專題專題5DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)和蛋白質(zhì)技術(shù) 課題課題3血紅蛋白的提取和分血紅蛋白的提取和分離離 欄目鏈接欄目鏈接 欄目鏈接欄目鏈接蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)不可缺少的物質(zhì)。隨著人類基蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)不可缺少的物質(zhì)。隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)展以及多種生物基因組測(cè)序工作的完成，因組計(jì)劃的進(jìn)展以及多種生物基因組測(cè)序工作的完成，人類跨入了后基因組和蛋白質(zhì)組時(shí)代。對(duì)蛋白質(zhì)的研究人類跨入了后基因組和蛋白質(zhì)組時(shí)代。對(duì)蛋白質(zhì)的研究與應(yīng)用，首先需要獲得純度較高的蛋白質(zhì)。因此，從復(fù)與應(yīng)用，首先需要獲得純度較高的蛋白質(zhì)。因此，從復(fù)雜的細(xì)胞混合物中提取、分離高純度的蛋白質(zhì)是生物科雜的細(xì)胞混合物中提取、分離高純度的蛋白質(zhì)是生物科學(xué)研究中經(jīng)常要做的工作學(xué)研究中經(jīng)常要做的工作 欄目鏈接欄目鏈接請(qǐng)思考：請(qǐng)思考：1怎樣從血細(xì)胞中提取血紅蛋白呢？怎樣從血細(xì)胞中提取血紅蛋白呢？2用豬血和雞血提取血紅蛋白，效果一樣嗎？用豬血和雞血提取血紅蛋白，效果一樣嗎？ 欄目鏈接欄目鏈接 欄目鏈接欄目鏈接1概念概念 _是根據(jù)是根據(jù)_分離蛋白分離蛋白質(zhì)的有效方法，也稱作分配色譜法質(zhì)的有效方法，也稱作分配色譜法。一、凝膠色譜法一、凝膠色譜法血紅蛋白的分離方法血紅蛋白的分離方法 凝膠色譜法凝膠色譜法 相對(duì)分子質(zhì)量的大小相對(duì)分子質(zhì)量的大小 多孔球體多孔球體 多糖類化合物多糖類化合物 貫穿的通道貫穿的通道 欄目鏈接欄目鏈接(2)分離原理：分離原理： 相 對(duì) 分 子 質(zhì) 量 較 小 的 蛋 白 質(zhì) ： 容 易 進(jìn) 入相 對(duì) 分 子 質(zhì) 量 較 小 的 蛋 白 質(zhì) ： 容 易 進(jìn) 入_的通道，路程的通道，路程_，移動(dòng)速度較慢，通過(guò)，移動(dòng)速度較慢，通過(guò)凝膠柱的時(shí)間凝膠柱的時(shí)間_。 相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)：無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)：無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程部的通道，只能在凝膠外部移動(dòng)，路程_，移動(dòng)，移動(dòng)速度較快，通過(guò)凝膠柱的時(shí)間速度較快，通過(guò)凝膠柱的時(shí)間_。 凝膠內(nèi)部凝膠內(nèi)部 較長(zhǎng)較長(zhǎng) 較長(zhǎng)較長(zhǎng) 較短較短 較短較短 欄目鏈接欄目鏈接二、緩沖溶液二、緩沖溶液1作用作用 在 一 定 范 圍 內(nèi) ， 緩 沖 溶 液 能 夠 抵 制在 一 定 范 圍 內(nèi) ， 緩 沖 溶 液 能 夠 抵 制_對(duì)溶液對(duì)溶液pH的影響，維持的影響，維持pH基本不變?；静蛔?。2配制配制 通常由通常由12種緩沖劑溶解于水中配制而成，調(diào)節(jié)種緩沖劑溶解于水中配制而成，調(diào)節(jié)緩沖劑的緩沖劑的_就可以制得在就可以制得在_的緩沖液。的緩沖液。 外界的酸和堿外界的酸和堿 使用比例使用比例 不同不同pH范圍內(nèi)使用范圍內(nèi)使用 欄目鏈接欄目鏈接三、電泳三、電泳血紅蛋白的分離或鑒定方法血紅蛋白的分離或鑒定方法1概念概念 帶電粒子在帶電粒子在_的作用下發(fā)生的作用下發(fā)生_的過(guò)的過(guò)程程。2原理原理 (1)許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有有_，在一定的，在一定的pH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上下，這些基團(tuán)會(huì)帶上_或或_。 電場(chǎng)電場(chǎng) 遷移遷移 可解離的基團(tuán)可解離的基團(tuán)正電正電 負(fù)電負(fù)電 欄目鏈接欄目鏈接( 2 ) 在 電 場(chǎng) 的 作 用 下 ， 這 些 帶 電 分 子 會(huì) 向 著在 電 場(chǎng) 的 作 用 下 ， 這 些 帶 電 分 子 會(huì) 向 著_移動(dòng)。移動(dòng)。 ( 3 ) 電 泳 利 用 了 待 分 離 樣 品 中 各 種 分 子電 泳 利 用 了 待 分 離 樣 品 中 各 種 分 子_以及分子本身的以及分子本身的_、_的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的_，從而實(shí)現(xiàn)，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。樣品中各種分子的分離。 