專題十六基因工程和細(xì)胞工程考點考情1基因工程的誕生()2基因工程的原理及技術(shù)(含PCR)()3基因工程的應(yīng)用()4蛋白質(zhì)工程()5植物的組織培養(yǎng)()6動物的細(xì)胞培養(yǎng)與體細(xì)胞克隆()7細(xì)胞融合與單克隆抗體()1近五年的全國卷高考試題中對于基因工程的考查頻度較高，側(cè)重考查操作工具的種類、功能以及操作基本程序的應(yīng)用等。動物細(xì)胞工程技術(shù)中的核移植技術(shù)及單克隆抗體的制備也有所考查。2題目常借助簡潔的文字材料或模式圖等考查有關(guān)基因工程、動物細(xì)胞工程的原理、技術(shù)手段等，尤為注重對教材中一些關(guān)鍵詞的填充及對結(jié)論性語句的準(zhǔn)確表述等。3備考時，應(yīng)從以下四個方面入手復(fù)習(xí)：(1)列表比較法掌握限制酶、DNA連接酶和運載體的作用。(2)實例分析法理解基因工程的原理和過程。(3)列表比較法理解兩個不同，即植物組織培養(yǎng)和動物細(xì)胞培養(yǎng)的不同、植物體細(xì)胞雜交與動物細(xì)胞融合的不同。(4)圖解法分析并掌握單克隆抗體制備過程。H(1)質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于細(xì)菌擬核DNA之外，并且具有自我復(fù)制能力的很小的環(huán)狀DNA分子。()(2)DNA分子經(jīng)限制酶切割后產(chǎn)生的DNA片段末端一定是黏性末端。()(3)基因表達載體組成除了目的基因外，還必須有啟動子、終止子以及標(biāo)記基因等。()(4)啟動子是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位。()(5)基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)工程則可對現(xiàn)有蛋白質(zhì)進行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)。()(6)微型繁殖技術(shù)既能保持優(yōu)良品種的遺傳特性，還可以高效快速地實現(xiàn)種苗的大量繁殖。()(7)動物細(xì)胞培養(yǎng)中需用胃蛋白酶或膠原蛋白酶將組織細(xì)胞分散成單個細(xì)胞。()(8)原代培養(yǎng)的細(xì)胞遺傳物質(zhì)沒有改變，而傳代培養(yǎng)的細(xì)胞有的已經(jīng)發(fā)生突變，獲得了不死性。()(9)動物體細(xì)胞核移植技術(shù)獲得的克隆動物在遺傳性狀上與供核母體完全一致。()(10)動物細(xì)胞融合技術(shù)和植物體細(xì)胞雜交技術(shù)類似，也可獲得雜種動物。()考向一基因工程Z1(2018全國卷)回答下列問題：(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞中進行了表達。該研究除證明了質(zhì)?？梢宰鳛檩d體外，還證明了_體外重組的質(zhì)?？梢赃M入受體細(xì)胞；真核生物基因可在原核細(xì)胞中表達_(答出兩點即可)。(2)體外重組的質(zhì)?？赏ㄟ^Ca2參與的_轉(zhuǎn)化_方法導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞；而體外重組的噬菌體DNA通常需與_外殼蛋白(或答噬菌體蛋白)_組裝成完整噬菌體后，才能通過侵染的方法將重組的噬菌體DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞。在細(xì)菌、心肌細(xì)胞、葉肉細(xì)胞中，可作為重組噬菌體宿主細(xì)胞的是_細(xì)菌_。(3)真核生物基因(目的基因)在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達時，表達出的蛋白質(zhì)可能會被降解。為防止蛋白質(zhì)被降解，在實驗中應(yīng)選用_蛋白酶缺陷型_的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，在蛋白質(zhì)純化的過程中應(yīng)添加_蛋白酶_的抑制劑。解析(1)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導(dǎo)入大腸桿菌中，該過程利用的技術(shù)是基因工程。該研究除了證明質(zhì)?？勺鳛檩d體外，還證明了體外重組的質(zhì)粒可以進入受體細(xì)胞，真核生物基因可在原核細(xì)胞中表達等。(2)重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞可采用Ca2參與的轉(zhuǎn)化方法；體外重組噬菌體要通過將體外重組的噬菌體DNA和外殼蛋白(或噬菌體蛋白)進行組裝獲得；因為噬菌體是專門寄生在細(xì)菌中的病毒，所以宿主細(xì)胞選用細(xì)菌。(3)為防止蛋白質(zhì)被降解，在實驗中應(yīng)選用蛋白酶缺陷型的大腸桿菌作為受體細(xì)胞；在蛋白質(zhì)純化過程中，為防止目的蛋白質(zhì)被降解，需要添加蛋白酶的抑制劑。2(2017全國卷)真核生物基因中通常有內(nèi)含子，而原核生物基因中沒有，原核生物沒有真核生物所具有的切除內(nèi)含子對應(yīng)的RNA序列的機制。已知在人體中基因A(有內(nèi)含子)可以表達出某種特定蛋白(簡稱蛋白A)?；卮鹣铝袉栴}：(1)某同學(xué)從人的基因組文庫中獲得了基因A，以大腸桿菌作為受體細(xì)胞卻未得到蛋白A，其原因是_基因A有內(nèi)含子，在大腸桿菌中，其初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中與內(nèi)含子對應(yīng)的RNA序列不能被切除，無法表達出蛋白A_。(2)若用家蠶作為表達基因A的受體，在噬菌體和昆蟲病毒兩種載體中，不選用_噬菌體_作為載體，其原因是_噬菌體的宿主是細(xì)菌，而不是家蠶_。(3)若要高效地獲得蛋白A，可選用大腸桿菌作為受體，因為與家蠶相比，大腸桿菌具有_繁殖快、容易培養(yǎng)_(答出兩點即可)等優(yōu)點。(4)若要檢測基因A是否翻譯出蛋白A，可用的檢測物質(zhì)是_蛋白A的抗體_(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗體”)。(5)艾弗里等人的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗為證明DNA是遺傳物質(zhì)做出了重要貢獻，也可以說是基因工程的先導(dǎo)，如果說他們的工作為基因工程理論的建立提供了啟示，那么，這一啟示是_DNA可以從一種生物個體轉(zhuǎn)移到另一種生物個體_。解析(1)人為真核生物，從人的基因組文庫中獲取的基因A含有內(nèi)含子，基因A轉(zhuǎn)錄出的產(chǎn)物中有與內(nèi)含子對應(yīng)的RNA序列。大腸桿菌為原核生物，沒有真核生物所具有的切除內(nèi)含子對應(yīng)的RNA序列的機制，因此以大腸桿菌作為受體細(xì)胞，不能切除內(nèi)含子對應(yīng)的RNA序列，無法表達出蛋白A。(2)噬菌體和動物病毒均可作為基因工程的載體，但它們的宿主細(xì)胞不同。題中受體為家蠶，是一種昆蟲，因此，選擇昆蟲病毒作為載體，噬菌體的宿主是細(xì)菌，不適合作為該實驗的載體。(3)大腸桿菌具有繁殖快、容易培養(yǎng)、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少等優(yōu)點，因此，常作為基因工程的受體細(xì)胞。(4)常用抗原抗體雜交的方法檢測目的基因是否表達，故能用于檢測蛋白A的物質(zhì)為蛋白A的抗體。(5)艾弗里等人的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗中，S型菌的DNA轉(zhuǎn)移到了R型菌體內(nèi)，其對基因工程理論的建立提供的啟示是DNA可以從一種生物個體轉(zhuǎn)移到另一種生物個體。3(2017全國卷)幾丁質(zhì)是許多真菌細(xì)胞壁的重要成分，幾丁質(zhì)酶可催化幾丁質(zhì)水解。通過基因工程將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，可增強其抗真菌病的能力。