硼酸鹽對(duì)馬鈴薯干腐病菌的抑制特性研究 學(xué)生科研訓(xùn)練計(jì)劃（SRTP）項(xiàng)目論文項(xiàng)目名稱：培養(yǎng)條件對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶的影響 主 持 人： 李夏妮 所在學(xué)院： 食品科學(xué)與工程學(xué)院 專業(yè)年級(jí)： 生物工程08級(jí) 指導(dǎo)教師： 李永才 副教授 學(xué)生科研訓(xùn)練計(jì)劃（SRTP）項(xiàng)目管理辦公室二一二年四月 目錄前言21 材料與方法31.1 材料31.2 方法31.2.1培養(yǎng)基制作31.2.2制作標(biāo)準(zhǔn)曲線31.2.3酶液的制備31.2.4 PG（多聚半乳糖醛酸酶）的測(cè)定41.2.5 PMG（果膠甲基半乳糖醛酸酶 ）的測(cè)定41.2.6 Cx（纖維素酶）的測(cè)定41.2.7-葡萄糖苷酶的測(cè)定41.2.8結(jié)果統(tǒng)計(jì)42 結(jié)果與分析42.1 PH值對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶的影響42.1.1 PH對(duì)PG（多聚半乳糖醛酸酶）活性的影響52.1.2 PH對(duì)PMG（果膠甲基半乳糖醛酸酶）活性的影響52.1.3 PH對(duì)Cx（纖維素酶）活性的影響62.1.4 PH對(duì)-葡萄糖苷酶活性的影響62.2培養(yǎng)時(shí)間對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶的影響72.2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)PG（多聚半乳糖醛酸酶）活性的影響72.2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)PMG（果膠甲基半乳糖醛酸酶）活性的影響72.2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Cx（纖維素酶）活性的影響82.2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)-葡萄糖苷酶活性的影響82.3 培養(yǎng)溫度對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶的影響92.3.1 培養(yǎng)溫度對(duì)PG（多聚半乳糖醛酸酶）活性的影響92.3.2 培養(yǎng)溫度對(duì)PMG（果膠甲基半乳糖醛酸酶）活性的影響92.3.3 培養(yǎng)溫度對(duì)Cx（纖維素酶）活性的影響102.3.4培養(yǎng)溫度對(duì)-葡萄糖苷酶活性的影響103 討論114 結(jié)論11參考文獻(xiàn)12培養(yǎng)條件對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶影響的研究李夏妮（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 蘭州 730070）摘要：本文通過體外試驗(yàn)，研究了不同培養(yǎng)條件（溫度、pH）和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)馬鈴薯干腐病菌主要細(xì)胞壁降解酶活性的影響。結(jié)果表明，不同培養(yǎng)條件及時(shí)間對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶具有一定的影響。除-葡萄糖苷酶（最佳 pH 8）外，多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果膠甲基半乳糖醛酸酶（PMG）和纖維素酶（Cx）均在pH 6 的條件下活性最高；對(duì)溫度而言，各種細(xì)胞壁降解酶在23-25 下活性最高，低溫對(duì)具有抑制作用；PG、PMG和Cx均在培養(yǎng)前期（第2d）活性最大，而-葡萄糖苷酶在培養(yǎng)3d時(shí)活性最大，各種酶隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長其活性均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。 因此可通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件來抑制病原物的主要致病因子細(xì)胞壁降解酶的活性，從而有效地控制馬鈴薯塊莖干腐病。關(guān)鍵詞：馬鈴薯；硫色鐮刀菌；細(xì)胞壁降解酶；培養(yǎng)條件前言馬鈴薯是我國北方的重要經(jīng)濟(jì)作物，甘肅省作為我國馬鈴薯生產(chǎn)的最佳適宜區(qū)之一，目前全省馬鈴薯種植面積擴(kuò)大到746萬畝，居內(nèi)蒙古自治區(qū)之后，列全國第二；總產(chǎn)量達(dá)到755萬噸，居全國第一1。馬鈴薯的種植、發(fā)展越來越引起人們的重視。但是近年來，馬鈴薯貯藏期腐爛問題也日漸突出。