0.1 mol/L CaCl2 （滅菌）、無菌水、冰、LB液體培養(yǎng)基（胰蛋白胨、酵母粉）、氨芐青霉素（Amp）、溫控?fù)u床。 四、儀器耗材. 控溫?fù)u床(37)、冷凍離心機(jī)、水浴鍋、 .*生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容一、 質(zhì)粒DNA的提取二、 質(zhì)粒DNA的檢測三、 DNA重組技術(shù)酶切、連接四、 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化五、 重組質(zhì)粒的篩選實(shí)驗(yàn)一、質(zhì)粒DNA的提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)和掌握堿裂解法提取質(zhì)粒。二、實(shí)驗(yàn)原理堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們。在pH值介于12.012.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互纏繞，仍會緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH 至中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開，復(fù)性就不會那木迅速而準(zhǔn)確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。三、主要試劑1 溶液50 mmol/L 葡萄糖5 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷（Tris）Tris.HCl(pH 8.0) 10 mmol/L 乙二胺四乙酸Na（EDTA）（pH 8.0）0.5 M EDTA：93.05g EDTA.Na2，8g NaOH，充分溶解后調(diào)pH值至8.0 （滅菌）。1M Tris-HCl（1000 mL）：121.1g Tris，49 mL濃HCl，充分溶解后調(diào)pH值至8.0（滅菌）2 溶液 0.4 mol/L NaOH， 2% SDS，用前等體積混合（新鮮配制）3 溶液 5 mol/L 乙酸鉀 60 ml冰乙酸 11.5 ml水 28.5 ml4. TE 緩沖液10 mmol/L Tris.HCl1 mmol/L EDTA(pH 8.0)5. 70%乙醇（放-20冰箱中，用后即放回）6. RNase將RNA酶溶于10 mmol/L Tris.HCl(pH7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成10 mgml的濃度，于100加熱15min，緩慢冷卻至室溫，保存于20。7. LB+Amp100培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基內(nèi)加入100ug/mL的氨芐青霉素。注意Amp遇高溫分解，待培養(yǎng)基溫度低于60時(shí)加入。四、儀器耗材恒溫?fù)u床、冷凍離心機(jī)、移液槍一套、制冰機(jī)、三角瓶、Eppendorf管、試管、培養(yǎng)皿、試劑瓶、超凈工作臺。五、實(shí)驗(yàn)步驟 （一）細(xì)菌的培養(yǎng) 將含有pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌，在LB+Amp100培養(yǎng)基平皿上劃線，獲得單菌落。（37培養(yǎng)過夜）(二) 質(zhì)粒提取1. 將2 mL含Amp（100ug/mL）的LB液體培養(yǎng)基加入試管中，接入上述的含pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌（單菌落），37振蕩培養(yǎng)過夜。2. 取培養(yǎng)物倒入1.5 mL微量離心管中，4000 r/min 離心2 min。3. 倒出培養(yǎng)液，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥。4. 將細(xì)菌沉淀懸浮于100 uL溶液中，充分振蕩混勻，室溫放置5 min。 5. 加200 uL溶液 （新鮮配制），蓋緊管口，顛倒混勻內(nèi)容物，將離心管放冰上5 min 。6. 加入150 uL溶液 （冰上預(yù)冷），蓋緊管口，顛倒數(shù)次使混勻。冰上放置5 min 。7. 12000 r/min ，離心15 min ，將上清轉(zhuǎn)至另一離心管中。8. 向上清中加入等體積氯仿/異戊醇（24:1）（去蛋白），反復(fù)混勻，10000 r/min，離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。9. 向上清加入2倍體積乙醇，混勻后，室溫放置1520min。12000r/min離心 10 min。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。10. 用500 L 70% 乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，振蕩并離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中干燥。11. 加入適量（30 L）的TE其中含有20 ug/ml的RNA酶，使DNA完全溶解，20保存。實(shí)驗(yàn)二、質(zhì)粒DNA的檢測一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷在電場中向正極移動。由于糖磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以相同的速度向正極方向移動。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣，可進(jìn)行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量對數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可以分離不同相對分子質(zhì)量的DNA， 也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。如上次實(shí)驗(yàn)提取的pUC19質(zhì)粒，有3種構(gòu)型：超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA(covalently closed circular DNA，簡稱 CCCDNA)；開環(huán)質(zhì)粒DNA，即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA 1條鏈斷裂，（open circular DNA， 簡稱OCDNA）；線狀質(zhì)粒DNA ，即共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA 2條鏈發(fā)生斷裂，（linear DNA，簡稱L DNA）。這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質(zhì)粒DNA泳動最快，其次為線狀DNA和開環(huán)質(zhì)粒DNA。 