回答下列問題：(1)在進行基因工程操作時，若要從植物體中提取幾丁質(zhì)酶的mRNA，常選用嫩葉而不選用老葉作為實驗材料，原因是_嫩葉組織細(xì)胞易破碎_。提取RNA時，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是_防止RNA降解_。(2)以mRNA為材料可以獲得cDNA，其原理是_在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補配對的原則可以合成cDNA_。(3)若要使目的基因在受體細(xì)胞中表達，需要通過質(zhì)粒載體而不能直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，原因是_目的基因無復(fù)制原點；目的基因無表達所需啟動子_(答出兩點即可)。(4)當(dāng)幾丁質(zhì)酶基因和質(zhì)粒載體連接時，DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是_磷酸二酯鍵_。(5)若獲得的轉(zhuǎn)基因植株(幾丁質(zhì)酶基因已經(jīng)整合到植物的基因組中)抗真菌病的能力沒有提高，根據(jù)中心法則分析，其可能的原因是_目的基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯異常_。解析(1)在進行基因工程操作時，若要從植物體中提取幾丁質(zhì)酶的mRNA，常選用嫩葉而不選用老葉作為實驗材料，原因是相對于老葉而言嫩葉組織細(xì)胞更容易被破碎。提取RNA時，提取液中需添加RNA酶抑制劑，其目的是防止RNA降解。(2)以mRNA為材料獲得cDNA的原理是在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以mRNA為模板按照堿基互補配對的原則可以合成cDNA。(3)若要使目的基因在受體細(xì)胞中表達，需要通過質(zhì)粒載體而不能直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，原因是目的基因無復(fù)制原點且目的基因無表達所需啟動子。(4)DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是磷酸二酯鍵。(5)若獲得的轉(zhuǎn)基因植株不具備所期望的性狀表現(xiàn)，根據(jù)中心法則分析，其可能的原因是目的基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯異常。4(2017全國卷)編碼蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五個片段組成，編碼蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段組成，如圖1所示。回答下列問題：(1)先要通過基因工程的方法獲得蛋白乙，若在啟動子的下游直接接上編碼蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCTCAGGAAGGA)，則所構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞后不能翻譯出蛋白乙，原因是_編碼乙的DNA序列起始端無ATG，轉(zhuǎn)錄出的mRNA無起始密碼子_。(2)某同學(xué)在用PCR技術(shù)獲取DNA片段B或D的過程中，在PCR反應(yīng)體系中加入了DNA聚合酶、引物等，還加入了序列甲作為_模板_，加入了_dNTP_作為合成DNA的原料。(3)現(xiàn)通過基因工程方法獲得了甲、乙、丙三種蛋白，要鑒定這三種蛋白是否具有刺激T淋巴細(xì)胞增殖的作用，某同學(xué)做了如下實驗：將一定量的含T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)液平均分成四組，其中三組分別加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一組作為對照，培養(yǎng)并定期檢測T淋巴細(xì)胞濃度，結(jié)果如圖2。由圖2可知，當(dāng)細(xì)胞濃度達到a時，添加蛋白乙的培養(yǎng)液中T淋巴細(xì)胞濃度不再增加，此時若要使T淋巴細(xì)胞繼續(xù)增殖，可采用的方法是_進行細(xì)胞傳代培養(yǎng)_。細(xì)胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)箱中通常要維持一定的CO2濃度，CO2的作用是_維持培養(yǎng)液的pH_。僅根據(jù)圖1、圖2可知，上述甲、乙、丙三種蛋白中，若缺少_C_(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所編碼的肽段，則會降低其刺激T淋巴細(xì)胞增殖的效果。解析(1)若在啟動子的下游直接接上編碼蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCTCAGGAAGGA)，則轉(zhuǎn)錄出的mRNA上缺少起始密碼子，故不能翻譯出蛋白乙。(2)使用PCR技術(shù)獲取DNA片段時，應(yīng)在PCR反應(yīng)體系中添加引物、耐高溫的DNA聚合酶、模板、dNTP作為原料。(3)T淋巴細(xì)胞濃度之所以不再增加，是因為細(xì)胞間出現(xiàn)接觸抑制，因此若要使T淋巴細(xì)胞繼續(xù)增殖，需要對貼滿瓶壁的細(xì)胞使用胰蛋白酶處理，然后分瓶培養(yǎng)，即細(xì)胞傳代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)箱中通常要維持一定的CO2濃度，以維持培養(yǎng)液的pH。據(jù)圖分析，蛋白丙與對照接近說明B、D片段對于T淋巴細(xì)胞增殖不是非常重要，蛋白甲和乙對T淋巴細(xì)胞的增殖都有較大影響，甲、乙兩種蛋白中共同的片段是C，所以缺少C片段會降低其刺激T淋巴細(xì)胞增殖的效果。H1理清基因工程3種操作工具的作用與特點項目限制酶DNA連接酶運載體作用切割_目的基因和運載體_拼接DNA片段，形成_重組DNA分子_攜帶目的基因進入_受體細(xì)胞_作用部位兩核苷酸的脫氧核糖與磷酸間形成的磷酸二酯鍵作用特點(條件)識別特定的核苷酸序列；在特定位點上切割DNA分子EcoliDNA連接酶只能連接黏性末端；_T4DNA_連接酶能連接黏性末端和平末端能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在并大量_復(fù)制_；有一個至多個_限制酶切割位點_；具有特殊的_標(biāo)記基因_2掌握獲取目的基因的3種途徑(1)直接分離：從自然界已有的物種中分離，如從_基因文庫_中獲取。(2)人工合成目的基因(常用方法如下)化學(xué)合成法：已知核苷酸序列的較小基因，直接利用_DNA合成儀_用化學(xué)方法合成，不需要模板。人工合成法：以_RNA_為模板，在_逆轉(zhuǎn)錄酶_的作用下人工合成。(3)利用_PCR_技術(shù)擴增。3牢記基因表達載體的構(gòu)建(1)基因表達載體的組成：目的基因啟動子終止子_標(biāo)記基因_復(fù)制原點。(2)啟動子和終止子：啟動子是_RNA聚合酶_識別和結(jié)合的部位，啟動轉(zhuǎn)錄；終止子是_終止轉(zhuǎn)錄_的位點。(3)基因表達載體的構(gòu)建過程4將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞生物種類植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法_農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化_法、基因槍法、花粉管通道法等_顯微注射_技術(shù)_感受態(tài)細(xì)胞_法(Ca2處理法)受體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞5理清目的基因的檢測與鑒定(1)導(dǎo)入檢測：_DNA分子_雜交技術(shù)(使用DNA探針)(2)表達檢測(3)個體生物學(xué)水平鑒定：如對轉(zhuǎn)基因作物進行抗蟲或抗病等的接種實驗。