與其所帶電荷相反的電極與其所帶電荷相反的電極 帶電性質(zhì)的差異帶電性質(zhì)的差異 大小大小 形狀形狀 遷移速度遷移速度 欄目鏈接欄目鏈接四、蛋白質(zhì)的提取和分離過(guò)程四、蛋白質(zhì)的提取和分離過(guò)程蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：_、粗分離、粗分離、_和純度鑒定。和純度鑒定。樣品處理樣品處理 純化純化 欄目鏈接欄目鏈接 欄目鏈接欄目鏈接一、血紅蛋白的提取和分離的原理一、血紅蛋白的提取和分離的原理1蛋白質(zhì)分子在凝膠中的運(yùn)動(dòng)情況分析蛋白質(zhì)分子在凝膠中的運(yùn)動(dòng)情況分析相對(duì)分子質(zhì)量大相對(duì)分子質(zhì)量大相對(duì)分子質(zhì)量小相對(duì)分子質(zhì)量小直徑大小直徑大小大于凝膠顆?？障洞笥谀z顆?？障吨睆街睆叫∮谀z顆?？障缎∮谀z顆?？障吨睆街睆竭\(yùn)動(dòng)方式運(yùn)動(dòng)方式垂直向下運(yùn)動(dòng)垂直向下運(yùn)動(dòng)無(wú)規(guī)則的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)無(wú)規(guī)則的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)速度運(yùn)動(dòng)速度較快較快較慢較慢運(yùn)動(dòng)路程運(yùn)動(dòng)路程較短較短較長(zhǎng)較長(zhǎng)洗脫順序洗脫順序先從凝膠柱中洗脫先從凝膠柱中洗脫出來(lái)出來(lái)后從凝膠柱中洗脫后從凝膠柱中洗脫出來(lái)出來(lái) 欄目鏈接欄目鏈接2.電泳原理及方法電泳原理及方法電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。許多重要的分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷程。許多重要的分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可解離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的酸、核酸等都具有可解離基團(tuán)，它們?cè)谀硞€(gè)特定的pH中會(huì)帶上正電或負(fù)電；在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子中會(huì)帶上正電或負(fù)電；在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性是在電場(chǎng)的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的?；蛱峒兊哪康摹?欄目鏈接欄目鏈接瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳由于瓊脂糖本身不帶電荷，由于瓊脂糖本身不帶電荷，各種分子在電場(chǎng)中遷移速各種分子在電場(chǎng)中遷移速度決定于所帶電荷性質(zhì)的度決定于所帶電荷性質(zhì)的差異及分子的大小、形狀差異及分子的大小、形狀的不同的不同在凝膠中加入在凝膠中加入SDS，使蛋，使蛋白質(zhì)解聚成單鏈，與各種白質(zhì)解聚成單鏈，與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，使其遷移速度完復(fù)合物，使其遷移速度完全取決于分子的大小全取決于分子的大小 欄目鏈接欄目鏈接例例1關(guān)于電泳的說(shuō)法不正確的是關(guān)于電泳的說(shuō)法不正確的是()A電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程的過(guò)程B帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)動(dòng)C蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少它所帶凈電荷的多少D用用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白質(zhì)的電聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于分子的大小泳遷移率完全取決于分子的大小 欄目鏈接欄目鏈接解析：解析：蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素。SDS能能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物，復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差異，使電泳遷移率完全取決了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差異，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。于分子的大小。答案：答案：C 欄目鏈接欄目鏈接變式變式訓(xùn)練訓(xùn)練1凝膠色譜法是分離蛋白質(zhì)分子的一種常用方法。凝膠色譜法是分離蛋白質(zhì)分子的一種常用方法。但并非所有的蛋白質(zhì)都可用此方法進(jìn)行分離。能分離但并非所有的蛋白質(zhì)都可用此方法進(jìn)行分離。