專題專題2 :2 :微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用微生物包括微生物包括真菌真菌原生動物原生動物特點：特點：結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡單結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡單, ,個體多數(shù)十分微小個體多數(shù)十分微小. .通通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結(jié)構(gòu)的甚至沒有細胞結(jié)構(gòu). .且體內(nèi)一般不含有葉綠且體內(nèi)一般不含有葉綠素素. .不能進行光合作用不能進行光合作用. . 原核生物界原核生物界 原生生物界原生生物界真菌界真菌界病毒界病毒界微生物基礎(chǔ)知識一、基礎(chǔ)知識：一、基礎(chǔ)知識：（一）培養(yǎng)基（一）培養(yǎng)基 培養(yǎng)基是人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不培養(yǎng)基是人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。（1 1）按物理狀態(tài)來分：培養(yǎng)基可分為）按物理狀態(tài)來分：培養(yǎng)基可分為固體培固體培養(yǎng)基養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基和和半固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基。（2 2）按功能來分，可分為）按功能來分，可分為選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基和和鑒別鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)基。（3 3）按成分來分，可分為）按成分來分，可分為天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基和和合成合成培養(yǎng)基培養(yǎng)基。1.1.培養(yǎng)基的類型和用途培養(yǎng)基的類型和用途培養(yǎng)基的種類液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基據(jù)物理性質(zhì)分天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基據(jù)化學(xué)成分分選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基據(jù)用途分常用于工業(yè)生產(chǎn)常用于觀察微生物的運動、鑒定菌種用于微生物的分離、計數(shù)常用于工業(yè)生產(chǎn)常用于分類、鑒定在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長，促進所需要的微生物的生長。例如，在培養(yǎng)基中加入青霉素，以抑制細菌、放線菌的生長，從而分離到酵母菌和霉菌。又如，在培養(yǎng)基中加入高濃度的食鹽可以抑制多種細菌的生長，但不影響金黃色葡萄球菌的生長。根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成，用以鑒別不同種類的微生物。例如，在培養(yǎng)基中加入伊紅和美藍，可以用來鑒別飲用水和乳制品中是否存在大腸桿菌等細菌：如果有大腸桿菌，其代謝產(chǎn)物就與伊紅和美藍結(jié)合，使菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤。固體培養(yǎng)基：菌落固體培養(yǎng)基：菌落液體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基：表面生長表面生長均勻混濁生長均勻混濁生長沉淀生長沉淀生長選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基: : 分離酵母菌、霉菌等真菌分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: : 分離金黃色葡萄球菌分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基不加氮源的無氮培養(yǎng)基: : 分離固氮菌分離固氮菌不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基: : 分離自養(yǎng)型微生物分離自養(yǎng)型微生物 根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。量，用人工方法模擬合成的。 合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點：優(yōu)點：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定對固定; ;成本低成本低 缺點：缺點： 缺少某些成分，不能完全滿缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。足體外細胞生長需要。 