T題型1基因工程的操作工具和流程1(2016全國卷)某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tett中會導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tett表示四環(huán)素抗性基因)。有人將此質(zhì)粒載體用BamHI酶切后，與用BamHI酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌?；卮鹣铝袉栴}：(1)質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應(yīng)具備的基本條件有_能自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因_(答出兩點即可)，而作為基因表達載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子。(2)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的，其原因是_二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長_；并且_含有質(zhì)粒載體_和_含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒(或答含有重組質(zhì)粒)_的細(xì)胞也是不能區(qū)分的，其原因是_二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長_。在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有_四環(huán)素_的固體培養(yǎng)基。(3)基因工程中，某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為運載體，其DNA復(fù)制所需的原料來自于_受體細(xì)胞_。解析(1)作為運載體的質(zhì)粒上應(yīng)有一個至多個限制酶切割位點，在細(xì)胞中能夠自我復(fù)制，并含有特殊的標(biāo)記基因。(2)未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌和僅含環(huán)狀目的基因的大腸桿菌中均未導(dǎo)入質(zhì)粒載體，而質(zhì)粒上含有氨芐青霉素抗性基因，因此這樣的大腸桿菌在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中不能生長。含有質(zhì)粒載體和含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌中都含有氨芐青霉素抗性基因，二者在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中都能生長，因此無法區(qū)分二者。由題圖可知，用BamHI切割質(zhì)粒后將四環(huán)素抗性基因破壞，因此可將經(jīng)氨芐青霉素培養(yǎng)基篩選出的菌落置于含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上再次篩選，能在含四環(huán)素培養(yǎng)基上生存的是含有質(zhì)粒載體的大腸桿菌，不能生存的是含有插入目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。(3)噬菌體為病毒，經(jīng)改造后作為載體時，其DNA復(fù)制所需原料來自受體細(xì)胞。2(2018河北省衡水中學(xué)一模)轉(zhuǎn)基因抗病香蕉的培育過程如圖1所示，圖2表示Pst、Sma、EcoR和Apa四種限制酶的識別序列及酶切位點。請據(jù)圖回答下列問題：(1)質(zhì)粒的化學(xué)本質(zhì)是_DNA_。(2)利用基因工程培育轉(zhuǎn)基因抗病香蕉的核心步驟是形成重組質(zhì)粒，即_基因表達載體的構(gòu)建_；將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方式是_農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法_。(3)將抗病基因從含抗病基因的DNA中切割下來，使用的限制酶是_Pst和EcoR_，一個質(zhì)粒被限制酶Pst、Sma、EcoR同時切割后得到的DNA片段和黏性末端分別為_3、3_個。單獨用Apa切割質(zhì)粒后的片段是_和_。(4)轉(zhuǎn)基因抗病香蕉的培育發(fā)生了_基因重組_(變異類型)?？敲顾貢种葡憬队鷤M織細(xì)胞的生長，根據(jù)這一原理可利用含卡那霉素的培養(yǎng)基篩選已導(dǎo)入重組質(zhì)粒的香蕉細(xì)胞。由此推斷，重組質(zhì)粒中應(yīng)含有_卡那霉素抗性_基因作為標(biāo)記基因。解析(1)質(zhì)粒是一種小型的環(huán)狀DNA分子。(2)基因工程的操作分四個步驟，其中構(gòu)建目的基因的表達載體是核心步驟。圖中將B的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。(3)從圖1中的目的基因的三種限制酶的切割位點可以看出，不能使用Sma，否則會破壞目的基因的結(jié)構(gòu)，只有利用另外兩種限制酶才能將目的基因切割下來。用三種限制酶切割環(huán)狀DNA，能得到3個DNA片段和3個黏性末端。根據(jù)圖2中的Apa識別的堿基序列及切割位點可知，該酶切割質(zhì)粒后得到的黏性末端是和。(4)基因工程的原理是基因重組，利用含卡那霉素的培養(yǎng)基能篩選出抗卡那霉素的細(xì)胞，由此可以推斷重組質(zhì)粒中的標(biāo)記基因是卡那霉素抗性基因。易錯警示有關(guān)基因工程概念及其工具的8個錯混點(1)限制酶是一類酶，而不是一種酶。(2)限制酶的成分為蛋白質(zhì)，其作用的發(fā)揮需要適宜的理化條件，高溫、強酸或強堿均易使之變性失活。(3)在切割目的基因和運載體時要求用同一種限制酶，目的是產(chǎn)生相同的黏性末端。(4)將一個基因從DNA分子上切割下來，需要切兩處，同時產(chǎn)生4個黏性末端。(5)不同DNA分子用同一種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端都相同，同一個DNA分子用不同的限制酶切割，產(chǎn)生的黏性末端一般不相同。(6)限制酶切割位點應(yīng)位于標(biāo)記基因之外，不能破壞標(biāo)記基因，以便于進行檢測。(7)基因工程中的運載體與細(xì)胞膜上物質(zhì)運輸?shù)妮d體不同?；蚬こ讨械倪\載體是DNA分子，能將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞內(nèi)；膜載體是蛋白質(zhì)，與細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。(8)基因工程中有3種工具，但工具酶只有2種。題型2基因工程在生產(chǎn)科技中的應(yīng)用3(2018河北衡水中學(xué)一模)科學(xué)家從某細(xì)菌中提取抗鹽基因，轉(zhuǎn)入煙草并培育成轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草。下圖是轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的培育過程，含目的基因的DNA和質(zhì)粒上的箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點。請分析回答下列問題。(1)在該過程中，研究人員首先獲取了抗鹽基因(目的基因)，并采用_PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))_技術(shù)對目的基因進行擴增，該技術(shù)需要的條件是_引物_、酶、原料、模板，該技術(shù)必須用_耐高溫的DNA聚合或熱穩(wěn)定DNA聚合_酶；然后構(gòu)建基因表達載體，基因表達載體中除了具有目的基因、啟動子和終止子之外，還需具有_標(biāo)記基因_。