《臨床基因組學(xué)：第四章 熒光原位雜交技術(shù)》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《臨床基因組學(xué)：第四章 熒光原位雜交技術(shù)（43頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、第第4章章熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交技術(shù)原位原位PCRC CONTENTSONTENTS目錄目錄FISH檢測(cè)的基本原理檢測(cè)的基本原理FISH檢測(cè)的流程FISH檢測(cè)的臨床應(yīng)用概念概念 原位雜交原位雜交( in situ hybridization, ISH )是應(yīng)用生物化學(xué)中核酸分子雜交的原理,在組織切片、細(xì)胞涂片或印片上原位檢測(cè)某種DNA或RNA序列的一項(xiàng)技術(shù)。1969年美國(guó)耶魯大學(xué)Gall等首先通過(guò)基因探針將核糖體基因在爪蟾卵母細(xì)胞上進(jìn)行定位。概念概念 原位雜交原位雜交( in situ hybridization, ISH )是應(yīng)用生物化學(xué)中核酸分子雜交的原理,在組織切片、細(xì)胞涂片或印片

2、上原位檢測(cè)某種DNA或RNA序列的一項(xiàng)技術(shù)。1969年美國(guó)耶魯大學(xué)Gall等首先通過(guò)基因探針將核糖體基因在爪蟾卵母細(xì)胞上進(jìn)行定位。1.已知的單鏈核酸作為已知的單鏈核酸作為探針探針（直接法直接標(biāo)記探針）；（直接法直接標(biāo)記探針）；2.按照按照堿基互補(bǔ)的原則堿基互補(bǔ)的原則，探針與待檢材料中未知的單鏈核酸結(jié)合；，探針與待檢材料中未知的單鏈核酸結(jié)合；3.特異親和素進(jìn)行特異親和素進(jìn)行熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記；3.使使探針探針再用含再用含熒光素標(biāo)記的特異親和素?zé)晒馑貥?biāo)記的特異親和素進(jìn)行免疫化學(xué)反應(yīng)；進(jìn)行免疫化學(xué)反應(yīng)；4.熒光顯微鏡觀察熒光信號(hào)。熒光顯微鏡觀察熒光信號(hào)。相當(dāng)于免疫學(xué)中相當(dāng)于免疫學(xué)中抗原抗體的反應(yīng)抗原抗

3、體的反應(yīng) FISH是一種“釣魚(yú)”技術(shù)； 通過(guò)熒光標(biāo)記熒光標(biāo)記的探針探針與細(xì)胞核內(nèi)的靶序列雜交靶序列雜交 獲得細(xì)胞內(nèi)多條染色體或多種基因狀態(tài)的信息 始于20世紀(jì)80年代按雜交對(duì)象：按雜交對(duì)象： 組織組織 細(xì)胞細(xì)胞 染色體染色體按探針標(biāo)記物按探針標(biāo)記物 同位素（同位素（放射性）標(biāo)記探針標(biāo)記探針 非同位素標(biāo)記探針?lè)峭凰貥?biāo)記探針熒光標(biāo)記：最常用的為生物素、地高辛(Digxigenin , DIG)、羅丹明（Rhodamine）、熒光素（Fluorescence）、PI 、DAPI酶標(biāo)：如辣根過(guò)氧化酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)等。按細(xì)胞周期來(lái)分按細(xì)胞周期來(lái)分 間期FISH 中期FISH是含有互補(bǔ)

4、順序的外源性被標(biāo)記的是含有互補(bǔ)順序的外源性被標(biāo)記的DNA或或RNA片片段，是在原位雜交中用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)特定段，是在原位雜交中用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)特定DNA或或RNA順序定位的特殊試劑順序定位的特殊試劑探針的堿基序列是已知的，只能與特定的核酸分探針的堿基序列是已知的，只能與特定的核酸分子結(jié)合上。子結(jié)合上。用于原位雜交的探針有不同種類，可用于不同靶用于原位雜交的探針有不同種類，可用于不同靶核酸的探測(cè)。核酸的探測(cè)。FISH探針定義 1）同位素原位雜交）同位素原位雜交(Isotopic in situ hybridization) 70年代年代 2）非同位素原位雜交）非同位素原位雜交(Non-isotopi

