2019-2020年新人教版高中生物選修1課題5.2多聚酶鏈式反應擴增DNA片段詳細教案設計附課堂練習課題目標（一）知識與技能1、了解PCR技術的基本操作2、理解PCR的原理3、討論PCR的應用（二）過程與方法在多聚酶鏈式反應擴增DNA片段的實驗過程中，應避免外源DNA污染，嚴格控制溫度等反應條件（三）情感、態(tài)度與價值觀 通過對PCR實驗的操作及結果分析，培養(yǎng)學生嚴謹?shù)目茖W態(tài)度和實事求是的科研精神課題重點PCR的原理和PCR的基本操作課題難點 PCR的原理教學方法 啟發(fā)式教學教學工具 多媒體課件教學過程（一）引入新課在現(xiàn)代生物技術中，DNA技術可謂是尖端技術。人類基因組計劃、基因工程、基因診斷、基因檢測、古生物鑒定等都離不開對DNA分子堿基序列的分析。而分析DNA堿基序列，就需要一定量的DNA片段。怎樣迅速獲得足夠量的DNA片段呢？今天我們來研究學習DNA分子的擴增技術PCR技術。（二）進行新課1基礎知識PCR技術擴增DNA的過程，與細胞內(nèi)DNA復制過程類似：11細胞內(nèi)DNA復制條件分析：條件組分作用模板DNA的兩條單鏈提供復制的模板原料四種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料酶解旋酶DNA聚合酶打開DNA雙螺旋催化合成DNA子鏈能量ATP為解螺旋和合成子鏈供能引物RNA為DNA聚合酶提供合成的3端起點12細胞內(nèi)DNA復制過程（1）DNA的反向平行結構：（結合教材圖56）核苷酸分子的結構與方向性：（分子結構模式圖）由核苷酸通過3,5-磷酸二酯鍵連接形成核苷酸長鏈：（模式圖，體現(xiàn)方向性）。DNA雙螺旋結構的反向平行結構：（2）DNA的復制過程:解 旋：解旋酶、ATP，DNA兩條鏈打開，形成兩條DNA單鏈。引物結合：在DNA單鏈3端與DNA反向配對結合，確保引物3端與DNA單鏈準確配對。DNA聚合酶結合：子鏈合成：DNA聚合酶從引物3端開始，將配對的脫氧核苷酸連接起來。后續(xù)加工：DNA聚合酶I將引物切去，并合成空缺處的DNA單鏈，再由DNA連接酶將不連續(xù)的DNA子鏈連接起來（半不連續(xù)合成。先導鏈，滯后鏈）子鏈合成特點：不能從頭合成；合成方向為“53合成”。感悟生命的神秘：DNA聚合酶不但能夠催化磷酸二酯鍵的形成，還具有校對功能。它在每引入一個核苷酸后都要復查一次，只有堿基配對無誤后才能繼續(xù)往下聚合，它不能從頭合成。RNA聚合酶沒有校對功能，因此RNA的合成不需要引物，而是從頭合成的，它的錯配可能性較大，在RNA引物完成功能后即被DNA聚合酶I刪去，代之以高保真的DNA鏈。思考DNA分子能準確復制的原因有哪些？DNA雙螺旋結構提供模板；堿基互補配對；DNA聚合酶的復查功能。思考細胞內(nèi)哪些物質(zhì)是從頭合成的？RNA合成、蛋白質(zhì)合成。13DNA分子復制的人工控制解開螺旋：在80100時，DNA雙螺旋打開，形成兩條DNA單鏈，稱為變性?；謴吐菪涸?0左右時，兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋結構，稱為復性。復制條件：緩沖液,DNA模板,四種脫氧核苷酸,熱穩(wěn)定DNA聚合酶,兩種引物。反應場所：PCR儀（自動溫度周期性調(diào)節(jié)）。思考緩沖液相當細胞內(nèi)的什么成分？