(2)用圖中的質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用Sma酶切割，原因是_Sma會破壞質(zhì)粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因_。圖中過程為防止質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化，應(yīng)選用_BamH和Hind_酶對外源DNA、質(zhì)粒進行切割。(3)為確定轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的_抗鹽基因(或目的基因)_作探針進行分子雜交檢測，又要在個體水平上鑒定，后者具體過程是_將培育的煙草幼苗栽培于含有一定鹽的土壤中，觀察該煙草植株的生長狀態(tài)_。4(2018東北三省三校高考生物一模)馬鈴薯是重要的經(jīng)濟作物，在基因育種方面取得豐碩成果。(1)馬鈴薯是雙子葉植物，常用_農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化_方法將目的基因?qū)腭R鈴薯體細(xì)胞中。構(gòu)建好的基因表達載體基本結(jié)構(gòu)有：目的基因、_啟動子_、_終止子_、_標(biāo)記基因_、復(fù)制原點五部分。(2)馬鈴薯易患多種疾病，導(dǎo)致產(chǎn)量下降?；蚬こ讨谐Ｓ玫目共』驗開病毒外殼蛋白基因、病毒復(fù)制酶基因、抗毒素合成基因、幾丁質(zhì)酶基因_(寫一種即可)。(3)科學(xué)家還培育出抗除草劑的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯，主要從兩個方面進行設(shè)計：修飾除草劑作用的靶蛋白，使其對除草劑_不敏感(抵抗)_，或使靶蛋白過量表達，植物吸收除草劑后仍能正常代謝。引入酶或酶系統(tǒng)，在除草劑發(fā)生作用前_被降解(分解)不敏感(抵抗)_。(4)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，還需對轉(zhuǎn)基因植物進行_檢測和鑒定_。解析(1)馬鈴薯是雙子葉植物，常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)腚p子葉植物體細(xì)胞中。構(gòu)建好的基因表達載體基本結(jié)構(gòu)有目的基因、標(biāo)記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點五部分。(2)基因工程中常用的抗病基因為病毒外殼蛋白基因、病毒復(fù)制酶基因、抗毒素合成基因、幾丁質(zhì)酶基因。(3)除草劑只能作用于雜草，不能作用于馬鈴薯，因此需要修飾除草劑作用的靶蛋白，使其對除草劑不敏感(抵抗)，或使靶蛋白過量表達，植物吸收除草劑后仍能正常代謝。也可以引入酶或酶系統(tǒng)，在除草劑發(fā)生作用前被降解(分解)。(4)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，還需對轉(zhuǎn)基因植物進行檢測和鑒定。易錯警示有關(guān)基因工程操作過程的4個錯混點(1)基因表達需要啟動子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入啟動子與終止子之間的部位。(2)目的基因進入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的實質(zhì)是目的基因整合到受體細(xì)胞染色體基因組中。(3)標(biāo)記基因的作用篩選、檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞，常見的有抗生素抗性基因、發(fā)光基因(表達產(chǎn)物為帶顏色的物質(zhì))等。(4)受體細(xì)胞常用植物受精卵或體細(xì)胞(經(jīng)組織培養(yǎng)培養(yǎng)成新個體)、動物受精卵(一般不用體細(xì)胞)、微生物(大腸桿菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰島素則必須用真核生物酵母菌(需內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的加工、分泌)；一般不用支原體，原因是它營寄生生活；一定不能用哺乳動物成熟的紅細(xì)胞，原因是它無細(xì)胞核，不能合成蛋白質(zhì)。考向二細(xì)胞工程Z1(2018全國卷)2018年細(xì)胞期刊報道，中國科學(xué)家率先成功地應(yīng)用體細(xì)胞對非人靈長類動物進行克隆，獲得兩只克隆猴“中中”和“華華”?；卮鹣铝袉栴}：(1)“中中”和“華華”的獲得涉及核移植過程，核移植是指_將動物的一個細(xì)胞核，移入一個已去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中_。通過核移植方法獲得的克隆猴，與核供體相比，克隆猴體細(xì)胞的染色體數(shù)目_不變_(填“減半”“加倍”或“不變”)。(2)哺乳動物的核移植可以分為胚胎細(xì)胞核移植和體細(xì)胞核移植，胚胎細(xì)胞核移植獲得克隆動物的難度_小于_(填“大于”或“小于”)體細(xì)胞核移植，其原因是_胚胎細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)全能性相對容易_。(3)在哺乳動物核移植的過程中，若分別以雌性個體和雄性個體的體細(xì)胞作為核供體，通常，所得到的兩個克隆動物體細(xì)胞的常染色體數(shù)目_相同_(填“相同”或“不同”)，性染色體組合_不同_(填“相同”或“不同”)。解析(1)核移植是指將動物的一個細(xì)胞核，移入一個已去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中，形成重組細(xì)胞。重組細(xì)胞形成的早期胚胎可移植到受體子宮內(nèi)進一步發(fā)育，最終分娩得到克隆動物。因為染色體在細(xì)胞核中，所以克隆動物體細(xì)胞的染色體數(shù)目與提供細(xì)胞核的個體的體細(xì)胞相同。(2)由于動物的胚胎細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)全能性相對容易，而動物的體細(xì)胞分化程度高，恢復(fù)全能性十分困難，因此，動物體細(xì)胞核移植的難度明顯高于胚胎細(xì)胞核移植。(3)哺乳動物雌雄個體的體細(xì)胞中，細(xì)胞核內(nèi)常染色體的數(shù)目是相同的，性染色體組合是不同的。若分別以雌性個體和雄性個體的體細(xì)胞作為核供體，則得到的克隆動物的體細(xì)胞中常染色體的數(shù)目相同，性染色體組合不同。2(2014全國卷)某研究者用抗原(A)分別免疫3只同種小鼠(X、Y和Z)，每只小鼠免疫5次，每次免疫一周后測定各小鼠血清抗體的效價(能檢測出抗原抗體反應(yīng)的血清最大稀釋倍數(shù))，結(jié)果如下圖所示。若要制備雜交瘤細(xì)胞，需取免疫后小鼠的B淋巴細(xì)胞(染色體數(shù)目40條)，并將該細(xì)胞與體外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞(染色體數(shù)目60條)按一定比例加入試管中，再加入聚乙二醇誘導(dǎo)細(xì)胞融合，經(jīng)篩選培養(yǎng)及抗體檢測，得到不斷分泌抗A抗體的雜交瘤細(xì)胞?；卮鹣铝袉栴}：(1)制備融合所需的B淋巴細(xì)胞時，所用免疫小鼠的血清抗體效價需達到16000以上，則小鼠最少需要經(jīng)過_4_次免疫后才能有符合要求的。達到要求后的X、Y、Z這3只免疫小鼠中，最適合用于制備B淋巴細(xì)胞的是_Y_小鼠，理由是_Y小鼠的血清抗體效價最高_。(2)細(xì)胞融合實驗完成后，融合體系中除含有未融合的細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞外，可能還有_B淋巴細(xì)胞相互融合形成的細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞相互融合形成的細(xì)胞_，體系中出現(xiàn)多種類型細(xì)胞的原因是_細(xì)胞融合是隨機的，且融合率達不到100%_。(3)雜交瘤細(xì)胞中有_1_個細(xì)胞核，染色體數(shù)目最多是_100_條。