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基: : 天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點：缺點：來源受限來源受限; ;成分復(fù)雜，影響對某成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析; ;易發(fā)生支原體污染易發(fā)生支原體污染; ;天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基：2、培養(yǎng)基配制原則： （1）目的要明確目的要明確：根據(jù)微生物的種類（自養(yǎng)：根據(jù)微生物的種類（自養(yǎng)或異養(yǎng)）、培養(yǎng)目的等確定配制培養(yǎng)基的種類，或異養(yǎng)）、培養(yǎng)目的等確定配制培養(yǎng)基的種類，因為不同的微生物對培養(yǎng)物質(zhì)的需求不同。因為不同的微生物對培養(yǎng)物質(zhì)的需求不同。 （2）營養(yǎng)要協(xié)調(diào)營養(yǎng)要協(xié)調(diào)：注意各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度：注意各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例（谷氨酸生產(chǎn)中碳氮比和比例（谷氨酸生產(chǎn)中碳氮比4：1時，菌體大時，菌體大量繁殖谷氨酸少；量繁殖谷氨酸少；3：1時菌體繁殖受抑制，谷時菌體繁殖受抑制，谷氨酸合成量大增。）氨酸合成量大增。） （3）pH要適宜要適宜：各種微生物適宜生長的：各種微生物適宜生長的pH范范圍不同。圍不同。 細菌細菌pH為：為：6.5-7.5； 放線菌放線菌pH為：為：7.5-8.5； 真菌真菌pH為：為：5.0-6.0。3、培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成 不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水水、碳源碳源、和、和氮源氮源、無無機鹽機鹽等營養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長對等營養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長對pH、特特殊營養(yǎng)物質(zhì)殊營養(yǎng)物質(zhì)(例如例如:生長因子生長因子即細菌生長必需，而自身不能即細菌生長必需，而自身不能合成的化合物合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。 4、微生物的五種營養(yǎng)要素、微生物的五種營養(yǎng)要素碳源 （carbon source） 氮源（nitrogen source） 生長因子（growth factor） 無機鹽（mineral salts） 水（wahtor） 凡能為微生物提供生長繁殖所需碳元凡能為微生物提供生長繁殖所需碳元素的營養(yǎng)物質(zhì)都稱為碳源素的營養(yǎng)物質(zhì)都稱為碳源 。碳源碳源C素構(gòu)成細胞及代謝產(chǎn)物的骨架素構(gòu)成細胞及代謝產(chǎn)物的骨架 C素是大多數(shù)微生物代謝所需的能量來源素是大多數(shù)微生物代謝所需的能量來源 自養(yǎng)微生物以二氧化碳或碳酸鹽為惟一碳源進行代謝自養(yǎng)微生物以二氧化碳或碳酸鹽為惟一碳源進行代謝生長；異養(yǎng)微生物必須以有機物作為碳源進行代謝生生長；異養(yǎng)微生物必須以有機物作為碳源進行代謝生長。長。 碳源是異養(yǎng)微生物的主要能源物質(zhì)。碳源是異養(yǎng)微生物的主要能源物質(zhì)。碳源功能碳源功能無機無機C源：源：CO2、碳酸鹽，只能被自養(yǎng)微生物利用碳酸鹽，只能被自養(yǎng)微生物利用有機有機C源：各種糖類，其次是有機酸、醇類、源：各種糖類，其次是有機酸、醇類、 脂類和烴脂類和烴類化合物類化合物 （脂肪酸，花生粉餅，石油）（脂肪酸，花生粉餅，石油） 碳源種類碳源種類 凡是能為微生物提供所需氮元素的營養(yǎng)物凡是能為微生物提供所需氮元素的營養(yǎng)物質(zhì)都稱為氮源。質(zhì)都稱為氮源。氮源(nitrogin source) 為微生物提供合成細胞物質(zhì)代謝產(chǎn)物的原料為微生物提供合成細胞物質(zhì)代謝產(chǎn)物的原料 對許多微生物來說，既可利用無機態(tài)氮，也可對許多微生物來說，既可利用無機態(tài)氮，也可利用有機態(tài)氮。利用有機態(tài)氮。 固氮微生物可以利用氮氣作為氮源進行生長。固氮微生物可以利用氮氣作為氮源進行生長。 某些種類的氮源也能為微生物提供能量，某些種類的氮源也能為微生物提供能量， 如如NH3既是硝化細菌的氮源又是能源，既是硝化細菌的氮源又是能源， 含含C、H、O、N的蛋白質(zhì)等也能為微生物提的蛋白質(zhì)等也能為微生物提供能量。供能量。氮源功能氮源功能分子態(tài)氮：固氮微生物以分子氮為唯一氮源分子態(tài)氮：固氮微生物以分子氮為唯一氮源 無機態(tài)氮：硝酸鹽、銨鹽幾乎所有微生物能利用無機態(tài)氮：硝酸鹽、銨鹽幾乎所有微生物能利用 有機態(tài)氮：蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物有機態(tài)氮：蛋白質(zhì)及其降解產(chǎn)物 a實驗室常用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏做氮源實驗室常用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏做氮源 b生產(chǎn)用玉米漿、豆餅、葵花餅、花生餅等生產(chǎn)用玉米漿、豆餅、葵花餅、花生餅等氮源種類氮源種類 構(gòu)成微生物細胞的組成成分構(gòu)成微生物細胞的組成成分 調(diào)解微生物細胞的滲透壓，調(diào)解微生物細胞的滲透壓， PH值和氧化還原電值和氧化還原電 位位 有些無機鹽如有些無機鹽如S、Fe還可做為自養(yǎng)微生物的能源還可做為自養(yǎng)微生物的能源 構(gòu)成酶活性基的組成成分，維持酶活性。