三、主要試劑1. 10 x TAE (10倍體積的TAE儲存液) 配 1000mL50 x TAE： Tris 242g 冰乙酸 57.1ml 0.5 mol/L EDTA 100 ml pH 8.0 2. 凝膠加樣緩沖液（6x）溴酚藍(lán) 0.25蔗糖 40 3. 瓊脂糖（1%）：稱1g瓊脂糖，放入250 mL三角瓶內(nèi)，加入100 mL 1×TAE電泳緩沖液，加熱煮沸等其冷至60左右，倒入封好的電泳板上。 4. 溴化乙錠溶液 (EB) 0.5 g /mL。四、儀器耗材電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀、移液槍一套、微波爐。五、實(shí)驗(yàn)步驟(一) 制備瓊脂糖凝膠按照被分離DNA的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量?？蓞⒄障卤恚涵傊悄z濃度 線狀DNA的有效分離范圍Kb0.3 5 600.6 1 200.7 0.810 0.9 0.571.2 0.4 61.5 0.242.0 0.13稱取0.1g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入10mL 1XTAE緩沖液，至微波爐加熱至完全溶化，取出搖勻，則為1的瓊脂糖凝膠液。 （二）膠板的制備1. 取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干，用橡皮膏將有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好。2. 將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。3. 將冷到60左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）。4. 待膠凝固后，取出梳子，放在電泳槽內(nèi)。5. 加入電泳緩沖液至電泳槽中。 （三）加樣將樣品5uL與上樣緩沖液1uL混合，用移液槍將該混合樣品加入樣品孔（記錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量）。同時(shí)加入DNA marker和購買的pUC18質(zhì)粒作為對照。 （四）電泳1. 接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負(fù)極，DNA片段從負(fù)極向正極移動）。DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5 V/cm。 2. 當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動到距凝膠前沿12cm處，停止電泳。（五）染色將電泳后的凝膠浸入溴化乙錠染色液（0.5mg/mL）中，染色以觀察在瓊脂糖凝膠中的帶（戴手套操作）。(六) 觀察六、注意事項(xiàng)1EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性,配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套,并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。2. " 6 e/ X2 i6 k: Y8 a$ j當(dāng)EB太多，膠染色過深,DNA帶看不清時(shí)，可將膠放入蒸餾水沖泡，30分鐘后再觀察。3電泳時(shí)注意導(dǎo)線正負(fù)極，防止接反。思考題：1. 如果一個(gè)DNA 酶解液在電泳后發(fā)現(xiàn)DNA 未被切動，你認(rèn)為可能是什么原因？2. 瓊脂糖凝膠電泳中DNA 分子遷移率受哪些因素的影響？' |,   e( 5 ) ?1 . w+ q附： 質(zhì)粒提取及檢測的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析1. 質(zhì)粒沉淀離心后，在管底能見到少量白色物質(zhì)。2. 真空干燥后，無色，貼于管壁。3. 加ddH2O或TE能迅速溶解。4. 電泳凝膠上呈現(xiàn)一條亮帶。5. 如果質(zhì)粒提取中降解，則會出現(xiàn)上下三條帶，分別代表超螺旋、帶切口和帶切刻的質(zhì)粒。6. 溶解時(shí)不加RNase，則下部會有很亮的一片，為小分子RNA片段。7. 質(zhì)粒中含太多雜質(zhì)，則干燥后會呈白色或褐色，不易溶解。8. 電泳時(shí)，吸取可溶的部分，勿取沉淀。實(shí)驗(yàn)三、DNA重組技術(shù)酶切、連接（一）酶切一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^酶切獲得可進(jìn)行體外重組的載體和外源DNA。二、實(shí)驗(yàn)原理DNA重組技術(shù)是用內(nèi)切酶分別將載體和外源DNA切開，經(jīng)分離純化后，用鏈接酶將其連接，構(gòu)成新的DNA分子。限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。它可分為三類:類和類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。類酶結(jié)合于識別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而類酶在識別位點(diǎn)上切割DNA分子，然后從底物上解離。類由兩種酶組成: 一種為限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)，它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨(dú)立的甲基化酶，它修飾同一識別序列。類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)類限制酶識別長度為4至6個(gè)核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoR識別六個(gè)核苷酸序列:5'- GAATTC-3')，有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列。類酶切割位點(diǎn)在識別序列中，有的在對稱軸處切割，產(chǎn)生平末端的DNA片段(如Sma:5'-CCCGGG-3');有的切割位點(diǎn)在對稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性未端， 如EcoR切割識別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。5'GAATTC3' 5' G AATTC3'3'CTTAAG 5' 3' CTTAA G5'限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)最適條件各不相同，各種酶有其相應(yīng)的酶切緩沖液和最適反應(yīng)溫度(大多數(shù)為37)。對質(zhì)粒DNA酶切反應(yīng)而言， 限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1g DNA加1單位酶，消化1-2小時(shí)。