(4)未融合的B淋巴細(xì)胞經(jīng)多次傳代培養(yǎng)后都不能存活，原因是_不能無限增殖_。解析本題考查雜交瘤細(xì)胞的制備過程和特性。(1)據(jù)圖分析，第四次注射后X、Y、Z小鼠的血清抗體效價均達到16000以上，小鼠Y的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體效價最高，最適用于制備單克隆抗體。(2)融合體系中除了未融合的細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞之外，還有骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的自身融合產(chǎn)物；由于細(xì)胞融合具有隨機性，故體系中會出現(xiàn)多種類型的細(xì)胞。(3)雜交瘤細(xì)胞形成后，由于核膜具有流動性，小鼠的免疫B淋巴細(xì)胞核與其骨髓瘤細(xì)胞核會融合形成一個雜交的細(xì)胞核，正常情況下融合后的細(xì)胞核中的染色體數(shù)目為100條。(4)未融合的B淋巴細(xì)胞在不發(fā)生突變的情況下經(jīng)過多次分裂后會衰老死亡，不能無限增殖。H1理清3種細(xì)胞的區(qū)別(1)雜種細(xì)胞：植物體細(xì)胞雜交過程中，兩種細(xì)胞去掉細(xì)胞壁之后形成的_原生質(zhì)體_融合，融合的原生質(zhì)體出現(xiàn)細(xì)胞壁之后形成的細(xì)胞叫雜種細(xì)胞。(2)重組細(xì)胞：_體_細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去核卵母細(xì)胞之后形成的細(xì)胞叫重組細(xì)胞。(3)雜交細(xì)胞：動物細(xì)胞融合形成的細(xì)胞常稱為雜交細(xì)胞。2關(guān)注植物體細(xì)胞雜交與動物細(xì)胞融合的4個易錯點(1)植物體細(xì)胞雜交與動物細(xì)胞融合中酶的作用對象不同，_纖維素酶_和果膠酶作用于細(xì)胞壁，而_胰蛋白酶_等作用于細(xì)胞間的蛋白質(zhì)。(2)滅活的病毒保持了其抗原性，但毒性消失。(3)植物雜交細(xì)胞在激素誘導(dǎo)下能表達出全能性，但動物雜交細(xì)胞的全能性不能表達。(4)克隆動物的起點是經(jīng)過核_移植_后形成的_重組_細(xì)胞，其遺傳物質(zhì)主要來自供體，因此形成的個體性狀主要同供體，但也有部分性狀同受體。3規(guī)避克隆動物與試管動物的3個誤區(qū)(1)誤區(qū)一：試管動物與克隆動物的產(chǎn)生都是無性生殖。糾正：試管動物的產(chǎn)生是_有性_生殖，克隆動物的產(chǎn)生是_無性_生殖。(2)誤區(qū)二：試管動物(哺乳類)的產(chǎn)生是在_體外_進行的，克隆動物(哺乳類)的產(chǎn)生是在_體內(nèi)_進行的。糾正：試管動物(哺乳類)和克隆動物(哺乳類)早期胚胎之前都是在體外進行的，早期胚胎經(jīng)過_胚胎移植_之后是在體內(nèi)進行的。(3)誤區(qū)三：胚胎移植的優(yōu)勢是充分發(fā)揮雌性優(yōu)良個體的繁殖潛力，因此胚胎移植的胚胎只能來自體內(nèi)受精的胚胎。糾正：胚胎移植的胚胎有三個來源：體內(nèi)正常_受精_產(chǎn)生的胚胎、核移植產(chǎn)生的重組細(xì)胞培養(yǎng)而來的胚胎、體外受精產(chǎn)生的早期胚胎。4易錯警示(1)制備人工種子需要植物組織培養(yǎng)到叢芽或胚狀體階段。(2)正確認(rèn)識3類細(xì)胞的來源：雜種細(xì)胞：植物體細(xì)胞雜交。重組細(xì)胞：核移植。雜交細(xì)胞：動物細(xì)胞融合。(3)原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)的區(qū)別：是否進行了分瓶培養(yǎng)。(4)核移植技術(shù)獲得的動物與供核動物的性狀并不完全相同。(5)動植物的體細(xì)胞進行離體培養(yǎng)都需要在無菌條件下進行。(6)植物組織培養(yǎng)中添加蔗糖的目的是提供營養(yǎng)和調(diào)節(jié)滲透壓。T題型1植物細(xì)胞工程1(2018陜西省西安市高考生物一模)白菜、甘藍均為二倍體，體細(xì)胞染色體數(shù)目分別為20、18。“白菜甘藍”是用細(xì)胞工程的方法培育出來的蔬菜新品種，它具有生長期短、耐熱性強和易于儲藏等優(yōu)點。如圖是“白菜甘藍”的雜交過程示意圖，回答以下問題：(1)為了得到原生質(zhì)體需先用_纖維素酶_和_果膠酶_來處理白菜細(xì)胞和甘藍細(xì)胞。(2)誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法有多種，常用的物理方法是_離心、振動、電激_，融合完成的標(biāo)志是_再生出新的細(xì)胞壁_。由雜種細(xì)胞得到白菜甘藍還需要經(jīng)過組織培養(yǎng)技術(shù)，其中需要避光培養(yǎng)的步驟是_脫分化_。(3)如圖通過植物體細(xì)胞雜交技術(shù)獲得的“白菜甘藍”體細(xì)胞染色體數(shù)為_38_；通常情況下，白菜和甘藍有性雜交是不能成功的，原因是_存在生殖隔離_，若對白菜和甘藍采用雜交育種方法能成功的話，得到的后代應(yīng)含_19_條染色體。(4)植物體細(xì)胞雜交技術(shù)和傳統(tǒng)雜交技術(shù)相比的優(yōu)點是_克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，培育作物新品種_。解析(1)植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素和果膠，根據(jù)酶的專一性原理，可采用纖維素酶和果膠酶去除細(xì)胞壁。(2)誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法包括：物理方法(離心、振動、電激)和化學(xué)方法(聚乙二醇)；融合完成的標(biāo)志是再生出新的細(xì)胞壁；將雜種細(xì)胞培育成雜種植株還需要采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，包括脫分化和再分化兩個階段，其中脫分化過程要避光，再分化過程需光。(3)如圖通過植物體細(xì)胞雜交技術(shù)獲得的“白菜一甘藍”體細(xì)胞染色體數(shù)為201838；通常情況下，由于白菜和甘藍之間存在生殖隔離，因此白菜和甘藍有性雜交是不能成功的；若對白菜和甘藍采用雜交育種方法能成功的話，得到的后代應(yīng)含19條染色體。(4)植物體細(xì)胞雜交技術(shù)和傳統(tǒng)雜交技術(shù)相比的優(yōu)點是克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，培育作物新品種。2(2018河北邯鄲一中二模)我國菊花主要有杭菊、亳菊、懷菊、貢菊等8種，是藥食兼優(yōu)的代表性植物。研究發(fā)現(xiàn)杭菊具有明顯的抗炎作用，懷菊具有良好的抗病毒作用(但是抗炎作用很弱)。結(jié)合所學(xué)知識回答下列問題：(1)欲培育兼有明顯抗炎、抗病毒療效的菊花新品種，用杭菊和懷菊雜交的方法是做不到的，原因是_二者存在生殖隔離_。(2)基因工程方法為培育上述新品種提供了可能性，在實施基因工程過程中，最關(guān)鍵的步驟是_基因表達載體的構(gòu)建_。受體細(xì)胞的選擇直接關(guān)系到實驗的成功與否以及新生植株的品質(zhì)，我們一般選取未開花的幼枝的芽尖，理由有_不帶病毒或帶病毒極少_、_分化程度低或易誘導(dǎo)脫分化和再分化(答案必須是兩個方面)_(寫出兩個)。若想確定杭菊的受體細(xì)胞中是否導(dǎo)入了懷菊的抗病毒基因，常用的檢測方法是_DNA分子雜交技術(shù)_。(3)如果利用植物體細(xì)胞雜交的方法培育“杭菊懷菊”雜種植株，首先要獲得這兩種植物細(xì)胞的_原生質(zhì)體_，用聚乙二醇誘導(dǎo)處理后，誘導(dǎo)實驗材料再生出_細(xì)胞壁_，再利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)培育出雜種植株。(4)理論上利用植物體細(xì)胞雜交和基因工程的方法均可以培育出抗炎、抗病毒的優(yōu)良菊花，這兩項技術(shù)的共同特點有_定向改造生物(或克服了遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙)_。