構(gòu)成酶活性基的組成成分，維持酶活性。Mg、Ca、K是多種酶的激活劑是多種酶的激活劑 無機鹽（無機鹽（mineral saltsmineral salts） 無機鹽功能無機鹽功能 構(gòu)成微生物細胞構(gòu)成微生物細胞以以C、H、O、N、P、S六種六種元素為主，約占細胞干重的元素為主，約占細胞干重的95以上；以上； Ca、K 、Mg、Fe為大量元素，以無機鹽陽為大量元素，以無機鹽陽離子形式被吸收，配培養(yǎng)基要加磷酸鹽、硫酸離子形式被吸收，配培養(yǎng)基要加磷酸鹽、硫酸鹽。鹽。 Zn、Ca、Mn、Co、Mo等微量元素，在微等微量元素，在微生物培養(yǎng)中有生物培養(yǎng)中有0.1PPM就可以了，自來水原料就可以了，自來水原料中已夠用，不需另加。中已夠用，不需另加。無機鹽種類無機鹽種類 微生物生長不可缺少的微生物生長不可缺少的 微量有機物質(zhì)叫生長因子。微量有機物質(zhì)叫生長因子。維生素 氨基酸堿 基 生長因子生長因子 有的微生物自己不能合成維生素，需要外加，主有的微生物自己不能合成維生素，需要外加，主要是要是B族維生素、硫胺素、葉酸、泛酸、核黃素等，如族維生素、硫胺素、葉酸、泛酸、核黃素等，如生產(chǎn)味精需加生物素（是生產(chǎn)味精需加生物素（是B族中的一種即族中的一種即VH）。）。 維生素維生素 有些微生物自己不能合成某種氨基酸，必須給予有些微生物自己不能合成某種氨基酸，必須給予補充，如賴補充，如賴AA發(fā)酵所用的黃色短桿菌不能合成環(huán)絲發(fā)酵所用的黃色短桿菌不能合成環(huán)絲AA，為環(huán)為環(huán)絲絲AA缺陷型菌株，在培養(yǎng)基中必須添加含缺陷型菌株，在培養(yǎng)基中必須添加含環(huán)絲環(huán)絲AA的氮源。如豆餅水解液或毛發(fā)水解液等。的氮源。如豆餅水解液或毛發(fā)水解液等。氨基酸氨基酸 嘧啶和嘌呤是核酸和輔酶的重要組分，是許多微生物嘧啶和嘌呤是核酸和輔酶的重要組分，是許多微生物必須的生長因素。必須的生長因素。 有些微生物不僅不能合成嘧啶和嘌呤，而且不能將補有些微生物不僅不能合成嘧啶和嘌呤，而且不能將補充的嘧啶和嘌呤結(jié)合在核苷酸上，還必須供給核苷酸，充的嘧啶和嘌呤結(jié)合在核苷酸上，還必須供給核苷酸，有的菌需補充卟啉或其衍生物，還有的菌需供給（低有的菌需補充卟啉或其衍生物，還有的菌需供給（低碳）脂肪酸等。碳）脂肪酸等。堿基堿基水水 是細胞中生化反應(yīng)的良好介質(zhì)；營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物是細胞中生化反應(yīng)的良好介質(zhì)；營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物都必須溶解在水里，才能被吸收或排出體（細胞）外。都必須溶解在水里，才能被吸收或排出體（細胞）外。 水的比熱高，能有效的吸收代謝過程中放出的熱量，水的比熱高，能有效的吸收代謝過程中放出的熱量，不致使細胞的溫度驟然上升。不致使細胞的溫度驟然上升。 維持細胞的膨壓（控制細胞形態(tài)）。維持細胞的膨壓（控制細胞形態(tài)）。碳源、氮源、生長因子的比較來 源常用原料功 能碳源CO2、NaHCO3、糖類、脂肪酸、花生粉餅、石油等糖類構(gòu)成細胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物，有些還是異養(yǎng)做生物的主要能源物質(zhì)氮源N2、NH3、銨鹽、硝酸鹽、尿素、牛肉膏和蛋白胨等銨鹽、硝酸鹽等合成蛋白質(zhì)、核酸以及含氮的代謝產(chǎn)物生長因子維生素、氨基酸、堿基酶、核酸等的組成成分1.1.無菌技術(shù)的概念無菌技術(shù)的概念 無菌操作泛指無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。所有防止雜菌污染的方法。無論是隨后無論是隨后將要學(xué)到的將要學(xué)到的倒平板倒平板、平板劃線平板劃線操作，還操作，還是是稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法，其操作中的每一步，其操作中的每一步都需要做到都需要做到“無菌無菌”，即，即防止雜菌污染。防止雜菌污染。只有熟練、規(guī)范地進行無菌操作，才可只有熟練、規(guī)范地進行無菌操作，才可能成功地培養(yǎng)微生物。能成功地培養(yǎng)微生物。 （）（）消毒定義：消毒定義：使用較溫和的物理或化學(xué)方法殺死使用較溫和的物理或化學(xué)方法殺死物體表面或內(nèi)部的部分微生物（不包括物體表面或內(nèi)部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。芽孢和孢子）。2.2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別 （2 2）滅菌的定義：）滅菌的定義：是指使用強烈的理化因素殺死物是指使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外體內(nèi)外所有的所有的微生物，包括所有細菌微生物，包括所有細菌的孢子、芽孢、霉菌及病毒，而達到的孢子、芽孢、霉菌及病毒，而達到完全無菌完全無菌之過程。之過程。 滅菌與消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工滅菌與消毒技術(shù)是微生物有關(guān)工作中最普通也是最重要的技術(shù)。