據(jù)調(diào)查造成爛窖的主要原因是塊莖攜帶病菌。雖然馬鈴薯塊莖病害有15多種，但是其中Fusarium solani和晚疫病復(fù)合侵染或Fusarium solani誘發(fā)侵染是導(dǎo)致爛窖的主體，有調(diào)查顯示，馬鈴薯貯藏期間，平均病薯率為27.59%，其中88.5%為黑色干腐病型病薯2。最終導(dǎo)致馬鈴薯減產(chǎn)和商品性降低，對(duì)生產(chǎn)者造成極大的損失。干腐病又名“干腐爛”，染病塊莖長白色至灰色絨毛物，內(nèi)部薯肉則呈灰褐色至深褐色病變，有的出現(xiàn)空心，空腔內(nèi)充滿菌絲體，嚴(yán)重時(shí)整個(gè)塊莖僵縮或呈干腐狀，不能食用3。干腐病是由鐮刀菌（Fusarium spp.）4所致病的。干腐病是限制馬鈴薯產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的主要采后病害之一，貯藏期間其發(fā)病率高達(dá)30%。目前主要利用化學(xué)殺菌劑進(jìn)行控制，然而化學(xué)殺菌劑的大量使用不僅會(huì)產(chǎn)生環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等問題，也會(huì)導(dǎo)致病原物產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致了抗藥菌株的產(chǎn)生，使其使用受到越來越多的限制，因而，必須尋求新的安全高效的防腐劑，以逐步取代和減少化學(xué)殺菌劑使用5。病原物產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶（果膠甲酯酶、多聚半乳糖醛酸酶等多種細(xì)胞壁降解酶）在侵入和定殖寄主組織中產(chǎn)生了重要作用，是其主要的致病因子之一6。研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)條件對(duì)酶的產(chǎn)生及活性具有一定的影響，故而本試驗(yàn)以馬鈴薯干腐病菌(Fusarium sulphureum)為研究對(duì)象，系統(tǒng)研究培養(yǎng)條件(溫度,pH等)對(duì)馬鈴薯干腐病菌(F. sulphureum)產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶種類、活性的影響。進(jìn)而了解不同培養(yǎng)條件下馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶產(chǎn)生的情況，對(duì)有的放矢的進(jìn)行病害控制具有十分重要的意義。本研究通過體外試驗(yàn)，研究培養(yǎng)條件(溫度，pH)和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)馬鈴薯干腐病菌主要細(xì)胞壁降解酶產(chǎn)生的影響，以期為馬鈴薯干腐病的防治提供新的方法。1 材料與方法 1.1 材料馬鈴薯干腐病菌（Fusarium sulphureum ） 超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD）、恒溫培養(yǎng)搖床（THZ-100）、電冰箱（BCD-196TX）、分光光度計(jì)（UV-2450）、巴氏滅菌鍋（YX-280B）、恒溫水浴鍋（HWS24）、烘箱、電磁爐 1.2 方法1.2.1培養(yǎng)基制作參照方中達(dá) 9法進(jìn)行。制作馬鈴薯水瓊脂培養(yǎng)基(PDB)，培養(yǎng)基成分：馬鈴薯250g，蒸餾水1000mL。將馬鈴薯切碎，大約1cm的小方塊，加水煮沸30min后用四層紗布過濾并定容至1000mL。分裝在三角瓶(每個(gè)三角瓶瓶子裝100mL培養(yǎng)基)中進(jìn)行高壓滅菌。滅菌后制備平板PDB。1.2.2 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線配置一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，按照3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測(cè)定還原糖的方法，在540nm 處測(cè)定吸光度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.3 酶液的制備將培養(yǎng)的5個(gè)硫色鐮刀菌菌柄擴(kuò)于100mL經(jīng)滅菌后的培養(yǎng)基中在三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)數(shù)天后將三角瓶中培養(yǎng)的菌培養(yǎng)液真空抽濾，置濾液于離心管中離心10min備用。1.2.4多聚半乳糖醛酸酶（PG）的測(cè)定取兩只具塞刻度試管，每只試管中都分別加入1.0mL50mmol/L,PH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液和0.5mL10g/L的 PG溶液，往其中一只試管中加0.5mL酶液，另一只試管中加0.5mL蒸餾水作為對(duì)照，混勻后置于37水浴中保溫反應(yīng)1h。