解析(1)杭菊和懷菊屬于兩個不同的物種，二者之間存在生殖隔離，所以二者之間不能進行有性雜交。(2)基因工程的關(guān)鍵步驟是基因表達載體的構(gòu)建；由于幼枝的芽尖具有不帶病毒或帶病毒極少、分化程度低或易誘導(dǎo)脫分化和再分化的特點，所以通常選取未開花的幼枝的芽尖做受體細(xì)胞；可用DNA分子雜交技術(shù)檢測懷菊的抗病毒基因(目的基因)是否導(dǎo)入了杭菊受體細(xì)胞。(3)植物體細(xì)胞雜交技術(shù)首先要獲得這兩種植物細(xì)胞的原生質(zhì)體，用聚乙二醇誘導(dǎo)處理后，誘導(dǎo)實驗材料再生出細(xì)胞壁，再利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)培育出雜種植株。(4)植物體細(xì)胞雜交技術(shù)和基因工程的共同特點是定向改造生物(或克服了遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙)。易錯警示辨析有關(guān)植物細(xì)胞工程的3個錯混點(1)植物體細(xì)胞雜交即兩個細(xì)胞融合成一個細(xì)胞，不管是染色體數(shù)、基因型還是染色體組都采用直接相加的方法。(2)利用植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)細(xì)胞產(chǎn)物時，有時只需將外植體培養(yǎng)到愈傷組織，從愈傷組織中獲取產(chǎn)物。(3)人工種子發(fā)育初期需要的營養(yǎng)物質(zhì)由人工胚乳提供。題型2動物細(xì)胞工程3(2018遼寧大連二模)白細(xì)胞介素4(IL4)是具有多種免疫學(xué)調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，臨床及研究中需要大量高純度的IL4，以及其高效檢測試劑。下圖是利用單克隆抗體技術(shù)制備抗IL4特異性抗體的過程?；卮鹣嚓P(guān)問題。(1)在免疫系統(tǒng)組成中，IL4屬于_免疫活性_物質(zhì)。研究人員從外周血中提取到IL4蛋白分子的mRNA。將其反轉(zhuǎn)錄成_cDNA_，構(gòu)建特定表達載體，利用工程菌獲得用于臨床及研究需要的高純度的IL4蛋白。(2)圖中所示的a培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的是_骨髓瘤_細(xì)胞，其與M細(xì)胞融合產(chǎn)生雙核或多核細(xì)胞。再經(jīng)_有絲分裂_，進一步形成兩個新的單核雜交細(xì)胞。(3)b培養(yǎng)瓶所示過程中，要用特定的選擇性培養(yǎng)基進行細(xì)胞篩選，得到的_融合的雜種(雜交瘤)_細(xì)胞能在體外培養(yǎng)增殖生長。經(jīng)b獲得的細(xì)胞，還需要進行_克隆化培養(yǎng)和抗體檢測(或答“克隆化培養(yǎng)和專一抗體陽性檢測”)_。(4)c培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的細(xì)胞是_分泌抗IL4抗體(答出此意即可)_的雜交瘤細(xì)胞。制備IL4單克隆抗體的過程中，細(xì)胞培養(yǎng)瓶通常置于特定培養(yǎng)箱中進行細(xì)胞培養(yǎng)，要求培養(yǎng)瓶松蓋，主要目的是_讓O2進入培養(yǎng)瓶以供細(xì)胞代謝、使CO2進入培養(yǎng)瓶維持培養(yǎng)液的pH_。4回答下列與動物細(xì)胞工程有關(guān)的問題：(1)動物細(xì)胞培養(yǎng)中，在細(xì)胞發(fā)生貼壁生長過程中會出現(xiàn)_接觸_抑制。貼滿瓶壁的細(xì)胞一般用_胰蛋白酶或膠原蛋白_酶處理后分瓶繼續(xù)培養(yǎng)，這種培養(yǎng)過程稱為_傳代_培養(yǎng)。(2)在細(xì)胞核移植過程中常用到卵母細(xì)胞，通常情況下，采集到的卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)到_減數(shù)第二次分裂中_期。在核移植之前，應(yīng)去除卵母細(xì)胞的_細(xì)胞核_，原因是_若不去掉卵母細(xì)胞的細(xì)胞核，就會造成核移植后的卵母細(xì)胞中有兩個細(xì)胞核，使得遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定_。(3)如圖表示制備單克隆抗體的過程。在獲得B淋巴細(xì)胞之前，小鼠已被多次注射_相同_(填“相同”或“不同”)抗原，注射后小鼠體內(nèi)發(fā)生_體液_(填“細(xì)胞”或“體液”)免疫反應(yīng)，生成能產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞(漿細(xì)胞)。過程中，如果細(xì)胞發(fā)生兩兩融合，融合后出現(xiàn)_三_種不同的融合細(xì)胞。過程需在特定的_選擇_培養(yǎng)基上進行篩選，從而得到_雜交瘤_細(xì)胞。過程培養(yǎng)細(xì)胞需要的氣體環(huán)境為_95%的空氣5%的CO2_。解析(1)動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中會發(fā)生接觸抑制現(xiàn)象，貼滿瓶壁的細(xì)胞一般用胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理后繼續(xù)培養(yǎng)，分瓶后的培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)。(2)體細(xì)胞核移植過程中，卵母細(xì)胞一般培養(yǎng)到減數(shù)第二次分裂中期，并去除卵母細(xì)胞的細(xì)胞核，否則核移植后有兩個細(xì)胞核，遺傳物質(zhì)表達發(fā)生混亂。(3)制備單克隆抗體前，對小鼠先要多次用同種抗原刺激，從而能產(chǎn)生足夠的相應(yīng)的漿細(xì)胞。B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合是隨機的，可能是兩個淋巴細(xì)胞之間融合或兩個骨髓瘤細(xì)胞之間融合，也可能是B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，因此有三種融合結(jié)果。為了得到雜交瘤細(xì)胞，需在特定的選擇培養(yǎng)基上進行篩選。動物細(xì)胞培養(yǎng)的氣體環(huán)境是95%的空氣5%的CO2混合氣體。易錯警示辨析有關(guān)動物細(xì)胞融合與單克隆抗體的3個錯混點(1)滅活是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染能力，但是并不破壞這些病原體的抗原結(jié)構(gòu)。(2)除了受到注射的抗原的刺激，小鼠在生活過程中還可能受到其他抗原的刺激，因此從小鼠體內(nèi)取出的多個B淋巴細(xì)胞可能產(chǎn)生多種不同抗體，所以進行第二次篩選是非常必要的。(3)單克隆抗體制備過程中，進行了多次動物細(xì)胞培養(yǎng)的操作，說明動物細(xì)胞培養(yǎng)是動物細(xì)胞工程的基礎(chǔ)。1(2018深圳調(diào)研)葉綠體轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源基因整合到葉綠體基因組中，該技術(shù)能有效改良植物的品質(zhì)。請回答：(1)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的核心步驟是_基因表達載體的構(gòu)建_，完成該步驟所需要的酶有_限制酶和DNA連接酶_。(2)將植物體細(xì)胞處理得到原生質(zhì)體，再通過_農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法_或_基因槍_法，將目的基因?qū)朐|(zhì)體，使原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁之后，通過_植物組織培養(yǎng)_技術(shù)培養(yǎng)可得到相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因幼苗。