作中最普通也是最重要的技術(shù)。比比較較項項理化因素的理化因素的作用強度作用強度消滅微生物消滅微生物的數(shù)量的數(shù)量芽孢和孢子芽孢和孢子能否被消滅能否被消滅消消毒毒較為溫和較為溫和部分生活狀部分生活狀態(tài)的微生物態(tài)的微生物不能不能滅滅菌菌強烈強烈全部微生物全部微生物能能消毒與滅菌的比較消毒與滅菌的比較1 1、煮沸消毒法煮沸消毒法:100100煮沸煮沸5-6min5-6min2 2、巴氏消毒法巴氏消毒法：70-75 70-75 下煮下煮30min30min或或 80 80 下煮下煮15min15min（不耐高溫的液（不耐高溫的液體：牛奶）體：牛奶）3 3、化學(xué)藥劑消毒法化學(xué)藥劑消毒法: :用用75%75%酒精、新潔酒精、新潔爾滅等進行皮膚消毒爾滅等進行皮膚消毒; ;氯氣消毒水源氯氣消毒水源4 4、紫外線消毒紫外線消毒（對空氣消毒）（對空氣消毒）(1)消毒的方法：消毒的方法：3.3.常用的消毒與滅菌的方法常用的消毒與滅菌的方法1 1、灼燒滅菌、灼燒滅菌（接種環(huán)、接種針、（接種環(huán)、接種針、試管口）試管口）2 2、干熱滅菌：干熱滅菌：160-160-170 170 下加熱下加熱1-2h1-2h。（玻璃、金屬器皿）（玻璃、金屬器皿）3 3、高壓蒸氣滅菌：高壓蒸氣滅菌：100kPa100kPa、121 121 下下維持維持15-30min.15-30min.（培（培養(yǎng)基及多種容器、物養(yǎng)基及多種容器、物品）品）(2)滅菌的方法：滅菌的方法： 最常用的滅菌方法是最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌，它可以殺，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。，同時可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。 有些玻璃器皿也可采用有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌高溫干熱滅菌。為了防。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。通過，而空氣中的其他微生物不能通過。 培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)皿是由培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)皿是由正反兩平面板互扣而正反兩平面板互扣而成成，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設(shè)，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設(shè)計的。計的。 1.1.無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1 1） 培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2 2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管玻棒、試管、燒瓶和吸管（3 3） 實驗操作者的雙手實驗操作者的雙手 答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。身被微生物感染。答：（答：（1）、（）、（2）需要滅菌；（）需要滅菌；（3）需要消毒）需要消毒。1 1、器具的滅菌、器具的滅菌2 2、培養(yǎng)基的配制、培養(yǎng)基的配制3 3、培養(yǎng)基的滅菌、培養(yǎng)基的滅菌4 4、倒平板、倒平板5 5、微生物接種、微生物接種6 6、恒溫箱中培養(yǎng)、恒溫箱中培養(yǎng)7 7、菌種的保存、菌種的保存三、實驗操作三、實驗操作 （ 一一.）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細菌）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細菌）1 1計算、稱量計算、稱量2 2溶化溶化3 3調(diào)調(diào)pHpH：pH7pH76 64 4過濾：這一步可以省去。過濾：這一步可以省去。5 5分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。三角燒瓶容積的一半為宜。6 6加塞加塞7 7包扎包扎操作步驟操作步驟 8 8滅菌滅菌: : 將將5050mlml培養(yǎng)基培養(yǎng)基用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為鍋，在壓力為100100kPakPa、溫度為溫度為121121，滅菌，滅菌15153030minmin。將將培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿用舊報紙包裹，放入干用舊報紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在熱滅菌箱內(nèi)，在160160170 170 下滅菌下滅菌2 2h h。 9 9倒平板倒平板: : 待培養(yǎng)基冷卻到待培養(yǎng)基冷卻到50 50 左右時，在酒精燈附左右時，在酒精燈附近倒平板。（倒平板操作見課本）近倒平板。（倒平板操作見課本）2 2d d后觀察平后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種板，無雜菌污染才可用來接種. . 