人源化單克隆抗體的研究進(jìn)展和應(yīng)用 組員 洪武平王松振王雁慶曾亞威 09生物技術(shù) 單克隆抗體在理論和實(shí)踐上的應(yīng)用成為解決生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等許多重大問題的重要手段 但是 上述應(yīng)用的單抗屬于鼠源性 鼠源性單抗應(yīng)用于人類的臨床應(yīng)用結(jié)果反映出了單克隆抗體藥物存在的一些問題 1 鼠源性單抗容易容易產(chǎn)生人抗鼠抗體 HAMA 在體內(nèi)作為異源蛋白被清除掉 從而削弱其治療的有效性 2 鼠源性單抗在人體內(nèi)生物活性降低 不能有效地激活人體的生物效應(yīng) 研究背景 因此 人們一直致力于人源性抗體的研究 人源化治療性單克隆抗體的研究進(jìn)展 構(gòu)建的基本思路 鼠抗體人源化就是通過基因改造 使其和人體內(nèi)的抗體分子具有極其相似的輪廓 從而逃避人免疫系統(tǒng)的識別 避免誘導(dǎo)HAMA 人抗鼠抗體 反應(yīng) 遵守兩個原則首先 要保持抗體的親和力和特異性 其次 要降低或消除抗體的免疫原性 以分子生物學(xué)技術(shù)提取 擴(kuò)增編碼人抗體的DNA 構(gòu)建質(zhì)粒 建立組合抗體文庫 再利用供者文庫建立針對某一特定抗原的子文庫 以該技術(shù)制備的抗體片段 Fab 是人源抗體 具有建庫簡單 抗體表達(dá)穩(wěn)定等特點(diǎn) 迄今已有多種抗體產(chǎn)生 可以預(yù)見 該技術(shù)具有良好的發(fā)展和應(yīng)用前景 解決方案 1 用人脾細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞雜交 2 用EB病毒轉(zhuǎn)化人的B淋巴細(xì)胞 3 用基因工程法制備嵌合抗體等 效果不強(qiáng) 4 最新方法 抗體庫篩選技術(shù)和轉(zhuǎn)基因鼠技術(shù) 單克隆抗體的發(fā)展史 第一代 鼠源性單抗 藥物特異性很強(qiáng) 副作用大 現(xiàn)在已經(jīng)漸漸退出市場 不過由于其代謝比較快 目前在放射性元素標(biāo)記的單克隆抗體藥物中使用 第二代 人鼠嵌合性單抗 進(jìn)行人源化改造 使其人源化程度達(dá)到70 左右 第三代 CDR移植抗體和SDR移植抗體 人源化程度達(dá)到95 左右 大大降低了毒副作用 第四代 全人源化單抗 2002年 的世界首個藥物 阿達(dá)木單抗上市 人源化及全人源單克隆抗體由于副作用小 在體內(nèi)停留時間長 更有利于治療 人源化程度 1 嵌合抗體 Chimericantibody 用人源基因代替鼠源單抗的恒定區(qū) 即該單抗由鼠的可變區(qū)和人的恒定區(qū)組成的嵌合抗體 由于嵌合抗體可變區(qū) V 約占整個抗體的30 鼠源性抗體V區(qū)中的框架區(qū) FR 仍殘留一定的免疫原性 可誘導(dǎo)HAMA反應(yīng) 靈長目源抗體也是一類嵌合抗體 通過免疫短尾猿猴產(chǎn)生 由于其抗體的可變區(qū)與人可變區(qū)無差異 不至于發(fā)生抗體反應(yīng) 缺點(diǎn) 解決方案 鼠源抗體 嵌合抗體 2020 3 21 2 CDR移植抗體 CDRgraftedantibody 真正意義上的抗體人源化 抗體中除了3個互補(bǔ)決定區(qū) CDR 是鼠源的外 其余全部是人源結(jié)構(gòu) 人源化程度可達(dá)到95 以上 具有更高的安全性和更低的毒性 不足 有時異基因的CDR人源化抗體可能引起抗個體基因型反應(yīng) 改良方案 進(jìn)行SDR移植改良 嵌合抗體 人源化抗體 3個CDR 3 SDR移植抗體 SDRgraftedantibody 在CDR移植抗體的基礎(chǔ)上 將異源抗體中與抗原結(jié)合密切相關(guān)的SDR等少數(shù)殘基移植到人抗體相應(yīng)位置上 