(3)來自原核生物中有重要價值的外源基因，無需改造和修飾就可在葉綠體中高效表達，就此分析，原因是_葉綠體DNA與原核生物DNA結(jié)構(gòu)類似(由于葉綠體大多數(shù)基因的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄與翻譯系統(tǒng)均與原核生物類似)_。(4)對大多數(shù)高等植物而言，與傳統(tǒng)的細(xì)胞核轉(zhuǎn)基因相比，葉綠體轉(zhuǎn)基因更穩(wěn)定，其遺傳方式_不遵循_(答“遵循”或“不遵循”)分離定律，不會隨_花粉_(“花粉”或“卵細(xì)胞”)傳給后代，從而保持了_母本_(“父本”或“母本”)的遺傳特性。解析(1)基因工程的核心步驟是基因表達載體的構(gòu)建，所需要的酶有限制酶和DNA連接酶；(2)植物細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法。原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁之后，通過植物組織培養(yǎng)獲取幼苗；(3)葉綠體DNA與原核生物DNA結(jié)構(gòu)類似。(4)分離定律適用于有性生殖過程中細(xì)胞核遺傳，故葉綠體轉(zhuǎn)基因不遵循分離定律，為母系遺傳。2(2018天津市和平區(qū)生物一模)已知某傳染性疾病的病原體為RNA病毒，該病毒表面的A蛋白為主要抗原。疫苗的生產(chǎn)和抗體的制備流程如圖1所示。請回答下列問題：(1)過程代表的是_逆轉(zhuǎn)錄_，過程構(gòu)建A基因重組載體時，啟動子和終止子是重新構(gòu)建的，它們應(yīng)該能被受體細(xì)胞的_RNA聚合酶_所識別，以便于其催化轉(zhuǎn)錄過程。(2)如圖2為A基因的結(jié)構(gòu)示意圖，已知區(qū)的堿基數(shù)是2000個，其中陰影區(qū)域堿基數(shù)是800個，空白區(qū)域中G和C的總數(shù)共有400個，則由該區(qū)域能指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的片段轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA中A和U總數(shù)是_400_個。(3)在給小鼠皮下注射A蛋白時，要重復(fù)注射幾次的目的是通過二次免疫，增加小鼠體內(nèi)的_漿細(xì)胞_數(shù)目。(4)在將X進行擴大培養(yǎng)前，至少需要經(jīng)過2次篩選，第一次是將_雜交瘤細(xì)胞_篩選出來，第二次是將_能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞_篩選出來。(5)對健康人進行該傳染病免疫預(yù)防時，可選用圖中基因工程生產(chǎn)的_A蛋白_來制備疫苗。對該傳染病疑似患者確診時，可以從疑似患者體內(nèi)分離出病毒與已知病毒進行核酸序列比較，或用圖中的_抗A蛋白的單克隆抗體_與分離出的病毒進行特異性檢測。解析(1)由以上分析可知是逆轉(zhuǎn)錄。啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點，能啟動轉(zhuǎn)錄過程。(2)已知圖中區(qū)的堿基數(shù)是2000個，其中陰影區(qū)域堿基數(shù)是800個，則空白區(qū)域中堿基總數(shù)為1200個，又已知空白區(qū)域中G和C的總數(shù)為400個，則AT總數(shù)為800個，每條鏈中AT總數(shù)為400個，根據(jù)堿基互補配對原則，由該區(qū)轉(zhuǎn)錄形成的成熟mRNA中A和U總數(shù)也是400個。(3)在給小鼠皮下注射A蛋白時，要重復(fù)注射幾次的目的是通過二次免疫，增加小鼠體內(nèi)的漿細(xì)胞數(shù)目。(4)在將X進行擴大培養(yǎng)前，至少需要經(jīng)過2次篩選，第一次是用選擇培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞，第二次是采用抗體陽性檢測法篩選出能夠產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。(5)對健康人進行該傳染病免疫預(yù)防時，可選用圖中基因工程生產(chǎn)的A蛋白所制備的疫苗。對該傳染病疑似患者確診時，可以從疑似患者體內(nèi)分離出病毒，與已知病毒進行核酸序列比較；或采用抗原抗體雜交法，即用圖中的抗A蛋白的單克隆抗體進行特異性結(jié)合檢測。3如圖為三種質(zhì)粒和一個含目的基因的DNA片段，其中ApR為氨芐青霉素抗性基因，TcR為四環(huán)素抗性基因，lacZ為藍色顯色基因，EcoR(0.7kb)、Pvu(0.8kb)等為限制酶和其切割位點及其與復(fù)制原點之間的距離。已知1kb1000個堿基對，請回答下列問題：(1)片段D為目的基因中的某一片段，則DNA聚合酶和DNA連接酶的作用形成的鍵依次是_(填圖中數(shù)字)。(2)圖中作為目的基因運載體最理想的質(zhì)粒是_B_(填“A”“B”或“C”)，請據(jù)圖分析，其他兩種質(zhì)粒一般不能作為運載體的理由分別是_質(zhì)粒A不含有標(biāo)記基因；質(zhì)粒C在用和目的基因相同的限制酶切割時，復(fù)制原點會被破壞，使該質(zhì)粒無法進行復(fù)制_。(3)用EcoR全酶切目的基因和質(zhì)粒B形成的重組質(zhì)粒，并進行電泳觀察，可出現(xiàn)長度分別為11kb和_5.6_kb的兩個片段，或者長度分別為_3.6_kb和3.1_kb_的兩個片段(重組質(zhì)粒上目的基因的插入位點與EcoR的識別位點之間的堿基對忽略不計)。(4)將分別用限制酶Pvu切開的質(zhì)粒B溶液與目的基因溶液混合，加入DNA連接酶后，進行大腸桿菌受體細(xì)胞導(dǎo)入操作，則受體細(xì)胞的類型包含_ABD_(多選)。AApR藍色BApR白色CApS、藍色DApS白色(5)動物基因工程通常以受精卵作為受體細(xì)胞的根本原因是_B_。A受精卵能使目的基因高效表達B受精卵可發(fā)育成動物個體C受精卵更易接受DNA的插入D受精卵體積較大，便于DNA導(dǎo)入操作解析(1)DNA聚合酶和DNA連接酶的作用形成的鍵均為磷酸二酯鍵，因此都應(yīng)為。(2)由題圖可知，切割目的基因應(yīng)用Pvu，但該限制酶會將c質(zhì)粒的復(fù)制原點破壞，使該質(zhì)粒無法進行復(fù)制，而質(zhì)粒A不含有標(biāo)記基因，因此兩者都不能作為運載體。(3)根據(jù)題意，質(zhì)粒B長度為2.7kb，目的基因長度為4.0kb，所以重組質(zhì)粒長度為6.7kb，如果出現(xiàn)長度為11kb的一個片段，則另外一個片段的長度為5.6kb。若目的基因與運載體反向連接，可形成長度分別為3.1kb和3.6kb的兩個片段。(4)將分別用限制酶Pvu切開的質(zhì)粒B溶液與目的基因溶液混合，加入DNA連接酶后，可得到質(zhì)粒自身環(huán)化形成的普通質(zhì)粒、重組質(zhì)粒和目的基因自身連接的DNA環(huán)三種類型。如果導(dǎo)入的是普通質(zhì)粒，受體細(xì)胞的類型為A(ApR、藍色)，如果導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒，受體細(xì)胞的類型為B(ApR、白色)，如果導(dǎo)入的是DNA環(huán)，受體細(xì)胞的類型為D(ApS、白色)。(5)動物基因工程通常選用受精卵作為受體細(xì)胞的根本原因是受精卵可發(fā)育成動物個體。4人乳頭狀瘤病毒(HPV)與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，抗HPV的單克隆抗體可以準(zhǔn)確檢測出HPV，從而及時監(jiān)控宮頸癌的發(fā)生，以下是以HPV衣殼蛋白為抗原制備出單克隆抗體的過程，請據(jù)圖回答下列問題：(1)單克隆抗體制備過程中涉及的細(xì)胞工程技術(shù)有_動物細(xì)胞培養(yǎng)、動物細(xì)胞融合_。(2)若要分析雜交瘤細(xì)胞中染色體，可通過_解離、漂洗、染色和制片_等過程制成裝片，然后在顯微鏡下觀察。