10 10無菌檢查：無菌檢查： 將滅菌的培養(yǎng)基放入將滅菌的培養(yǎng)基放入3737的溫室中培的溫室中培養(yǎng)養(yǎng)24482448小時，以檢查滅菌是否徹底。小時，以檢查滅菌是否徹底。 1. 1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 50 左右左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？基的溫度？ 答：答：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。時，就可以進行倒平板了。2.2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？ 答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。生物污染培養(yǎng)基。3.3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？培養(yǎng)微生物嗎？為什么？ 答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。 答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。培養(yǎng)微生物。（二）、純化大腸桿菌（二）、純化大腸桿菌接種方法有：接種方法有：平板劃線法平板劃線法和和稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法 平板劃線法平板劃線法: :通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線的操作基表面連續(xù)畫線的操作, ,將聚集的菌鐘逐步稀將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面釋分散到培養(yǎng)基的表面. . 在數(shù)次畫線后在數(shù)次畫線后, ,可以分離到可以分離到由一個細胞繁由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體殖而來的肉眼可見的子細胞群體, ,這就是這就是菌落菌落. .菌落： 單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體，叫做菌個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體，叫做菌落落。 菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。菌落細菌的菌落特征細菌的菌落特征因種而異因種而異 霉菌的菌落霉菌的菌落特征特征因種而異因種而異菌落 1.1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？ 答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。感染操作者。 2.2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。 3.3.在作第二次以及其后的劃線操作時，在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？ 答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。的菌落。 涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌進行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第操作要求，想一想，第2 2步應(yīng)如何進行無步應(yīng)如何進行無菌操作？菌操作？ 應(yīng)從操作的各個細節(jié)保證應(yīng)從操作的各個細節(jié)保證“無菌無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。在酒精燈火焰周圍等等。四、課題成果評價四、課題成果評價 （一）培養(yǎng)基的制作是否合格（一）培養(yǎng)基的制作是否合格 如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1 12 d2 d后無后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。制備。 （二）接種操作是否符合無菌要求（二）接種操作是否符合無菌要求 如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求，需要分析原因，接種過程中，無菌操作還未達到要求，需要分析原因，再次練習(xí)。再次練習(xí)。 （三）是否進行了及時細致的觀察與記錄（三）是否進行了及時細致的觀察與記錄 培養(yǎng)培養(yǎng)12 h12 h與與24 h24 h后的大腸桿菌菌落的大小會有明后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學(xué)會發(fā)現(xiàn)這一點，并能觀察顯不同，及時觀察記錄的同學(xué)會發(fā)現(xiàn)這一點，并能觀察到其他一些細微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學(xué)生到其他一些細微的變化。這一步的要求主要是培養(yǎng)學(xué)生良好的科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。良好的科學(xué)態(tài)度與習(xí)慣。 