第35講 基因工程【課下作業(yè)】1(2018廣西三市聯(lián)考)小鼠基因靶向敲除技術(shù)是采用工程技術(shù)手段使小鼠體內(nèi)的某一基因失去功能，以研究基因在生物個體發(fā)育和病理過程中的作用。例如現(xiàn)有基因型為BB的小鼠，要敲除基因B，可先用體外合成的突變基因b取代正?；駼，使BB細(xì)胞改變?yōu)锽b細(xì)胞，最終培育成為基因敲除小鼠bb。分析回答下列問題：(1)“基因靶向敲除”技術(shù)采用了基因工程的技術(shù)手段?；蚬こ淌侵赴凑杖藗兊脑竿M(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計，并通過_和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性。(2)基因表達(dá)載體應(yīng)包括啟動子、_、_、標(biāo)記基因。目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，首先要檢測轉(zhuǎn)基因生物_，這是目的基因能否在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵。(3)為獲得“基因靶向敲除”的小鼠個體，則應(yīng)將同源目的基因?qū)胄∈蟮腳。此外還必須經(jīng)過_和胚胎移植等胚胎工程的技術(shù)手段，最終由受體母鼠生下來。(4)按上述“基因靶向敲除”操作獲得的多只雌雄小鼠都是雜合子，人們想在此基礎(chǔ)上獲得一個含純合目的基因的個體。簡要的方案是：_。答案：(1)體外DNA重組(2)目的基因終止子DNA上是否插入了目的基因(3)受精卵早期胚胎培養(yǎng)(4)讓獲得的雜合子雌雄小鼠交配，從后代中篩選出含目的基因的純合小鼠2(2018廣州模擬)蟲草中的超氧化物歧化酶(SOD)具有抗衰老作用。研究人員培育了能合成SOD的轉(zhuǎn)基因酵母菌。請結(jié)合圖回答問題：注：Hind和ApaL是兩種限制酶，箭頭表示酶的切割位置。(1)將圖中的重組DNA分子用Hind和ApaL完全酶切后，可得到_種DNA片段。圖示的表達(dá)載體存在氨芐青霉素抗性基因，不能導(dǎo)入用于食品生產(chǎn)的酵母菌中，據(jù)圖分析，可用_切除該抗性基因的部分片段使其失效，再用DNA連接酶使表達(dá)載體重新連接起來。(2)作為受體細(xì)胞的酵母菌缺失URA3基因，必須在含有尿嘧啶的培養(yǎng)基中才能存活，因此，圖示表達(dá)載體上的URA3基因可作為_供鑒定和選擇；為了篩選出成功導(dǎo)入表達(dá)載體的酵母菌，所使用的培養(yǎng)基_(填“需要”或“不需要”)添加尿嘧啶。(3)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程，稱為_。為了確定受體細(xì)胞中SOD基因是否轉(zhuǎn)錄，可用標(biāo)記的_作探針進(jìn)行分子雜交檢測，分子雜交的原理是_。(4)利用蛋白質(zhì)工程獲得活性更高的SOD時，需根據(jù)所設(shè)計蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)推測其_序列，最終確定相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列并經(jīng)基因修飾獲得所需的基因。答案：(1)3ApaL(2)標(biāo)記基因不需要(3)轉(zhuǎn)化SOD基因堿基互補(bǔ)配對(4)氨基酸3(2018海淀區(qū)質(zhì)檢)菊天牛是菊花的主要害蟲之一?？蒲腥藛T將抗蟲基因轉(zhuǎn)入菊花，培育出抗蟲菊花。下圖是獲得轉(zhuǎn)基因菊花的技術(shù)流程，請據(jù)圖回答下列問題：注：卡那霉素抗性基因(kanR)作為標(biāo)記基因，菊花葉片對卡那霉素高度敏感。(1)為了促進(jìn)土壤農(nóng)桿菌吸收重組質(zhì)粒，可用_處理土壤農(nóng)桿菌，使其處于感受態(tài)。(2)將重組質(zhì)粒導(dǎo)入土壤農(nóng)桿菌的目的是利用農(nóng)桿菌能夠_的特點，使目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞中，并插入到菊花細(xì)胞的_上，最終形成轉(zhuǎn)基因植株。(3)將愈傷組織轉(zhuǎn)移到添加一定濃度植物激素和_的培養(yǎng)基中，在適宜條件下進(jìn)行培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)基因菊花。