5、c in situ hybridization) 80年代中后期年代中后期 1）免疫酶聯(lián)）免疫酶聯(lián) 2）熒光原位雜交（）熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization, FISH)*同位素原位雜交的不足之處：同位素原位雜交的不足之處：1）不穩(wěn)定；）不穩(wěn)定；2）高背景；）高背景；3）曝光時(shí)間長(zhǎng)；）曝光時(shí)間長(zhǎng)；4）結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)處理繁瑣。）結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)處理繁瑣。5）同位素的使用和處理）同位素的使用和處理熒光原位雜交（熒光原位雜交（FISH）的原理）的原理以BCR/ABL為例正常信號(hào)模式為：2G2R（如左圖）典型陽(yáng)性信號(hào)模式為：1G1R2F （如右圖）標(biāo)記位點(diǎn)：紅:AB

6、L(9q34) 綠:BCR(22q11)G代表綠色信號(hào)，R代表紅色信號(hào)，F(xiàn)代表融合信號(hào)。基因片段擴(kuò)增基因片段擴(kuò)增1基因片段缺失基因片段缺失2基因片段倒位、易位等基因片段倒位、易位等3 1、安全、可靠；、安全、可靠； 2、探針?lè)€(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用；、探針?lè)€(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用； 3、實(shí)驗(yàn)周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確；、實(shí)驗(yàn)周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確； 4、FISH可定位長(zhǎng)度在可定位長(zhǎng)度在1kb的的DNA序列，其靈敏度接近放射性探針；序列，其靈敏度接近放射性探針； 5、多色、多色FISH通過(guò)在同一個(gè)核中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測(cè)多種序列；通過(guò)在同一個(gè)核

7、中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測(cè)多種序列； 6、既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液、既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。的結(jié)構(gòu)。 優(yōu)點(diǎn) FISH探針類型 重復(fù)重復(fù)DNA序列序列 單拷貝或低拷貝的單拷貝或低拷貝的DNA序列序列 基因組基因組DNA 重復(fù)DNA序列探針重復(fù)重復(fù)DNA序列、多基因家族作為探針與染色體原序列、多基因家族作為探針與染色體原位雜交。容易產(chǎn)生較高的分辨率。因?yàn)檫@些位雜交。容易產(chǎn)生較高的分辨率。因?yàn)檫@些DNA多拷則序列在染色體上可達(dá)幾十個(gè)多拷則序列在染色體上可達(dá)幾十個(gè)kb或幾個(gè)或幾個(gè)Mb。日前

8、所使用的這類探針有日前所使用的這類探針有45S rDNA,5S rDNA、著絲點(diǎn)序列、端粒著絲點(diǎn)序列、端粒 序列、亞端粒序列、轉(zhuǎn)座子序列、亞端粒序列、轉(zhuǎn)座子等。等。單拷貝或低拷貝DNA探針 這類探針包括某個(gè)基因的這類探針包括某個(gè)基因的DNA克隆克隆. RFLP或或RAPD標(biāo)記。標(biāo)記。這些探針這些探針DNA序列一般只有序列一般只有1-2kb.因而這類標(biāo)記的原位雜因而這類標(biāo)記的原位雜交存在幾個(gè)方面的困難交存在幾個(gè)方面的困難: 1)需要用多層抗體結(jié)合來(lái)放大雜交信號(hào)需要用多層抗體結(jié)合來(lái)放大雜交信號(hào) 2)雜交信號(hào)很弱時(shí)雜交信號(hào)很弱時(shí).難以與背景信號(hào)區(qū)分難以與背景信號(hào)區(qū)分 3)能夠顯示雜交信號(hào)的細(xì)胞比例很