1 1、臨時保藏：、臨時保藏：接種到固體斜面培接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后養(yǎng)基，菌落長成后置于置于44冰箱保存。冰箱保存。 2 2、長期保存：、長期保存：甘油冷凍管藏法甘油冷凍管藏法本課題知識小結(jié)本課題知識小結(jié): :【典例解析典例解析】 例例1 1關(guān)微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是關(guān)微生物營養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是A.A.是碳源的物質(zhì)不可能同時是氮源是碳源的物質(zhì)不可能同時是氮源 B.B.凡碳源都提供能量凡碳源都提供能量C.C.除水以外的無機物只提供無機鹽除水以外的無機物只提供無機鹽 D.D.無機氮源也能提供能量無機氮源也能提供能量 解析：解析：不同的微生物，所需營養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要不同的微生物，所需營養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對微生物的具體情況分析。對于針對微生物的具體情況分析。對于A A、B B選項，它的表達是選項，它的表達是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時是氮源，如同時是氮源，如NH4HCO3NH4HCO3；有的碳源同時是能源，如葡；有的碳源同時是能源，如葡萄糖；有的碳源同時是氮源，也是能源，如蛋白胨。對于萄糖；有的碳源同時是氮源，也是能源，如蛋白胨。對于C C選項，除水以外的無機物種類繁多，功能也多樣。如二氧化選項，除水以外的無機物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHCO3NaHCO3，可作為自養(yǎng)，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無機鹽；而型微生物的碳源和無機鹽；而NaClNaCl則只能提供無機鹽。對則只能提供無機鹽。對于于D D選項，無機氮源提供能量的情況還是存在的，如選項，無機氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3NH3可可為硝化細菌提供能量和氮源。為硝化細菌提供能量和氮源。答案：答案：D例例2 2下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解下面對發(fā)酵工程中滅菌的理解的是的是A.A.防止雜菌污染防止雜菌污染 B.B.消滅雜菌消滅雜菌C.C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌 D.D.滅菌必須在接種前滅菌必須在接種前答案：答案：B 解析：滅菌是微生物發(fā)酵過程的一個重要環(huán)節(jié)。解析：滅菌是微生物發(fā)酵過程的一個重要環(huán)節(jié)。A A說的是滅菌的目的，因為發(fā)酵所用的菌種大多是單一說的是滅菌的目的，因為發(fā)酵所用的菌種大多是單一的純種，整個發(fā)酵過程不能混入其他微生物（雜菌），的純種，整個發(fā)酵過程不能混入其他微生物（雜菌），所以是所以是A A正確的；正確的；B B是錯誤的，因為滅菌的目的是防止是錯誤的，因為滅菌的目的是防止雜菌污染，但實際操作中不可能只消滅雜菌，而是消雜菌污染，但實際操作中不可能只消滅雜菌，而是消滅全部微生物。滅全部微生物。C C是正確的，因為與發(fā)酵有關(guān)的所有設(shè)是正確的，因為與發(fā)酵有關(guān)的所有設(shè)備和物質(zhì)都要滅菌；發(fā)酵所用的微生物是滅菌后專門備和物質(zhì)都要滅菌；發(fā)酵所用的微生物是滅菌后專門接種的，滅菌必須在接種前，如果接種后再滅菌就會接種的，滅菌必須在接種前，如果接種后再滅菌就會把所接菌種也殺死。把所接菌種也殺死。編號編號成分成分含量含量粉狀硫粉狀硫10g10g（NHNH4 4）2 2SOSO4 40.4g0.4gK K2 2HPOHPO4 44.0g4.0gMgSOMgSO4 49.25g9.25gFeSOFeSO4 40.5g0.5gCaClCaCl2 20.5g0.5gHH2 2OO100ml100ml例例3 3右表是某微生物右表是某微生物培養(yǎng)基成分，請據(jù)此回答：培養(yǎng)基成分，請據(jù)此回答：（1 1）右表培養(yǎng)基可培）右表培養(yǎng)基可培養(yǎng)的微生物類型養(yǎng)的微生物類型是是 。（2 2）若不慎將過量）若不慎將過量NaClNaCl加入培養(yǎng)基中。加入培養(yǎng)基中。如不想浪費此培養(yǎng)基，如不想浪費此培養(yǎng)基，可再加入可再加入 . .自養(yǎng)型微生物自養(yǎng)型微生物 含碳有機物含碳有機物 （3 3）若除去成分，加入（）若除去成分，加入（CH2OCH2O），該培），該培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)養(yǎng)基可用于培養(yǎng) 。（4 4）表中營養(yǎng)成分共有）表中營養(yǎng)成分共有 類。類。（5 5）不論何種培養(yǎng)基，在各種成分都溶化后）不論何種培養(yǎng)基，在各種成分都溶化后分裝前，要進行的是分裝前，要進行的是 。（6 6）右表中各成分重量確定的原則）右表中各成分重量確定的原則是是 。（7 7）若右表培養(yǎng)基用于菌種鑒定，應(yīng)該增加）若右表培養(yǎng)基用于菌種鑒定，應(yīng)該增加的成分是的成分是 。固氮微生物固氮微生物 3 調(diào)整調(diào)整pHpH 依微生物的生長需要確定依微生物的生長需要確定 瓊脂（或凝固劑）瓊脂（或凝固劑）