雜交瘤細(xì)胞中染色體數(shù)目與普通淋巴細(xì)胞相比具有的特點是_染色體數(shù)目加倍_，在HAT培養(yǎng)基上存活的細(xì)胞可能包括_(填下列序號)。無抗體分泌的細(xì)胞抗HPV抗體的分泌細(xì)胞其他無關(guān)抗體的分泌細(xì)胞(3)對于抗體檢測呈_陽_性的雜交瘤細(xì)胞應(yīng)盡早進行克隆化，克隆化的方法最常用的是有限稀釋法，即稀釋細(xì)胞到310個/mL，每孔加入細(xì)胞稀釋液_0.1_mL，使每個孔內(nèi)不多于一個細(xì)胞，達到單克隆培養(yǎng)的目的。(4)由上述過程生產(chǎn)出的單克隆抗體不能直接用于人體，理由是_小鼠形成的抗體對人體來說是抗原，存在著排異反應(yīng)_。(5)科學(xué)家從某些無限增殖細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中分離出了無限增殖調(diào)控基因(prG)，該基因能激發(fā)動物細(xì)胞分裂，這為單克隆抗體的制備提供了更多的思路。除本題描述的制備單克隆抗體技術(shù)外，請再簡要寫出一種制備單克隆抗體的思路。_通過基因工程向漿細(xì)胞中導(dǎo)入prG；利用核移植技術(shù)將漿細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去核的無限增殖細(xì)胞中(答對其一即可)_。解析(2)利用顯微鏡觀察有絲分裂過程中的染色體，需先制作臨時裝片；雜交瘤細(xì)胞中含有漿細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的染色體，所以比普通淋巴細(xì)胞的染色體數(shù)目多一倍；在HAT培養(yǎng)基上生存的細(xì)胞均為雜交細(xì)胞，這些雜交細(xì)胞中有分泌HPV抗體的細(xì)胞，有分泌其他抗體的細(xì)胞，也有不能分泌抗體的細(xì)胞。(3)抗體檢驗呈陽性，說明該雜交瘤細(xì)胞可產(chǎn)生所需抗體；為保證每個小孔不多于一個細(xì)胞，根據(jù)濃度可推斷加入細(xì)胞稀釋液的量：設(shè)加入細(xì)胞稀釋液的最大量是X，則10個/mLX1個，X0.1mL。(4)小鼠形成的抗體與人體抗體不同，故在人體內(nèi)可引起免疫反應(yīng)，所以上述過程生產(chǎn)出的單克隆抗體不能直接用于人體。(5)根據(jù)所給信息可知，還可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)或核移植技術(shù)獲得既能大量增殖，又能產(chǎn)生特定抗體的雜交細(xì)胞。5(2017陜西西安長安一中第一次檢測)下圖是植物體細(xì)胞雜交過程示意圖，請據(jù)圖回答：(1)植物體細(xì)胞雜交的第步是去掉細(xì)胞壁，分離出有活力的原生質(zhì)體。目前此步驟最常用的方法是酶解法，也就是在溫和的條件下用_纖維素酶、果膠酶_等分解植物的細(xì)胞壁。(2)過程的發(fā)生，必須進行人工誘導(dǎo)。人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合常用的化學(xué)方法是用_聚乙二醇_試劑作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)融合。動物細(xì)胞融合還常用到_滅活的病毒_作為誘導(dǎo)劑。(3)與過程密切相關(guān)的具有單層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器為_高爾基體_。(4)過程稱為_脫分化_，過程稱為_再分化_。若利用此技術(shù)生產(chǎn)治療癌癥的藥物紫杉醇，培養(yǎng)將進行到_e_(填字母編號)即可。(5)植物體細(xì)胞雜交在育種工作中具有廣泛的應(yīng)用價值，其突出的優(yōu)點是可以_克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙_。解析(1)植物體細(xì)胞雜交的第步是用纖維素酶和果膠酶去掉細(xì)胞壁，分離出有活力的原生質(zhì)體。(2)人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合常用的化學(xué)方法是用聚乙二醇試劑作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)融合。動物細(xì)胞融合還常用到滅活的病毒作為誘導(dǎo)劑。(3)過程是雜種細(xì)胞生出細(xì)胞壁，高爾基體與植物細(xì)胞壁形成有關(guān)。(4)過程分別為脫分化和再分化，治療癌癥的藥物紫杉醇是從紫杉細(xì)胞中提取的，只需將植物組織培養(yǎng)進行到愈傷組織階段即可。(5)植物體細(xì)胞雜交在育種工作中具有廣泛的應(yīng)用價值，其突出的優(yōu)點是可以克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙，大大擴展可用于雜交的親本組合范圍。6(2018全國卷)某種熒光蛋白(GFP)在紫外光或藍光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光，這一特性可用于檢測細(xì)胞中目的基因的表達。某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5末端，獲得了L1GFP融合基因(簡稱為甲)，并將其插入質(zhì)粒P0，構(gòu)建了真核表達載體P1，其部分結(jié)構(gòu)和酶切位點的示意圖如下，圖中E1E4四種限制酶產(chǎn)生的黏性末端各不相同?；卮鹣铝袉栴}：(1)據(jù)圖推斷，該團隊在將甲插入質(zhì)粒P0時，使用了兩種限制酶，這兩種酶是_E1和E4_。使用這兩種酶進行酶切是為了保證_甲的完整_，也是為了保證_甲與載體正確連接_。(2)將P1轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的牛皮膚細(xì)胞后，若在該細(xì)胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細(xì)胞中完成了_轉(zhuǎn)錄_和_翻譯_過程。(3)為了獲得含有甲的牛，該團隊需要做的工作包括：將能夠產(chǎn)生綠色熒光細(xì)胞的_細(xì)胞核_移入牛的_去核卵母細(xì)胞_中、體外培養(yǎng)、胚胎移植等。(4)為了檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細(xì)胞中，某同學(xué)用PCR方法進行鑒定，在鑒定時應(yīng)分別以該牛不同組織細(xì)胞中的_核DNA_(填“mRNA”“總RNA”或“核DNA”)作為PCR模板。解析(1)由題意可知，L1基因和GFP基因合成了L1GFP融合基因(簡稱為甲)，題圖中顯示了四個酶切位點，當(dāng)將L1GFP融合基因插入質(zhì)粒P0時，可用E1和E4限制酶進行酶切，用這兩種酶進行酶切不會破壞甲的完整性，同時能保證甲按照正確的方向與載體連接。(2)若在牛皮膚細(xì)胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1GFP融合基因得到表達，即目的基因在受體細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)錄和翻譯合成了熒光蛋白。(3)為了獲得含有甲的牛，可將含有目的基因的細(xì)胞的細(xì)胞核移入牛的去核卵母細(xì)胞中，然后進行體外培養(yǎng)、胚胎移植等。(4)利用PCR技術(shù)擴增目的基因，可以檢測目的基因是否存在。PCR擴增的模板是DNA。7(2018天津卷)甲型流感病毒為RNA病毒，易引起流感大規(guī)模流行。我國科學(xué)家在2017年發(fā)明了一種制備該病毒活疫苗的新方法，主要環(huán)節(jié)如下。(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖能力。以病毒RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成對應(yīng)DNA后，利用_PCR_技術(shù)擴增，并將其中某些基因(不包括表面抗原基因)內(nèi)個別編碼氨基酸的序列替換成編碼終止密碼子的序列。與改造前的基因相比，改造后的基因表達時不