植物生長發(fā)育及逆境引起的上游信號傳遞及降解復(fù)合體如何構(gòu)成的關(guān)鍵問題為研究突破口，對植物體內(nèi)蛋白降解機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的研究。主要研究內(nèi)容是：1) 擬南芥中泛素蛋白體系中26S蛋白酶體在植物的不同發(fā)育階段、不同組織及環(huán)境適應(yīng)性方面的功能及調(diào)控機(jī)制。2) 植物泛素結(jié)合酶和泛素連接酶 (E3) 的特異性互作在底物識別中的調(diào)控作用以及特異性互作的生物學(xué)效應(yīng)。3) 泛素連接酶體SCF復(fù)合體和單亞基RING(U-box) E3介導(dǎo)的底物泛素化及泛素化降解的機(jī)制和調(diào)控方式。底物泛素化位點(diǎn)的鑒定及底物穩(wěn)定性的生物學(xué)調(diào)控機(jī)制。4) 植物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的蛋白降解 (ERAD) 在植物激素信號傳導(dǎo)途徑和植物對生物和非生物逆境響應(yīng)中的特異調(diào)控。3、植物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸與定位的動態(tài)變化機(jī)制受逆境脅迫時，高等植物通過調(diào)整自身的生長發(fā)育來適應(yīng)生長環(huán)境的改變，如植物根系發(fā)育會產(chǎn)生一系列的適應(yīng)變化，導(dǎo)致主根生長受抑制和產(chǎn)生更多的側(cè)根等。高等植物生長發(fā)育變化適應(yīng)環(huán)境改變的分子機(jī)制目前仍不清楚，但植物內(nèi)源激素及其信號傳導(dǎo)途徑在適應(yīng)環(huán)境過程中扮演著極其重要的功能。最近通過對模式植物擬南芥根系發(fā)育的研究發(fā)現(xiàn)，逆境脅迫條件下擬南芥控制植物激素運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白在細(xì)胞中的定位和質(zhì)量控制發(fā)生改變，從而導(dǎo)致一系列的根系發(fā)育變化。但對于如何通過內(nèi)吞小泡使轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白快速從細(xì)胞一側(cè)運(yùn)送到另一側(cè)的調(diào)控機(jī)理尚不清楚。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的質(zhì)量控制是由于新合成的蛋白不能定位到質(zhì)膜上，還是由于不能正確折疊或折疊不完全而被降解所致的分子機(jī)理也不清楚。本課題利用模式植物擬南芥和水稻，通過遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)等分析手段研究調(diào)控水稻穗粒數(shù)和產(chǎn)量的DEP1蛋白、影響水稻分蘗角度的LA1蛋白以及調(diào)控植物激素極性運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)蛋白在細(xì)胞內(nèi)穿梭、定位和蛋白質(zhì)量控制的分子機(jī)理及其生物學(xué)效應(yīng)。主要研究內(nèi)容如下：1) 通過遺傳學(xué)篩選獲得影響DEP1-GFP融合蛋白定位的突變體，解析調(diào)控DEP1-GFP蛋白在細(xì)胞膜-細(xì)胞核間穿梭和定位控制的可能的信號途徑； 明確DEP1蛋白的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和定位的關(guān)鍵功能域，并篩選與DEP1互作的DIP（DEP1-interacting proteins）蛋白，并探討DEP1蛋白在細(xì)胞膜-細(xì)胞核穿梭和定位的調(diào)控機(jī)制。2) 通過基因突變研究確定LA1蛋白在細(xì)胞膜與細(xì)胞核之間穿梭與定位，及其影響生長素運(yùn)輸及重力反應(yīng)的的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域；利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與LA1的互作蛋白，進(jìn)一步分析LA1轉(zhuǎn)錄后修飾對LA1互作蛋白的結(jié)合以及對LA1蛋白在細(xì)胞膜與細(xì)胞核之間穿梭的影響。3) ASA1基因既影響生長素生物合成又影響PIN蛋白在質(zhì)膜和胞內(nèi)體之間的運(yùn)輸，通過遺傳篩選獲得茉莉酸介導(dǎo)的PIN蛋白的內(nèi)吞和降解的soa突變體，克隆這些SOA基因并進(jìn)一步開展功能研究，揭示茉莉酸調(diào)控PIN蛋白內(nèi)吞和降解的分子機(jī)理。4、蛋白修飾和降解調(diào)控植物生長發(fā)育的分子機(jī)制生物體蛋白質(zhì)的 “ 轉(zhuǎn)錄 / 翻譯 ” 與 “ 降解 ” 是同樣重要的命題。人們在 “ 轉(zhuǎn)錄和翻譯 ” 的研究中取得了眾所周知的突破?？梢灶A(yù)見, 對蛋白質(zhì)是如何被特異性降解的研究, 必將對生命科學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生重要影響。蛋白特異性降解信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究是近年基礎(chǔ)生物學(xué)研究的前沿領(lǐng)域。目前，盡管國內(nèi)外對蛋白特異性降解途徑進(jìn)行了廣泛的研究，在生理生化、基因克隆和功能分析等方面已經(jīng)取得了重要的進(jìn)展，但是關(guān)于蛋白特異性降解途徑參與植物正常生長發(fā)育以及植物抵抗逆境脅迫的作用機(jī)制的研究剛剛起步，特別是對蛋白特異性降解途徑在植物整個生命活動中的調(diào)節(jié)作用的了解不夠深入，因而極大地限制了通過基因工程提高植物抗逆性在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。本項(xiàng)目擬將遺傳學(xué)與分子生物學(xué)研究相互結(jié)合、優(yōu)勢互補(bǔ)，以植物生長發(fā)育過程以及逆境信號傳導(dǎo)過程相關(guān)的蛋白降解途徑中主效基因的功能為主要研究線索，以植物生長發(fā)育及逆境引起的上游信號傳遞及降解復(fù)合體如何構(gòu)成的關(guān)鍵問題為研究突破口，對植物體內(nèi)蛋白降解機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的研究。主要研究內(nèi)容是：1) 擬南芥中植物激素（茉莉酸、赤霉素和脫落酸）信號介導(dǎo)的蛋白降解對植物生長發(fā)育、雄性不育的調(diào)控機(jī)理。2) 蛋白降解與水稻株型及種子發(fā)育的調(diào)控，研究F-box類蛋白調(diào)控水稻株型及種子發(fā)育的機(jī)理，尋找降解過程受其調(diào)節(jié)的靶蛋白，深入研究該F-box蛋白調(diào)控水稻株型及發(fā)育性狀的分子調(diào)控機(jī)制。3) 擬南芥和水稻中參與生物和非生物逆境脅迫下植物防御反應(yīng)的基因功能及其參與的蛋白降解