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反應(yīng)時(shí)間也要適當(dāng)延長。酶活力通常用酶單位（U）表示，酶單位的定義是：在最適反應(yīng)條件下，1小時(shí)完全降解1mg DNA的酶量為一個(gè)單位，但是許多實(shí)驗(yàn)制備的DNA不象DNA那樣易于降解，需適當(dāng)增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)。 三、主要試劑 DNA、EcoR I、質(zhì)粒（pUC19）、無菌水、70，100酒精、3Mol/L KAc(pH5.2)、 ice、瓊脂糖、溴酚藍(lán)、TE 、TAE、EB、DNA marker.四、儀器耗材水浴鍋(37)、滅菌鍋、離心機(jī)、電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀、移液槍一套、微波爐。五、酶切反應(yīng) DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。當(dāng)微量的污染物進(jìn)入限制性內(nèi)切酶貯存液中時(shí)，會影響其進(jìn)一步使用，因此在吸取限制性內(nèi)切酶時(shí)，每次都要用新的吸管頭。反應(yīng)體系 1. PUC 4ul (0.5ug/ul) buffer 1ul EcoR1 1ul (15U/ul) H2O 4ul - Total 10ul 反應(yīng)體系 2. DNA 4ul (1.5ug/ul，0.4ug/ul) bf 1ul EcoR1 1ul H2O 4ul - Total 10ul37，2hr；終止反應(yīng) 65 10min。六、注意事項(xiàng)1、 限制性內(nèi)切酶一旦拿出冰箱后應(yīng)當(dāng)立即置于冰上。酶應(yīng)當(dāng)是最后一個(gè)被加入到反應(yīng)體系中（在加入酶之前所有的其它反應(yīng)物都應(yīng)當(dāng)已經(jīng)加好并已預(yù)混合）。2、 10x bf工作濃度為1x，注意混勻。3、 酶切時(shí)所加的DNA溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分會干擾酶反應(yīng)。4、 ) S: + a/ w5 ( N5 F# * a; b3 y酶通常保存在50%的甘油中，實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在1/10之下，否則，酶活性將受影響。5、 1 ' _5 b' # u+ ?7 $ b6 |5 Q8 V/ O, C: s" H7 g: I) d) P如果反應(yīng)較長時(shí)間而酶切體系又很小比如10微升，那么哪怕用PCR小管做反應(yīng)，體積損失也會很大。采用石蠟油覆蓋的方法可避免水分損失甘油濃度提高而引起的星活性。& O; c$   H86、 混合：這是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反應(yīng)完全，必須使反應(yīng)液充分混合。我們推薦用槍反復(fù)吸取混合，或是用手指輕彈管壁混合，然后再快速離心一下即可。注意：不可振蕩。（二）電泳檢測各取2ul酶解液，電泳檢測。EcoRI切割DNA后電泳得到6個(gè)片段，長度分別為 21.2， 7.4， 5.8， 5.6， 4.9 和 2.5kb（三）連接一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?體外連接獲得重組分子，用于轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞。二、實(shí)驗(yàn)原理質(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。如果要克隆較小的DNA片段(10kb)且結(jié)構(gòu)簡單，質(zhì)粒要比其它任何載體都要好。在質(zhì)粒載體上進(jìn)行克隆，從原理上說是很簡單的，先用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA和目的DNA片段， 然后體外使兩者相連接， 再用所得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌，即可完成。但在實(shí)際工作中， 如何區(qū)分插入有外源DNA的重組質(zhì)粒和無插入而自身環(huán)化的載體分子是較為困難的。通過調(diào)整連接反應(yīng)中外源DNA片段和載體DNA的濃度比例，可以將載體的自身環(huán)化限制在一定程度之下，也可以進(jìn)一步采取一些特殊的克隆策略，如載體去磷酸化等來最大限度的降低載體的自身環(huán)化，還可以利用遺傳學(xué)手段如互補(bǔ)現(xiàn)象等來鑒別重組子和非重組子。外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略有以下幾種：1、帶有非互補(bǔ)突出端的片段 用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)的粘性末端，這也是最容易克隆的DNA片段，一般情況下，常用質(zhì)粒載體均帶有多個(gè)不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點(diǎn)，因而幾乎總能找到與外源DNA片段末端匹配的限制酶切位點(diǎn)的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在PCR擴(kuò)增時(shí)，在DNA片段兩端人為加上不同酶切位點(diǎn)以便與載體相連。2、帶有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。 由于質(zhì)粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個(gè)相同粘性末端，因此在連接反應(yīng)中外源片段和質(zhì)粒載體DNA均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個(gè)分子串連形成寡聚物， 而且正反兩種連接方向都可能有。所以，必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中兩種DNA的濃度， 以便使正確的連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到最高水平。還可將載體DNA的5'磷酸基團(tuán)用堿性磷酸酯酶去掉， 最大限度地抑制質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化。帶5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地與去磷酸化的載體相連，產(chǎn)生一個(gè)帶有兩個(gè)缺口的開環(huán)分子，在轉(zhuǎn)入E. coli受體菌后的擴(kuò)增過程中缺口可自動修復(fù)。