9、低能夠顯示雜交信號(hào)的細(xì)胞比例很低基因組DNA探針利用不同基因組利用不同基因組DNA同源性程度的差異。在原位同源性程度的差異。在原位雜交中只標(biāo)記某一基因組或某個(gè)物種的基因組雜交中只標(biāo)記某一基因組或某個(gè)物種的基因組DNA。在雜交中標(biāo)記的基因組在雜交中標(biāo)記的基因組DNA首先與其完全同源的首先與其完全同源的DNA雜交。雜交。可以檢測(cè)出導(dǎo)入異源多倍體的外源染色體或染色可以檢測(cè)出導(dǎo)入異源多倍體的外源染色體或染色體片段，同時(shí)可以清楚地顯示出易位與交換的位體片段，同時(shí)可以清楚地顯示出易位與交換的位置。置。 1重復(fù)序列探針重復(fù)序列探針(1)著絲粒探針著絲粒探針此類探針的雜交靶常大于此類探針的雜交靶常大于1Mb，

10、探針與靶，探針與靶DNA結(jié)合緊密，雜結(jié)合緊密，雜交信號(hào)強(qiáng)，易于檢測(cè)。主要用于檢測(cè)染色體的數(shù)目，鑒定單交信號(hào)強(qiáng)，易于檢測(cè)。主要用于檢測(cè)染色體的數(shù)目，鑒定單體、三體、多體、多倍體以及標(biāo)志染色體等染色體異常。體、三體、多體、多倍體以及標(biāo)志染色體等染色體異常。按染色體上位置分類探針v (2)異染色質(zhì)探針異染色質(zhì)探針v 人類1，6，9，16號(hào)染色體著絲粒附近及Y染色體長(zhǎng)臂含有明顯的異染色質(zhì)區(qū)，異染色質(zhì)探針除了可代替著絲粒探針用于檢測(cè)染色體數(shù)目異常外，還可用于分析涉及這些異染色質(zhì)區(qū)的染色體結(jié)構(gòu)改變。v (3)端粒探針端粒探針v 人體染色體長(zhǎng)、短臂末端均有簡(jiǎn)單重復(fù)序列組成的端粒結(jié)構(gòu)，端粒探針主要用于確定染色

11、體數(shù)目、末端缺失和染色體易位等。 2涂染探針涂染探針 染色體涂染探針的雜交靶或?yàn)檎麠l染色體，或?yàn)槿旧w的染色體涂染探針的雜交靶或?yàn)檎麠l染色體，或?yàn)槿旧w的單臂，也可以是染色體的特定區(qū)帶。這類探針在鑒定標(biāo)志單臂，也可以是染色體的特定區(qū)帶。這類探針在鑒定標(biāo)志染色體的來(lái)源、染色體易位等方面效果較好。其最重要的染色體的來(lái)源、染色體易位等方面效果較好。其最重要的應(yīng)用是對(duì)常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)顯帶方法難以鑒定的畸變?nèi)旧w應(yīng)用是對(duì)常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)顯帶方法難以鑒定的畸變?nèi)旧w進(jìn)行分析。不過(guò)，染色體涂染探針常不能顯示著絲粒及端進(jìn)行分析。不過(guò)，染色體涂染探針常不能顯示著絲粒及端粒區(qū)域。粒區(qū)域。 (1)整條染色體涂染探針整條