(4)用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因菊花是否含有目的基因時，需根據(jù)_的核苷酸序列設(shè)計特異性引物，以_為模板進(jìn)行第一輪擴(kuò)增。解析：(1)用Ca2處理土壤農(nóng)桿菌，使其處于感受態(tài)，易于吸收外源重組DNA分子。(2)農(nóng)桿菌能夠感染植物細(xì)胞，并將TDNA轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞中，并插入到受體細(xì)胞的染色體DNA上，利用這個特點實現(xiàn)導(dǎo)入目的基因。(3)利用添加卡那霉素的培養(yǎng)基可以篩選含卡那霉素抗性基因的轉(zhuǎn)基因植株。(4)用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因菊花是否含有目的基因時，需根據(jù)目的基因的核苷酸序列設(shè)計特異性引物，以含目的基因的菊花DNA為模板進(jìn)行第一輪擴(kuò)增。答案：(1)Ca2(或“CaCl2溶液”)(2)感染菊花(或“植物”)細(xì)胞，并將TDNA轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞染色體DNA(3)卡那霉素(4)抗蟲基因(目的基因)轉(zhuǎn)基因菊花的DNA(或“含目的基因的菊花DNA”)4(2018武漢調(diào)研)鐮刀型細(xì)胞貧血癥是一種單基因遺傳病，患者的血紅蛋白分子肽鏈第6位氨基酸谷氨酸被纈氨酸代替，導(dǎo)致功能異常?；卮鹣铝袉栴}：(1)異常血紅蛋白的氨基酸序列改變的根本原因是編碼血紅蛋白基因的_序列發(fā)生改變。(2)將正常的血紅蛋白基因?qū)牖颊叩墓撬柙煅杉?xì)胞中，可以合成正常的血紅蛋白達(dá)到治療的目的。此操作_(填“屬于”或“不屬于”)蛋白質(zhì)工程，理由是該操作_。(3)用基因工程方法制備血紅蛋白時，可先提取早期紅細(xì)胞中的_，以其作為模板，在_酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。cDNA與載體需在_酶的作用下，拼接構(gòu)建基因表達(dá)載體，導(dǎo)入受體菌后進(jìn)行表達(dá)。(4)檢測受體菌是否已合成血紅蛋白，可從受體菌中提取_，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行_雜交，若出現(xiàn)雜交帶，則表明該受體菌已合成血紅蛋白。解析：(1)基因是具有遺傳效應(yīng)的DNA片段，遺傳信息儲存在基因堿基對的排列順序中。(2)蛋白質(zhì)工程是指通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類生產(chǎn)和生活的需求，題中所述不屬于蛋白質(zhì)工程。(3)利用反轉(zhuǎn)錄法獲取目的基因時，需先提取mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。cDNA與載體需在限制酶和DNA連接酶的作用下拼接構(gòu)建成基因表達(dá)載體，才可導(dǎo)入受體菌。(4)檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，需要從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原抗體雜交。答案：(1)堿基對(2)不屬于沒有對現(xiàn)有的蛋白質(zhì)進(jìn)行改造(3)mRNA逆轉(zhuǎn)錄限制酶和DNA連接(4)蛋白質(zhì)抗原抗體5GDNF蛋白是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，對損傷的神經(jīng)細(xì)胞具有營養(yǎng)和保護(hù)作用。研究人員構(gòu)建了含GDNF基因的基因表達(dá)載體(如圖所示)，并導(dǎo)入到大鼠神經(jīng)干細(xì)胞，用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。請回答下列相關(guān)問題：(1)在培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞時，常先用_把組織分離，獲得單個細(xì)胞。