能分離的蛋白質(zhì)分子之間必須的蛋白質(zhì)分子之間必須()A具有相同的相對(duì)分子質(zhì)量具有相同的相對(duì)分子質(zhì)量B相對(duì)分子質(zhì)量不同，但都是相對(duì)分子量較大相對(duì)分子質(zhì)量不同，但都是相對(duì)分子量較大的分子的分子C相對(duì)分子質(zhì)量不同，但都是相對(duì)分子質(zhì)量較相對(duì)分子質(zhì)量不同，但都是相對(duì)分子質(zhì)量較小的分子小的分子D具有相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)具有相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì) 欄目鏈接欄目鏈接變式變式訓(xùn)練訓(xùn)練解析：解析：若在每種凝膠分離范圍之外的分子，在不若在每種凝膠分離范圍之外的分子，在不改變凝膠種類的情況下是很難分離的。對(duì)于分子大小改變凝膠種類的情況下是很難分離的。對(duì)于分子大小不同，但同屬于凝膠分離范圍內(nèi)的各種分子，在凝膠不同，但同屬于凝膠分離范圍內(nèi)的各種分子，在凝膠床中的分布情況是不同的：分子較大的只能進(jìn)入孔徑床中的分布情況是不同的：分子較大的只能進(jìn)入孔徑較大的那一部分凝膠孔隙內(nèi)，而分子較小的可進(jìn)入較較大的那一部分凝膠孔隙內(nèi)，而分子較小的可進(jìn)入較多的凝膠顆粒內(nèi)，這樣分子較大的在凝捍材諞貧多的凝膠顆粒內(nèi)，這樣分子較大的在凝捍材諞貧嗬嗬虢隙蹋虢隙蹋腫詠閑腫詠閑囊貧囊貧嗬虢銑謔欠腫詠洗蟮南嗬虢銑謔欠腫詠洗蟮南韌韌床而分子較小的后通過(guò)凝膠床，這樣就利用分床而分子較小的后通過(guò)凝膠床，這樣就利用分子篩可將分子量不同的物質(zhì)分離。分子量大小不同的子篩可將分子量不同的物質(zhì)分離。分子量大小不同的多種成分在通過(guò)凝膠床時(shí)，按照分子量大小多種成分在通過(guò)凝膠床時(shí)，按照分子量大小“排隊(duì)排隊(duì)”，凝膠表現(xiàn)出分子篩效應(yīng)。凝膠表現(xiàn)出分子篩效應(yīng)。答案：答案：D 欄目鏈接欄目鏈接二、血紅蛋白的提取和分離的實(shí)驗(yàn)操作二、血紅蛋白的提取和分離的實(shí)驗(yàn)操作1樣品處理樣品處理(1)紅細(xì)胞的洗滌：洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白。紅細(xì)胞的洗滌：洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白。采用低速短時(shí)間離心，吸出上層透明的黃色血漿，再加采用低速短時(shí)間離心，吸出上層透明的黃色血漿，再加入五倍體積的生理鹽水，重復(fù)洗滌三次，直至上清液中入五倍體積的生理鹽水，重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒(méi)有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干沒(méi)有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。洗滌次數(shù)過(guò)少，無(wú)凈。洗滌次數(shù)過(guò)少，無(wú)法去除血漿蛋白；離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞法去除血漿蛋白；離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。和淋巴細(xì)胞一同沉淀，達(dá)不到分離的效果。 欄目鏈接欄目鏈接(2)血紅蛋白的釋放：紅細(xì)胞在蒸餾水和甲苯的作用血紅蛋白的釋放：紅細(xì)胞在蒸餾水和甲苯的作用下破裂，釋放出血紅蛋白。下破裂，釋放出血紅蛋白。(3)分離血紅蛋白溶液：將混合液進(jìn)行離心后，會(huì)明分離血紅蛋白溶液：將混合液進(jìn)行離心后，會(huì)明顯看到試管中的溶液的分層情況：第顯看到試管中的溶液的分層情況：第3層的紅色透明液層的紅色透明液體是血紅蛋白的水溶液。體是血紅蛋白的水溶液。(4)透析：目的是除去樣品中的相對(duì)分子質(zhì)量較小的透析：目的是除去樣品中的相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。雜質(zhì)。 欄目鏈接欄目鏈接2凝膠色譜操作凝膠色譜操作(1)凝膠色譜柱的裝填：凝膠色譜柱的裝填：裝填前，凝膠用蒸餾水或者洗脫液充分溶脹。裝填前，凝膠用蒸餾水或者洗脫液充分溶脹。凝膠裝填要均勻，色譜柱內(nèi)不能有氣泡，一旦發(fā)凝膠裝填要均勻，色譜柱內(nèi)不能有氣泡，一旦發(fā)現(xiàn)存在氣泡，必須重裝?，F(xiàn)存在氣泡，必須重裝。裝填完后，立即用裝填完后，立即用300 mL 20 mmol/L磷酸緩沖液磷酸緩沖液充分洗滌平衡凝膠，使凝膠裝填緊密。充分洗滌平衡凝膠，使凝膠裝填緊密。 欄目鏈接欄目鏈接(2)樣品的加入和洗脫：樣品的加入和洗脫：加樣前，打開(kāi)色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠加樣前，打開(kāi)色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口面上的緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。