12、染色體涂染探針主要用于染色體易位、重排的檢測(cè)及鑒定標(biāo)志染色體的來(lái)源主要用于染色體易位、重排的檢測(cè)及鑒定標(biāo)志染色體的來(lái)源，但其不能分辨同一染色體臂間易位及染色體倒位。，但其不能分辨同一染色體臂間易位及染色體倒位。 (2)染色體單臂涂染探針染色體單臂涂染探針用于染色體易位（包括臂間易位）、重排的檢測(cè)及判斷標(biāo)志用于染色體易位（包括臂間易位）、重排的檢測(cè)及判斷標(biāo)志染色體的來(lái)源。染色體的來(lái)源。 (3)染色體區(qū)帶涂染探針染色體區(qū)帶涂染探針可用于檢測(cè)染色體區(qū)帶的擴(kuò)增、缺失、倒位以及染色體間可用于檢測(cè)染色體區(qū)帶的擴(kuò)增、缺失、倒位以及染色體間、染色體內(nèi)的易位。、染色體內(nèi)的易位。 3基因探針及其它基因探針及其它單

13、基因探針是針對(duì)基因組上的單一核苷酸序列。單基因探針是針對(duì)基因組上的單一核苷酸序列。（1）種類：YAC， BAC， Cosmid，Plasmid， cDNA片段（2）應(yīng)用 （a）定位DNA片段及嵌合體克隆驗(yàn)證； （b）確定染色體微小缺失與重復(fù)； （c）染色體斷裂點(diǎn)分析。 （d）間期細(xì)胞染色體數(shù)目異常診斷。 centromeretelomere subtelomerelocusspecificwhole chromosome paint探針的分類探針的分類CEP探針：染色體著絲粒探針探針：染色體著絲粒探針GLP探針：位點(diǎn)特異性探針探針：位點(diǎn)特異性探針 WCP探針：全染色體或染色探針：全染色體或染色

14、體區(qū)域特異性探針體區(qū)域特異性探針根據(jù)化學(xué)組成，可以將探針?lè)譃楦鶕?jù)化學(xué)組成，可以將探針?lè)譃?DNA探針探針RNA探針探針PNA：肽核苷酸（：肽核苷酸（PNA）探針）探針C CONTENTSONTENTS目錄目錄FISH檢測(cè)的基本原理FISH檢測(cè)的流程檢測(cè)的流程FISH檢測(cè)的臨床應(yīng)用間期間期FISH中期中期FISHC CONTENTSONTENTS目錄目錄FISH檢測(cè)的基本原理FISH檢測(cè)的流程FISH檢測(cè)的臨床應(yīng)用檢測(cè)的臨床應(yīng)用以BCR/ABL為例正常信號(hào)模式為：2G2R（如左圖）典型陽(yáng)性信號(hào)模式為：1G1R2F （如右圖）標(biāo)記位點(diǎn)：紅:ABL(9q34) 綠:BCR(22q11)G代表綠色信號(hào)

15、，R代表紅色信號(hào)，F(xiàn)代表融合信號(hào)。1、腫瘤個(gè)體化治療中的應(yīng)用（以、腫瘤個(gè)體化治療中的應(yīng)用（以CML為例）為例）2、遺傳病診斷過(guò)程的應(yīng)用、遺傳病診斷過(guò)程的應(yīng)用 重復(fù)序列或多拷貝的基因家族的染色體定位重復(fù)序列或多拷貝的基因家族的染色體定位 雜種親本染色體的鑒定雜種親本染色體的鑒定 染色體的結(jié)構(gòu)分析染色體的結(jié)構(gòu)分析 異源染色質(zhì)的鑒定異源染色質(zhì)的鑒定 染色體物理圖譜的構(gòu)建染色體物理圖譜的構(gòu)建 定位定位DNA片段及嵌合體克隆驗(yàn)證片段及嵌合體克隆驗(yàn)證 確定染色體微小缺失與重復(fù)確定染色體微小缺失與重復(fù) 染色體斷裂點(diǎn)分析染色體斷裂點(diǎn)分析 間期細(xì)胞染色體數(shù)目異常診斷間期細(xì)胞染色體數(shù)目異常診斷 Q&A做 最 優(yōu) 秀 的 第 三 方 檢 測(cè) 機(jī) 構(gòu)TO BE THE BEST INDEPENDENT LABORATORIES臨床基因組學(xué)教研室