當(dāng)培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞相互接觸后停止分裂，通過分瓶培養(yǎng)可以使細(xì)胞繼續(xù)增殖，該過程稱為_。(2)除目的基因、啟動子外，基因表達(dá)載體通常還含有_，在構(gòu)建GDNF基因的表達(dá)載體時，需選擇圖中的_限制酶進(jìn)行酶切。(3)根據(jù)上圖，酶切后的載體和GDNF基因經(jīng)_酶處理，可獲得_種含有目的基因的產(chǎn)物。解析：(1)動物細(xì)胞培養(yǎng)時，需要先用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理動物組織，使動物細(xì)胞彼此分離成單個細(xì)胞。動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)接觸抑制的現(xiàn)象。(2)目的基因的表達(dá)載體除了含有目的基因、啟動子外，還要含有終止子和標(biāo)記基因等。從圖中可以看出，目的基因的兩側(cè)含有限制酶Xho的切割位點，所以要用Xho對質(zhì)粒和目的基因進(jìn)行切割。(3)目的基因與質(zhì)粒的結(jié)合要用DNA連接酶處理。從圖中可以看出，獲得的三種質(zhì)粒中，只有2種含有目的基因。答案：(1)胰蛋白酶或膠原蛋白酶傳代培養(yǎng)(2)終止子和標(biāo)記基因Xho(3)DNA連接26(2018山東青島質(zhì)檢)科學(xué)家運用基因工程技術(shù)將結(jié)核桿菌MPT64基因(能控制合成MPT64蛋白)成功導(dǎo)入胡蘿卜細(xì)胞，最終表達(dá)出肺結(jié)核疫苗。請回答下列問題：(1)為獲取MPT64基因，可從結(jié)核桿菌的細(xì)胞中提取對應(yīng)mRNA，在_的作用下合成雙鏈cDNA片段，獲得的cDNA片段與結(jié)核桿菌中該基因堿基序列_(填“相同”或“不同”)。(2)通常采用PCR技術(shù)擴(kuò)增MPT64基因，前提是要有一段已知MPT64基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成_，在操作步驟中需要加熱至9095 的目的是_。(3)根據(jù)農(nóng)桿菌的特點，如果將MPT64基因插入到_上，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以使目的基因進(jìn)入胡蘿卜細(xì)胞，并將其插入到植物細(xì)胞中的_上。要確認(rèn)MPT64基因是否在胡蘿卜植株中表達(dá)，應(yīng)檢測胡蘿卜植株中是否含有_。(4)研究發(fā)現(xiàn)，如果將MPT64蛋白20位和24位的氨基酸改變?yōu)榘腚装彼幔浔４鏁r間將大大延長，科學(xué)家可以生產(chǎn)上述耐儲存的MPT64蛋白的現(xiàn)代生物工程技術(shù)是_。解析：(1)以mRNA為模板，合成cDNA的過程是逆轉(zhuǎn)錄，需要逆轉(zhuǎn)錄酶的催化。由于DNA轉(zhuǎn)錄形成的mRNA過程中非編碼序列不轉(zhuǎn)錄，所以形成的cDNA與結(jié)核桿菌中該基因堿基序列不同。(2)在PCR技術(shù)中，以已知MPT64基因的核苷酸序列為模板，合成引物。在操作步驟中需要加熱至9095 ，以打開目的基因DNA的雙鏈。(3)在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，將MPT64基因插入到農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒的TDNA上，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以使目的基因進(jìn)入胡蘿卜細(xì)胞，并將其插入到植物細(xì)胞中的染色體的DNA上。基因的表達(dá)產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，要確認(rèn)MPT64基因是否在胡蘿卜植株中表達(dá)，應(yīng)檢測胡蘿卜植株中是否含有MPT64蛋白。(4)蛋白質(zhì)工程又叫第二代基因工程，可以通過設(shè)計改造原有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，來滿足人類的生產(chǎn)和生活需求。答案：(1)逆轉(zhuǎn)錄酶不同(2)引物使目的基因DNA受熱變性解旋為單鏈(3)Ti質(zhì)粒的TDNA染色體DNAMPT64蛋白(4)蛋白質(zhì)工程7(2018黑龍江哈爾濱三中模擬)絞股藍(lán)細(xì)胞中含有抗煙草花葉病毒(TMV)基因，可以合成一種抗TMV蛋白，葉片對 TMV具有抗感染性。