進(jìn)一步降低了抗體的異源性 通過這種方法 使人源化的抗體潛在的免疫原性降至最低 4 全人單克隆抗體 Fullyhumaneantibody 它是將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體 轉(zhuǎn)染工程細(xì)菌進(jìn)行表達(dá) 然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體 在HIV等病毒感染和腫瘤的診斷與治療方面有其獨(dú)特的優(yōu)越性 4 1 抗體庫篩選技術(shù) 4 1 1 噬菌體表面展示技術(shù) 鼠源抗體 完全人源化抗體 基本原理和程序 噬菌體抗體庫 人免疫細(xì)胞基因組 PCR技術(shù)擴(kuò)增 整套的抗體重鏈可變區(qū) VH 和輕鏈可變區(qū) VL 基因 噬菌體DNA中有抗體基因外殼表面有抗體分子的表達(dá) 克隆并以融合蛋白的形式表達(dá) 基因重組 噬菌體重組DNA 構(gòu)建 利用抗原 抗體特異性 篩選所需抗體并進(jìn)行克隆擴(kuò)增 獲得可溶性抗體片段 表達(dá) 2020 3 21 局限性 1 在噬菌體展示過程中涉及細(xì)菌轉(zhuǎn)化 噬菌體包裝 展示跨膜分泌 這就大大限制了所建庫的容量和分子的多樣性 目前 常用的噬菌體展示文庫容量在109 2 不是所有的序列都能在噬菌體中獲得很好的表達(dá) 因?yàn)橛行┑鞍踪|(zhì)功能的實(shí)現(xiàn)需要折疊 轉(zhuǎn)運(yùn) 膜插入和絡(luò)合 導(dǎo)致在體內(nèi)篩選時需要外加選擇壓力 3 噬菌體展示文庫無法進(jìn)行有效的體外突變和重組進(jìn)而限制了文庫中分子遺傳的多樣性 4 因?yàn)槭删w展示系統(tǒng)依賴于細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá) 所以一些對細(xì)胞有毒性的分子 如生物毒素分子 很難得到有效表達(dá)和展示 4 1 2 核糖體展示技術(shù) 基本原理和程序 人免疫細(xì)胞基因組 EDTA 體外轉(zhuǎn)錄 翻譯 偶聯(lián) mRNA 核糖體 蛋白質(zhì)三聚體 核糖體展示的蛋白文庫 構(gòu)建 基因型和表型聯(lián)系 利用抗原 抗體特異性 篩選所需抗體復(fù)合體 EDTA解離 獲得特異mRNA RT PCR RT PCR 特異抗體DNA子文庫 獲得特異性的 高親和力的抗體 表達(dá) 2020 3 21 傳統(tǒng)的篩選技術(shù)具有本身難以克服的缺陷 主要表現(xiàn)在構(gòu)建文庫和篩選時都涉及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 噬菌體包裝 跨膜分泌和蛋白質(zhì)降解等諸多方面的問題 文庫容量及其分子多樣性在某種程度上受到很大的限制 降低了文庫篩選效率 核糖體展示技術(shù)由于在體外無細(xì)胞翻譯體系中進(jìn)行 用mRNA的可復(fù)制性 使靶基因 蛋白 得到有效富集 不受細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的限制 它大大的提高了文庫容量和篩選通量 1012 1014 而且能夠增加表達(dá)的蛋白質(zhì)的溶解度 優(yōu)勢 4 2 轉(zhuǎn)基因小鼠 通過基因敲除技術(shù) 使小鼠自身的基因失活 并導(dǎo)入新基因 創(chuàng)造出攜帶人抗體重輕基因簇的轉(zhuǎn)基因小鼠 這種人抗體基因小鼠所攜帶的人DNA片段具有完善的功能 可以有效地進(jìn)行同型轉(zhuǎn)換和親和力成熟 任何靶抗原均可被用來免疫該小鼠 使其產(chǎn)生高親和力的人抗體 案例 日本麒麟公司用基因工程技術(shù) 