變性梯度凝膠電泳 從實(shí)驗(yàn)到分析 2011年9月X日 變性梯度凝膠電泳 denaturedgradientgelelectrophoresis DGGE 最初是Lerman等人于20世紀(jì)80年代初期發(fā)明的 起初主要用來(lái)檢測(cè)DNA片段中的點(diǎn)突變 Muyzer等人在1993年首次將其應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究 后來(lái)又發(fā)展出其衍生技術(shù) 溫度梯度凝膠電泳 temperaturegradientgelelectrophoresis TGGE 此后十年間 該技術(shù)被廣泛用于微生物分子生態(tài)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域 目前已經(jīng)發(fā)展成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要分子生物學(xué)方法之一 變性梯度凝膠電泳 DGGE 變性梯度凝膠電泳 DGGE 一種分離相似大小DNA片段的電泳方法 即雙鏈DNA在變性劑 如尿素或甲酰胺 濃度或溫度梯度增高的凝膠中電泳 隨變性劑濃度升高 由于Tm值不同 DNA的某些區(qū)域解鏈 降低其電泳泳動(dòng)性 導(dǎo)致遷移率下降 從而達(dá)到分離不同片段的目的 由于各類微生物 如細(xì)菌和古細(xì)菌 的16sRNA基因序列中可變區(qū)的堿基順序有很大的差異 其中不同土壤微生物的16sRNA基因的V3區(qū)擴(kuò)增的DNA片斷在DGGE中的應(yīng)用最為廣泛 根據(jù)電泳條帶的多寡和條帶的位置可以初步辨別出樣品中微生物的種類多少 粗略分析土壤樣品中微生物的多樣性 變性梯度凝膠電泳 DGGE 環(huán)境樣品基因組DNA的提取 目標(biāo)片段的PCR擴(kuò)增 DGGE圖譜的分析 圖像的采集和條帶的回收 DGGE分析 電泳前準(zhǔn)備工作 電泳分析 剝膠 染色 DGGE條帶測(cè)序 DGGE分析微生物群落的主要步驟 總DNA的提取是DGGE研究微生物群落的基礎(chǔ) 適合的DNA提取方法對(duì)環(huán)境樣品微生物群落結(jié)構(gòu)分析非常重要 適合DNA提取方法的考量 DNA的得率 能否進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及擴(kuò)增的重復(fù)性 制備DNA花費(fèi)時(shí)間的長(zhǎng)短 關(guān)于DNA提取的建議 優(yōu)先考慮基于原位裂解的方法 根據(jù)實(shí)際情況采用酶解 酚氯仿抽提法 或者DNA提取試劑盒 建議購(gòu)買Qiagen公司相關(guān)產(chǎn)品 環(huán)境樣品基因組DNA的提取 選擇適合的目標(biāo)片段 設(shè)計(jì)合適的引物 注意有GC夾子情況下引物二聚體的行程 環(huán)境樣品目標(biāo)片段的擴(kuò)增最好采用TouchdownPCR 注意PCR的環(huán)境 V3區(qū)產(chǎn)物擴(kuò)增極易污染 目標(biāo)片段的PCR擴(kuò)增 細(xì)節(jié)決定成敗 DGGE分析 從這一步開(kāi)始 帶上手套 配置試劑時(shí)一定要用去離子水 可以配置不同梯度的變性溶液備用 注意變形溶液中大顆粒的過(guò)濾及脫氣 制膠洗膜時(shí)用的各個(gè)容器要用去離子水洗滌干凈 以防止氯離子污染 灌膠前準(zhǔn)備好所有需要的東西 試劑 槍頭 甚至物品擺放的位置 制膠是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵 在往玻璃板中灌膠時(shí)要?jiǎng)蛩俚剞D(zhuǎn)動(dòng)滑輪 將凝膠液勻速地灌入玻璃板 灌膠后立刻清洗注射器 以防丙烯酰胺凝固 堵塞管子 DGGE前的準(zhǔn)備工作 DGGE制膠主體部件 上樣的膠孔要用去離子水沖洗干凈并吸干 PAGE膠裝入電泳支架時(shí)注意用去離子水潤(rùn)滑橡膠墊 裝入后在膠孔中加入緩沖液 上樣時(shí)上樣器要深入膠孔底部 盡量在同一個(gè)膠上比較所有樣品 每一個(gè)膠上要有markerlane 將膠放入電泳槽中時(shí)注意正負(fù)極 建議低電壓電泳一段時(shí)間 在樣品完全進(jìn)入膠中之后再升電壓 電泳 停止電泳后注意把電泳儀調(diào)零之后在關(guān)閉電源剝膠需要細(xì)致 用好去離子水和保鮮膜 染色前做好膠樣品順序的標(biāo)記 銀染 EB染色和SYBRGreen染色 剝膠與染色 垂直電泳 凝膠變性梯度的確定 關(guān)于PCR產(chǎn)物的純化和定量 關(guān)于DGGEmarker的制作 獲得高質(zhì)量的DGGE圖譜 DGGE條帶的回收 注意紫外條件下操作的安全 盡量減少DNA在紫外下的照射時(shí)間 不同長(zhǎng)度目標(biāo)片段從切膠條帶中的回收 測(cè)序注意要點(diǎn) 回收條帶的DNA在PCR擴(kuò)增后 一定要克隆 確認(rèn)克隆與母條帶可以跑到同一個(gè)位置后 再送去測(cè)序 每個(gè)條帶至少測(cè)3個(gè)克隆 圖像的采集和條帶的回收 DGGE圖譜的聚類分析 相似性分析 DGGE圖譜的分析 DGGE圖譜的主成分分析 DGGE圖譜的數(shù)字化 Quantityone DGGE圖譜的數(shù)字化后的主成分分析 用QuantityOne Bio Rad USA 軟件對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行數(shù)字化處理 按照如下公式計(jì)算多樣性指數(shù) Shannon Wienerindex 其中 s代表每泳道中的條帶數(shù)量 Pi為泳道中第i條帶灰度 heightofthepeak 占該泳道總灰度的比例 菌群均勻度 evenness E E H H max H max lnS 多樣性指數(shù)的計(jì)算 Quantityone的應(yīng)用問(wèn)題和討論