單元整合提升單元整合提升 1.限制酶選擇時(shí)的兩種特例(1)限制酶具有特異性，一般情況下，不同限制酶切割形成的黏性末端不同。但也有不同限制酶處理后形成的黏性末端相同，可以用DNA連接酶進(jìn)行連接。如GGATCC和GATC，識(shí)別的序列不同，但處理后形成的黏性末端相同。(2)一般情況下，用同一種限制酶分別處理質(zhì)粒和目的基因，使其具有相同的黏性末端。但如果都用相同的兩種限制酶分別處理，也可形成分別對(duì)應(yīng)的相同黏性末端，例如目的基因的兩端分別有BamH 和Hind的酶切位點(diǎn)，質(zhì)粒上也有這兩種酶的切點(diǎn)。如圖所示：學(xué)法指導(dǎo)學(xué)法指導(dǎo)構(gòu)構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)限制酶的選擇方法建基因表達(dá)載體時(shí)限制酶的選擇方法 2.限制酶選擇的注意事項(xiàng)(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點(diǎn)確定限制酶的種類應(yīng)選擇切點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇Pst。 不能選擇切點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇Sma。 為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用兩種不同的限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用Pst 和EcoR 兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種限制酶的切點(diǎn))。(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致，以確保具有相同的黏性末端。插入的目的基因的表達(dá)需要調(diào)控序列，用作載體的質(zhì)粒的插入基因部位之前需有啟動(dòng)子，之后需有終止子，所以所選限制酶的切點(diǎn)應(yīng)該“前有啟動(dòng)子，后有終止子”。質(zhì)粒作為運(yùn)載體必須具備標(biāo)記基因、啟動(dòng)子和終止子等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中限制酶Sma 會(huì)破壞標(biāo)記基因；如果所選限制酶的切點(diǎn)不是一個(gè)，則切割重組后可能丟失某些片段，若丟失的片段含復(fù)制起點(diǎn)區(qū)，則切割重組后的片段進(jìn)入受體細(xì)胞后不能自主復(fù)制?！镜淅?下表中列出了幾種限制酶的識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中的箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是 ()。限制酶 BamHHind EcoRSma識(shí)別序列及切割位點(diǎn)GGATC CC CTAGGAAGCT TT TCGAAGAATT CC TTAAGCCCGGGGGGCCC A.一個(gè)圖1所示的質(zhì)粒分子經(jīng)Sma切割后，含有4個(gè)游離的磷酸基團(tuán) B.用圖1中的質(zhì)粒和圖2中的目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，不能使用Sma切割 C.為防止酶切后單個(gè)含目的基因的DNA片段自身連接成環(huán)狀，圖2所示的外源DNA不能使用EcoR切割 D.為了獲取重組質(zhì)粒，可用BamH 和Hind同時(shí)切割質(zhì)粒和外源DNA 解析本題主要考查考生對(duì)基因工程的操作工具限制酶的理解。圖1所示質(zhì)粒被Sma切割后形成2個(gè)黏性末端，根據(jù)DNA分子兩條鏈反向平行的特點(diǎn)可知，切割后應(yīng)含有2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，故A錯(cuò)誤。若用Sma切割圖1中的質(zhì)粒和圖2中的目的基因，會(huì)分別破壞質(zhì)粒中的標(biāo)記基因和目的基因；用一種限制酶處理的目的基因會(huì)因兩端含有相同黏性末端而可能發(fā)生自身環(huán)化，用兩種限制酶同時(shí)切割質(zhì)粒和外源DNA即可解決這一問(wèn)題，所以可以用BamH和Hind同時(shí)處理。 答案A