（核基質(zhì)）4PCR的反應過程延伸復性變性變性：在95時DNA解旋復性：在50時引物與DNA單鏈結合延伸：在72時合成DNA子鏈（兩個引物間的序列）2實驗操作21 PCR反應體系：緩沖液、DNA模板，四種脫氧核苷酸原料、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種RNA引物，水22 實驗操作步驟23 按照PCR反應體系配方配制反應液；（2）將PCR反應體系50L用微量移液器轉(zhuǎn)移到微量離心管（0.5mL）中；（3）將微量離心管放到PCR儀中；（4）設置PCR儀的工作參數(shù)。（5）DNA在PCR儀中大量擴增。24 水浴法：將微型離心管依次在95、55、72的恒溫水浴鍋中循環(huán)處理相應時間。3實驗注意事項31避免外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌。32緩沖液和酶分裝成小份，20低溫保存。33每添加一種反應成分，更換一個移液器的槍頭。34混勻后離心處理，使反應液集中在離心管底部。4結果分析與評價41反應液稀釋：取2LPCR反應液，添加98L蒸餾水；2分光光度計調(diào)零：將100L蒸餾水添加到比色杯中，在260nm處將分光光度計調(diào)整讀數(shù)為零。42將100L反應稀釋液倒入比色杯中，測定在260nm處的光吸收值。43計算：DNA含量50光吸收值稀釋倍數(shù)（三）課堂總結、點評多聚酶鏈式反應擴增DNA片段PCR原理DNA的復制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復性受溫度影響PCR過程變性復性延伸操作步驟配制PCR反應體系移入離心管放入PCR設置工作參數(shù)DNA擴增測定含量稀釋調(diào)零測定并讀數(shù)計算（四）實例探究例1 在（ ）的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結構解開 A. 1020 B. 80100 C. 2030 D. 4060解析：蛋白質(zhì)大多不能忍受6080的高溫，而DNA在80以上才會變性。答案：B例2 關于DNA的復制，下列敘述正確的是（ ）A.DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從5端延伸DNA鏈B.DNA復制不需要引物C.引物與DNA母鏈通過堿基互補配對進行結合D.DNA的合成方向總是從子鏈的3端向5端延伸解析：由于DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3端即復制方向由3端向5端延伸；由于DNA分子是反向平行的，子鏈是依據(jù)堿基互補配對原則，在DNA聚合酶作用下合成的，其合成方向是從子鏈5端向3端延伸。答案：C綜合應用例3 下列有關PCR描述，不正確的是（ ）A.是一種酶促反應B.引物決定了擴增的特異性C.擴增產(chǎn)量按y（1X）nD.擴增對象是氨基酸序列E.擴增對象是DNA序列解析：PCR是一種體外迅速擴增DNA片段的技術，它以極少量的DNA為模板，以四種脫氧核苷酸為原理，在引物的作用下使DNA聚合酶從引物的3端連接脫氧核苷酸，短時間內(nèi)迅速復制上百萬份的DNA拷貝，其擴增產(chǎn)量為y（1X）n，y代表DNA片段擴增后的拷貝數(shù)，x表示平均每次的擴增效率，n代表循環(huán)次數(shù)，因此答案選D。答案：D（五）鞏固練習1DNA分子復制時，解旋的兩條鏈中（ ）A僅一條作為復制模板 B兩條鏈作為模板并復制出兩個不同的DNA分子C兩條鏈作為模板并復制出兩個相同的DNA分子D兩條鏈作為模板，各自合成一條子鏈，然后兩條母鏈重新結合為原來的雙螺旋分子，兩條新鏈結合成一個全新的DNA分子2.