3、帶有平末端 是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA聚合酶補(bǔ) 平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應(yīng)中，T4 DNA連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)以促進(jìn)DNA分子凝聚成聚集體的物質(zhì)以提高轉(zhuǎn)化效率。特殊情況下，外源DNA分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配，則可以在線狀質(zhì)粒載體末端或外源DNA片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配， 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶的klenow大片段部分填平3'凹端，使不相匹配的末端轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)末端或轉(zhuǎn)為平末端后再進(jìn)行連接。三、 主要試劑 T4 連接酶、無菌水、PUC/DNA（酶切產(chǎn)物）。四、儀器耗材 微量移液槍，Tip、eppendorf管。五、 連接反應(yīng) PUC (酶切產(chǎn)物) 5ul DNA (酶切產(chǎn)物) 5ul T4 ligase 1ul 10x bf 1.5 ulH2O 2.5 ul -Total 15ul六、注意事項(xiàng)進(jìn)行酶連接反應(yīng)時(shí)，注意保持低溫狀態(tài)，因?yàn)長igase酶很容易降解。一般14-16,O/N. 實(shí)驗(yàn)四、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?獲得感受態(tài)細(xì)胞；制備含有目的片段的克隆。二、實(shí)驗(yàn)原理在自然條件下，很多質(zhì)粒都可通過細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi)，但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中，一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因，因此不能自行完成從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R，M)，它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化學(xué)試劑法)的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Compenent cells)。進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制，表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant，即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞)。目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高，但CaCl2 法簡便易行，且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求，制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)，可加入占總體積15的無菌甘油于-70保存(半年)，因此CaCl2法使用更廣泛。轉(zhuǎn)化率的計(jì)算：統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。轉(zhuǎn)化后在抗生素的平板上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計(jì)算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下：轉(zhuǎn)化子總數(shù)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積/涂板菌液體積轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子數(shù)/每ug質(zhì)粒DNA）=轉(zhuǎn)化子總數(shù)/質(zhì)粒DNA加入量（ug）感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)=對照組2菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×菌液總體積/涂板菌液體積感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率=轉(zhuǎn)化子總數(shù)/感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)為了提高轉(zhuǎn)化效率， 實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素：1. 細(xì)胞生長狀態(tài)和密度: 不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于的培養(yǎng)菌，最好從70或-20甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600 來控制。DH-5菌株的OD600 為0.5時(shí)，細(xì)胞密度在5×107 個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同)，這時(shí)比較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí)，轉(zhuǎn)化效率就會降低。1ng的cccDNA即可使50l 的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5。3. 試劑的質(zhì)量: 所用的試劑，如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.)，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。4. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行， 所用器皿， 如離心管，tip頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染， 否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入，為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。