按正確方法加樣，不能破壞凝膠面按正確方法加樣，不能破壞凝膠面。進(jìn)行洗脫時(shí)，等紅色蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，進(jìn)行洗脫時(shí)，等紅色蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，采用試管收集采用試管收集。 欄目鏈接欄目鏈接例例2 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法中加入聚丙烯酰胺凝膠電泳法中加入SDS的作用的作用是是()A增大蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量增大蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量B改變蛋白質(zhì)分子的形狀改變蛋白質(zhì)分子的形狀C掩蓋不同蛋白質(zhì)分子間的電荷差別掩蓋不同蛋白質(zhì)分子間的電荷差別D減少蛋白質(zhì)分子的相對(duì)分子質(zhì)量減少蛋白質(zhì)分子的相對(duì)分子質(zhì)量 欄目鏈接欄目鏈接解析：解析：SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。在樣品和凝膠中加入破壞蛋白質(zhì)分子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。在樣品和凝膠中加入還原劑還原劑SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白結(jié)合成蛋白SDS復(fù)合物，復(fù)合物，SDS所帶負(fù)電荷所帶負(fù)電荷的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，這樣就消除的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異，使電泳遷移率完全取決于分了不同分子間的電荷差異，使電泳遷移率完全取決于分子的大小。子的大小。答案：答案：C 欄目鏈接欄目鏈接2下列對(duì)凝膠電泳的相關(guān)認(rèn)識(shí)，錯(cuò)誤的是下列對(duì)凝膠電泳的相關(guān)認(rèn)識(shí)，錯(cuò)誤的是()A蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率只取蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率只取決于分子的大小決于分子的大小B蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率完全取決于分子的大小率完全取決于分子的大小CSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳不僅用于蛋白質(zhì)相聚丙烯酰胺凝膠電泳不僅用于蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定，還可用于蛋白質(zhì)混合組分的分離對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定，還可用于蛋白質(zhì)混合組分的分離D凝膠中加入凝膠中加入SDS可以消除凈電荷對(duì)遷移率的影可以消除凈電荷對(duì)遷移率的影響響變變 式式訓(xùn)訓(xùn) 練練 欄目鏈接欄目鏈接解析：解析：電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下，利用待分離電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，而性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，而SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，是根據(jù)大多數(shù)蛋白質(zhì)都能與陽(yáng)離子表面活性劑十量，是根據(jù)大多數(shù)蛋白質(zhì)都能與陽(yáng)離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉二烷基硫酸鈉(SDS)按重量比結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)按重量比結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)分子所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)天然分子所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)天然變變 式式訓(xùn)訓(xùn) 練練 欄目鏈接欄目鏈接蛋白質(zhì)分子的負(fù)電荷，消除了不同蛋白質(zhì)分子的電荷蛋白質(zhì)分子的負(fù)電荷，消除了不同蛋白質(zhì)分子的電荷效應(yīng)，使蛋白質(zhì)分子相對(duì)遷移率的大小完全取決于相效應(yīng)，使蛋白質(zhì)分子相對(duì)遷移率的大小完全取決于相對(duì)分子質(zhì)量的高低。對(duì)分子質(zhì)量的高低。答案：答案：A變變 式式訓(xùn)訓(xùn) 練練 欄目鏈接欄目鏈接