保溫后，迅速加入1.5mLDNS,在沸水浴中加熱5min,然后迅速冷卻至室溫，加8mL蒸餾水稀釋，混勻。在波長540nm處按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法比色，測(cè)定各試管中溶液的吸光度值。重復(fù)三次。 1.2.5 果膠甲基半乳糖醛酸酶（PMG）的測(cè)定取兩只具塞刻度試管，每只試管中都分別加入1.0mL50mmol/L,PH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液和0.5mL10g/L的果膠溶液，往其中一只試管中加0.5mL酶液，另一只試管中加0.5mL蒸餾水作為對(duì)照，混勻后置于37水浴中保溫反應(yīng)1h。保溫后，迅速加入1.5mLDNS,在沸水浴中加熱5min,然后迅速冷卻至室溫，加8mL蒸餾水稀釋，混勻。在波長540nm處按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法比色，測(cè)定各試管中溶液的吸光度值。重復(fù)三次。 1.2.6纖維素酶（Cx）的測(cè)定取兩只具塞刻度試管，每只試管中都分別加入1.5mL10g/L的CMC（羧甲基纖維素）溶液，往其中一只試管中加0.5mL酶液，另一只試管中加0.5mL蒸餾水作為對(duì)照，混勻后置于37水浴中保溫反應(yīng)1h。保溫后，迅速加入1.5mLDNS,在沸水浴中加熱5min,然后迅速冷卻至室溫，加8mL蒸餾水稀釋，混勻。在波長540nm處按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法比色，測(cè)定各試管中溶液的吸光度值。重復(fù)三次。 1.2.7 -葡萄糖苷酶的測(cè)定取兩只具塞刻度試管，每只試管中都分別加入1.5mL10g/L的水楊苷溶液，往其中一只試管中加0.5mL酶液，另一只試管中加0.5mL蒸餾水作為對(duì)照，混勻后置于37水浴中保溫反應(yīng)1h。保溫后，迅速加入1.5mLDNS,在沸水浴中加熱5min,然后迅速冷卻至室溫，加8mL蒸餾水稀釋，混勻。在波長540nm處按照與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法比色，測(cè)定各試管中溶液的吸光度值。重復(fù)三次1.2.8結(jié)果統(tǒng)計(jì) 所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差（±SE）并作圖。2 結(jié)果與分析2.1 pH值對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶的影響2.1.1 pH對(duì)PG活性的影響圖1 不同pH對(duì)F. sulphureum PG 酶活性的影響由圖1可見，不同pH的培養(yǎng)液對(duì)F. sulphureum PG活性的影響存在差異，其中pH為6時(shí)其活性最大，pH為8時(shí)PG活性最低。當(dāng)pH大于6時(shí)，其活性呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì)。2.1.2 PH對(duì)PMG活性的影響圖2 不同pH對(duì)F. sulphureum PMG 酶活性的影響由圖2可見，不同pH的培養(yǎng)液對(duì)F. sulphureum PMG活性表現(xiàn)出不同的影響，當(dāng)pH大于6時(shí)，其活性呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì)，其中pH為6時(shí)，PMG活性最大，pH為8時(shí)PMG（果膠甲基半乳糖醛酸酶）活性最低。2.1.3 PH對(duì)Cx活性的影響圖3 不同pH對(duì)F. sulphureum Cx 酶活性的影響由圖3可見，不同pH的培養(yǎng)液對(duì)F. sulphureum Cx活性表現(xiàn)出不同的影響，隨著pH的增加，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中pH為6時(shí)，Cx活性最大， pH為8時(shí)Cx活性最低。2.1.4 PH對(duì)-葡萄糖苷酶活性的影響圖4 不同pH對(duì)F. sulphureum -葡萄糖苷酶活性的影響由圖4可見，不同pH的培養(yǎng)液對(duì)F. sulphureum-葡萄糖苷酶活性表現(xiàn)出不同的影響，隨著pH的增加，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中pH為8時(shí)，-葡萄糖苷酶活性最大， pH為5時(shí)-葡萄糖苷酶活性最低。2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶的影響2.2.1培養(yǎng)時(shí)間對(duì)PG活性的影響圖5 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F. sulphureum PG 酶活性的影響由圖5可見不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F. sulphureum PG活性的影響存在差異，其中2d時(shí)其活性最大，培養(yǎng)時(shí)間為5d時(shí)PG活性最低。