煙草是重要的經(jīng)濟(jì)作物，由于 TMV 的感染會導(dǎo)致大幅度減產(chǎn)。研究人員利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出了抗TMV的煙草，主要流程如圖所示。(1)科學(xué)家首先從絞股藍(lán)細(xì)胞中提取抗TMV基因轉(zhuǎn)錄的RNA，然后合成目的基因。圖中過程表示 _，獲得的DNA必須在兩側(cè)添加_和_。 (2)過程構(gòu)建重組Ti 質(zhì)粒時，必須使用_和_兩種工具酶。 (3)由圖分析，在過程構(gòu)建的重組Ti質(zhì)粒上應(yīng)該含有卡那霉素抗性基因作為_，重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入煙草體細(xì)胞的方法是_。(4)在過程培養(yǎng)基中除含有卡那霉素及植物必需的各種營養(yǎng)成分外，還必須添加_，以保證受體細(xì)胞能培養(yǎng)成再生植株。(5)過程可采取_的方法，檢測植株是否合成了抗TMV蛋白。在個體水平的鑒定過程中，可通過_的方法來確定植株是否具有抗性。 解析：利用mRNA獲得目的基因的方法是逆轉(zhuǎn)錄法，目的基因的兩端要分別有啟動子和終止子。質(zhì)粒上的抗性基因常用作標(biāo)記基因。檢測目的基因是否完成了表達(dá)常用抗原抗體雜交的方法檢測是否合成了特定的蛋白質(zhì)；常用接種實驗從個體水平上檢測植株是否具有抗病性。答案：(1)逆(反)轉(zhuǎn)錄啟動子終止子(2)限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶)DNA連接酶(3)標(biāo)記基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(4)植物激素(生長素和細(xì)胞分裂素)(5)抗原抗體雜交接種煙草花葉病毒8(2018江西新余聯(lián)考)人參是一種名貴藥材，具有良好的滋補(bǔ)作用?？诜蓴_素在慢性乙肝、丙肝及部分腫瘤的治療中有一定療效。下圖為科研人員制備能合成干擾素的人參愈傷組織細(xì)胞的流程，表示相關(guān)的操作，EcoR、BamH為限制酶，它們的識別序列及切割位點如表所示。請回答下列問題：限制酶識別序列和切割位點EcoRGAATTCBamHGGATCC(1)步驟中，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增干擾素基因時，設(shè)計引物序列的主要依據(jù)是_。科研人員還在兩種引物的一端分別加上了_和_序列，以便于后續(xù)的剪切和連接。(2)過程所構(gòu)建的基因表達(dá)載體中未標(biāo)注出的必需結(jié)構(gòu)還有_，過程中需先用_處理農(nóng)桿菌以便將基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞。(3)過程中，科研人員提取愈傷組織細(xì)胞的RNA后，先通過_過程獲得DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若最終未能檢測出干擾素基因，其可能原因是_。(4)治療中發(fā)現(xiàn)，用于口服的干擾素在胃中會受到一定程度的破壞影響其功效，需要利用_技術(shù)加以改造，以達(dá)到滿意效果。解析：(1)設(shè)計引物序列的主要依據(jù)是干擾素基因兩端的部分核苷酸序列。后期需要用限制酶進(jìn)行切割，所以在兩種引物的一端分別加上了GAATTC和GGATCC序列。(2)構(gòu)建的基因表達(dá)載體中還需要復(fù)制原點。過程中需先用Ca2處理農(nóng)桿菌以便將基因表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞。(3)RNA通過逆轉(zhuǎn)錄形成DNA，若最終未能檢測出干擾素基因，其可能原因是干擾素基因未能導(dǎo)入人參愈傷組織細(xì)胞或?qū)肴藚⒂鷤M織細(xì)胞的干擾素基因未能轉(zhuǎn)錄。(4)對干擾素進(jìn)行改造需要利用蛋白質(zhì)工程。答案：(1)干擾素基因兩端的部分核苷酸序列GAATTCGGATCC(2)復(fù)制原點Ca2(3)逆轉(zhuǎn)錄干擾素基因未能導(dǎo)入人參愈傷組織細(xì)胞或?qū)肴藚⒂鷤M織細(xì)胞的干擾素基因未能轉(zhuǎn)錄 (4)蛋白質(zhì)工程