本實(shí)驗(yàn)以E.coli TOP10菌株為受體細(xì)胞，并用CaCl2處理，使其處于感受態(tài)，然后與pUC質(zhì)粒共保溫，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。由于pUC質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr)，可通過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pUC，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長。能在Amp培養(yǎng)基上生長的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）已導(dǎo)入了pUC。三、主要試劑0.1 mol/L CaCl2 （滅菌）、無菌水、冰、LB液體培養(yǎng)基（胰蛋白胨、酵母粉）、氨芐青霉素（Amp）、溫控?fù)u床。四、儀器耗材控溫?fù)u床(37)、冷凍離心機(jī)、水浴鍋、冰箱（-20，70）、超凈工作臺 培養(yǎng)箱(37)、分光光度計(jì)、液器、槍頭、離心管、三角瓶、6cm平皿、酒精燈 三角玻棒、酒精棉球、火柴五、實(shí)驗(yàn)步驟 實(shí)驗(yàn)材料：E.coli.（TOP10）、重組質(zhì)粒第一天： 從大腸桿菌TOP10平板上挑取一個(gè)單菌落接于2 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，37振蕩培養(yǎng)過夜。 第二天：1. 取0.5 mL菌液轉(zhuǎn)接到一個(gè)含有50 mL LB液體培養(yǎng)基錐形瓶中，37振蕩培養(yǎng)。23 h(此時(shí)，OD600 0.4-0.5，細(xì)胞數(shù)務(wù)必 108mL。（此為實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵)2. 將菌液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，冰上放置10 min。3. 離心10 min（4000r/min），回收細(xì)胞。44. 倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以便培養(yǎng)液流盡。5. 用冰冷的0.1 mol/L CaCl2 0.5 mL懸浮沉淀，立即放在冰上30 min。6. 4 6000 r/min，離心10 min，回收細(xì)胞。7. 用冰冷的0.1mol/L CaCl2 0.1 mL懸浮細(xì)胞，（務(wù)必放在冰上）。8. 分裝細(xì)胞，每1200 L一份。此細(xì)胞為感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化：9. 取100 L新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞，加入DNA（重組質(zhì)粒）10 L（50 ng ）混勻冰上放置30 min。10. 將管放到42循環(huán)水浴90sec。11. 冰浴2 min。12. 每管加600 L LB液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)1 h（慢搖）。13. 將適當(dāng)體積（200 L）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，涂在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)皿中。（20uLxgal,4uLIPTG）14. 倒置平皿37培養(yǎng)1216 h，出現(xiàn)菌落。15.計(jì)算轉(zhuǎn)化效率六、注意事項(xiàng) 1. 無菌操作。 2. 低溫操作。3注意加AMP時(shí)的溫度，溫度不能過高（55-60度），否則加入的抗生素失活，會使克隆株無法篩選出來。思考題：1. 制備感受態(tài)細(xì)胞的原理是什么？2. 如果實(shí)驗(yàn)中對照組本不該長出菌落的平板長出了菌落，分析原因？實(shí)驗(yàn)五、重組質(zhì)粒的篩選一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過篩選，獲得含目的片斷的重組克隆。二、實(shí)驗(yàn)原理 藍(lán)白斑篩選的原理:是重組子篩選的一種方法，根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如-互補(bǔ)、抗生素基因等?，F(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為-互補(bǔ)。由-互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識別。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無-互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。如用藍(lán)白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后，有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。 由于pUC質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr)，可通過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pUC，則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長。能在Amp培養(yǎng)基上生長的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了pUC。轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出，進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定。 三、主要試劑IPTG、X-Gal四、儀器耗材超凈工作臺、培養(yǎng)箱、平皿、移液器、tip。五、實(shí)驗(yàn)步驟    挑取白色菌落，移植于2mL的LB中，37培養(yǎng)12小時(shí)。以快速堿法抽提質(zhì)粒(方法同實(shí)驗(yàn)一)，同時(shí)以提取的質(zhì)粒作對照，用酶切（EcoRI）,電泳檢測。六、注意事項(xiàng)在含有IPTG和X-Gal的篩選培養(yǎng)基上，攜帶載體DNA的轉(zhuǎn)化子為藍(lán)色菌落，而攜帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落，平板如在培養(yǎng)后放于冰箱3-4小時(shí)可使顯色反應(yīng)充分，藍(lán)色菌落明顯。 思考題：1. 用質(zhì)粒載體進(jìn)行外源DNA 片段克隆時(shí)主要應(yīng)考慮哪些因素？2. 利用-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選帶有插入片段的重組克隆的原理是什么？13