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間大于6天時(shí)PG活性基本保持在0.16mg/min.mL左右，其活性呈現(xiàn)先上升后降低后上升的趨勢(shì)。2.2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)PMG活性的影響圖6 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F. sulphureum PMG 酶活性的影響由圖6可見不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F. sulphureum PMG活性的影響存在差異，其中2d時(shí)其活性最大，培養(yǎng)時(shí)間為5d時(shí)PMG活性最低。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間大于6天時(shí)PMG活性基本保持在0.17mg/min.mL左右，其活性呈現(xiàn)先上升后降低后上升的趨勢(shì)。2.2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Cx活性的影響圖7不同p培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F. sulphureum Cx 酶活性的影響917d養(yǎng)時(shí)間ANGSHIJIAN由圖7可見不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F. sulphureum Cx活性的影響存在差異，其中2d時(shí)其活性最大，培養(yǎng)時(shí)間為8d時(shí)Cx活性最低。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間大于5天時(shí)Cx活性基本保持在0.129mg/min.mL左右，其活性呈現(xiàn)先上升后降低后上升的趨勢(shì)。2.2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)-葡萄糖苷酶活性的影響圖8 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F. sulphureum -葡萄糖苷酶活性的影響由圖8可見不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)F. sulphureum -葡萄糖苷酶活性的影響存在差異，其中3d時(shí)其活性最大，培養(yǎng)時(shí)間為5d時(shí)-葡萄糖苷酶活性最低。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間大于6天時(shí)-葡萄糖苷酶活性基本保持在0.130mg/min.mL左右。2.3培養(yǎng)溫度對(duì)馬鈴薯干腐病菌細(xì)胞壁降解酶的影2.3.1 培養(yǎng)溫度對(duì)PG活性的影響圖9 不同培養(yǎng)溫度對(duì)F. sulphureum PG 酶活性的影響由圖9可見，不同培養(yǎng)溫度對(duì)F. sulphureum PG活性表現(xiàn)出不同的影響，當(dāng)溫度高于25時(shí)，其活性呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì)，在溫度為25時(shí)，PG活性最大，在溫度為20時(shí)，PG活性最低。2.3.2 培養(yǎng)溫度對(duì)PMG活性的影響圖10 不同培養(yǎng)溫度對(duì)F. sulphureum PMG 酶活性的影響由圖10可見，不同培養(yǎng)溫度對(duì)F. sulphureum PMG活性表現(xiàn)出不同的影響，當(dāng)溫度高于25時(shí)，其活性呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì)，在溫度為25時(shí)，PMG活性最大，在溫度為20時(shí)，PMG活性最低。2.3.3 培養(yǎng)溫度對(duì)Cx活性的影響圖11 不同培養(yǎng)溫度對(duì)F. sulphureum Cx 酶活性的影響由圖11可見，不同培養(yǎng)溫度對(duì)F. sulphureum Cx 酶活性表現(xiàn)出不同的影響。隨著培養(yǎng)溫度的升高，其活性呈現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì)，在溫度為25時(shí)，Cx 酶活性最大，在溫度為20時(shí)，Cx 酶活性最低。