下列關于DNA復制過程的正確順序是（ ）互補堿基對之間氫鍵斷裂互補堿基對之間形成氫鍵DNA分子在解旋酶的作用下解旋以解旋后的母鏈為模板進行堿基互補配對子鏈與母鏈盤旋成雙螺旋狀結構A B C D3.下列各項過程中，遵循“堿基互補配對原則”的有（ ）DNA復制RNA復制轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄A B C D4.實驗室內(nèi)模擬生物體DNA的復制必需的一組條件是（ ）酶游離的脫氧核苷酸ATPDNA分子mRNAtRNA適宜的溫度適宜的酸堿度A B C D5.利用PCR技術，把一個雙鏈DNA分子當作第一代，經(jīng)過3次循環(huán)，在第四代DNA分子中，有幾條第一代脫氧核苷酸的長鏈？（ ）A 2 B 4 C 8 D 16，6.關于DNA分子的敘述中，正確的是（ ）A .DNA的兩條鏈是極性相同，同向平行 B.DNA的兩條鏈是極性相同，反向平行C.DNA的兩條鏈中極性不同，反向平行的 D.DNA的兩條鏈是極性不同，同向平行7.假設PCR反應中，只有一個DNA的片段作為模板，請計算在30次循環(huán)后，反應物中大約有多少這樣的DNA片段（ ）A 215 B 230 C 260 D 2318.DNA的合成方向總是（ ）延伸。A從DNA分子的左端向右端 B從DNA分子的右端向左端C從子鏈的5，端向3，端 D從子鏈的3，端向5，端9.要使PCR反應在體外的條件下順利地進行，需要嚴格的控制（ ）A 氧氣的濃度 B酸堿度 C溫度 D 大氣的濕度10.DNA分子經(jīng)PCR反應循環(huán)一次后，新合成的那條子鏈的脫氧核苷酸的序列應與（ ）A模板母鏈相同 B非模板母鏈相同 C兩條模板母鏈相同 D兩條模板母鏈都不相同答案： CDADA CBCCB課余作業(yè)1、PCR與生物體DNA復制有何區(qū)別？2、如果在案件偵破過程中，只收集到一根毛發(fā)，但它所含的遺傳信息太少，該怎么辦呢？教學體會教師在教學過程中，可以鮮引導學生回憶必修2的有關DNA復制的知識，在此基礎上，學生可加深對于PCR原理的認識。對于PCR反應過程的教學，應以讀圖識圖為主。教材中反應過程圖解詳細的描繪了參與PCR的各種組成成分；每一輪反應的三個基本步驟變性、復性、延伸；每一步驟的作用。教師在教學中可以請學生在讀圖的同時，結合教科書中的文字說明來加深理解。當學生遇到難以理解的地方時，教師要及時給予解答。資料袋免疫-PCR免疫-PCR(immuno-PCR)是新近建立的一種靈敏、特異的抗原檢測系統(tǒng).它利用抗原-抗體反應的特異性和PCR擴增反應的極高靈敏性來檢測抗原，尤其適用于極微量抗原的檢測. 免疫-PCR試驗的主要步驟有三個:抗原-抗體反應，與嵌合連接分子結合，PCR擴增嵌合連接分子中的DNA(一般為質(zhì)粒DNA).該技術的關鍵環(huán)節(jié)是嵌合連接分子的制備.在免疫-PCR中，嵌合連接分子起著橋梁作用，它有兩個結合位點，一個與抗原抗體復合物中的抗體結合，一個與質(zhì)粒DNA結合，其基本原理與ELISA和免疫酶染色相似，不同之處在于其中的標記物不是酶而是質(zhì)粒DNA，在操作反應中形成抗原抗體-連接分子-DNA復合物，通過PCR擴增DNA來判斷是否存在特異性抗原. 免疫PCR優(yōu)點為:特異性較強，因為它建立在抗原抗體特異性反應的基礎上.敏感度高，PCR具有驚人的擴增能力，免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上，可用于單個抗原的檢測.操作簡便，PCR擴增質(zhì)粒DNA比擴增靶基因容易得多，一般實驗室均能進行.