2.3.4 培養(yǎng)溫度對(duì)-葡萄糖苷酶活性的影響圖12不同培養(yǎng)溫度對(duì)F. sulphureum -葡萄糖苷酶活性的影響由圖12可見，不同培養(yǎng)溫度對(duì)F. sulphureum-葡萄糖苷酶活性表現(xiàn)出不同的影響，當(dāng)溫度高于25時(shí)，其活性基本不變（約為0.153mg/min.mL），在溫度為25時(shí)，-葡萄糖苷酶活性最大，在溫度為23時(shí)，-葡萄糖苷酶活性最低。3 討論本試驗(yàn)通過控制培養(yǎng)條件（溫度、PH）和培養(yǎng)時(shí)間來有效的控制馬鈴薯由硫色鐮刀菌引起的腐爛，保持莖塊的品質(zhì)包括對(duì)馬鈴薯病害的控制。據(jù)報(bào)道，研究發(fā)現(xiàn)，由植物病原菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶在病菌致病過程中起重要作用，隨胞壁降解酶濃度增加，酶浸解能力增強(qiáng)，兩者呈顯著的正相關(guān)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)及貯藏條件對(duì)酶的產(chǎn)生及活性具有一定的影響，但關(guān)于培養(yǎng)條件(溫度, pH)對(duì)馬鈴薯干腐病菌(Fusarium sulphureum)細(xì)胞壁降解酶產(chǎn)生和活性的影響尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)中培養(yǎng)條件（溫度、時(shí)間、pH）可以有效抑制硫色鐮刀菌（F. sulphureum Schlechlendahl）生長，在對(duì)硫色鐮刀菌菌絲生長產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶活性的抑制上有顯著的效果。實(shí)驗(yàn)表明：（1）在pH為8、培養(yǎng)時(shí)間為5d、溫度為20時(shí)對(duì)PG抑制作用最顯著：（2）在pH為8、培養(yǎng)時(shí)間為5d、溫度為20時(shí)對(duì)PMG的抑制作用最顯著；（3）在pH為8、培養(yǎng)時(shí)間為8d、溫度為20時(shí)對(duì)Cx抑制作用最顯著；（4）在pH為5、培養(yǎng)時(shí)間為5d、溫度為23時(shí)對(duì)-葡萄糖苷酶的抑制作用最顯著。故而可通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件來抑制病原物的生長從而有效地控制馬鈴薯干腐病，可見培養(yǎng)條件抑菌在馬鈴薯干腐病菌控制中具有良好的應(yīng)前景。 隨科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，細(xì)胞壁降解酶的作用機(jī)制應(yīng)該可以明確，這可為研究病菌致病的分子機(jī)制及新的病害控制措施奠定基礎(chǔ)。4 結(jié)論本試驗(yàn)通過研究培養(yǎng)條件（溫度、PH）和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)硫色鐮刀菌（F. sulphureum）細(xì)胞壁降解酶活性的影響，結(jié)果表明：4.1 pH為6，溫度為23，培養(yǎng)2d時(shí)PG的活性最大，而pH為8，溫度為20，培養(yǎng)時(shí)間延長至5d時(shí)，其酶活性顯著被抑制。4.2 pH為6，溫度為25，培養(yǎng)2d為PMG產(chǎn)生和活性被激活最佳的條件，而pH為8，溫度為20，培養(yǎng)時(shí)間延長至5d時(shí)，其酶活性最低。4.3 Cx產(chǎn)生和活性被激活最佳的條件pH為6，溫度為25，培養(yǎng)時(shí)間2d，而pH為8，溫度為20，培養(yǎng)時(shí)間延長至8d時(shí)，其酶活性最低。4.4 -葡萄糖苷酶活性最大的培養(yǎng)條件和時(shí)間為：pH為8，溫度為25，培養(yǎng)時(shí)間3d，而pH為5，溫度為23，培養(yǎng)時(shí)間延長至5d時(shí)，其酶活性顯著被抑制。參考文獻(xiàn)1 趙永平, 韓建民.甘肅馬鈴薯產(chǎn)業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力分析J. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 40(2): 250-255.2 何蘇琴, 金秀琳, 魏周全等. 甘肅省定西地區(qū)馬鈴薯塊莖干腐病病原真菌的分鑒定J. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 5(19):550-5523 張維一, 畢陽. 果蔬采后病害與控制M. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 19964 葉琪明, 王拱辰. 浙江馬鈴薯干腐病病原研究初報(bào)J. 植物病理學(xué)報(bào), 1994, 25:1485 葛永紅, 畢陽, 楊冬梅. 誘抗劑處理對(duì)“銀帝”甜瓜采后粉霉病和黑斑病的抑制效果J. 食品科學(xué), 2006, 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