使小鼠攜帶完整的人14號染色體 該染色體包含全部人抗體產(chǎn)生基因 但迄今尚無該技術(shù)生產(chǎn)的制品問世 4 3 微胞雜交干細(xì)胞技術(shù) 日本學(xué)者Ishida等首先提出 技術(shù)要點(diǎn) 首先將抗G418的人成纖維細(xì)胞與小鼠的A9細(xì)胞融合 通過篩選 得到抗G418的小鼠A9細(xì)胞 再運(yùn)用PCR或原位熒光雜交方法篩選 先篩選出的細(xì)胞用秋水仙素處理48h 然后用細(xì)胞松弛素B處理并高速離心 分離出含2號 14號 22號染色體的小鼠 人源抗體在這種轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)量還比較低 4 4 其他方法 XTL生物制藥公司使用一種類似于人骨髓移植的方法 用放射線破壞動物骨髓 然后注入人抗體生成細(xì)胞 該公司已用此法生產(chǎn)出一種全人單抗 2020 3 21 近年來 人源化抗體和人抗體的出現(xiàn)為臨床應(yīng)用帶來了新的希望 當(dāng)前正處于臨床研究的多種抗體中 嵌合抗體和人源化抗體所占比例大于70 目前的人源化抗體 主要用于腫瘤 自身免疫性疾病和心血管疾病的治療以及抗移植排斥反應(yīng)和抗病毒感染等方面 人源化抗體的臨床應(yīng)用 2020 3 21 1 在腫瘤治療方面的應(yīng)用 單抗藥物抗腫瘤能有效地降低傳統(tǒng)腫瘤藥物治療的不良反應(yīng) 如2005年我國開發(fā)出癌癥治療藥 重組人源化抗人表皮生長因子受體單克隆抗體 商品名 泰欣生 泰欣生聯(lián)合放療治療鼻咽癌的完全緩解率比單純放療的患者提高30 以上 2 在器官移植中的應(yīng)用 近年來 利用抗體藥物作為實(shí)體器官移植的誘導(dǎo)治療逐漸增加 如1986年批準(zhǔn)進(jìn)入美國市場的治療性抗體類藥物抗CD3單抗即被用于腎 心臟 肝臟移植排斥的逆轉(zhuǎn) 3 在心血管疾病方面的應(yīng)用 美國FDA于1994年批準(zhǔn)了第一個人 鼠嵌合Fab抗體的上市 該抗體現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于多種心血管疾病治療 主要用于預(yù)防冠狀動脈成形術(shù)后的再狹窄 2020 3 21 4 在自身免疫性疾病方面的應(yīng)用 現(xiàn)有的研究表明 抗體對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 系統(tǒng)性紅斑狼瘡 牛皮癬 多發(fā)性硬化 硬皮病 潰瘍性結(jié)腸炎等療效較好 5 在抗病毒感染方面的應(yīng)用 近年來研究表明 在HBV HCV HIV等病毒感染性疾病中 人源化抗體顯示了較好的應(yīng)用前景 如 商品名為SynagisTM的抗呼吸道病毒感染的抗體在美國已經(jīng)上市 為人源化的基因工程抗體 應(yīng)用單克隆抗體后的患者癥狀改善率 總結(jié) 到目前為止 至少有35個完全人類的單抗已經(jīng)進(jìn)入臨床的治療實(shí)驗(yàn)階段 這些單抗的靶抗原都是臨床癌癥 自身免疫疾病或炎癥疾病和傳染病中的主要抗原 例如EGFR CTLA 4和CD4等 在治療一些異種移植 骨質(zhì)疏松癥等疾病已有顯著的效果 抗體人源化以及完全人源化抗體的制備已經(jīng)成為當(dāng)今治療性抗體的發(fā)展趨勢 同時 各種抗體衍生物免疫原性低 更易通過血管壁到達(dá)病源 通過PEG化等方法可以延長其半衰期 人抗體是否可以解決鼠抗體運(yùn)用中出現(xiàn)的所有問題 還有待大量臨床試驗(yàn)的檢驗(yàn) 所以可行的方法就是在完善人抗體技術(shù)的同時 推進(jìn)治療性小分子抗體衍生物的研究 根據(jù)臨床的實(shí)際設(shè)計(jì)靈活有效的治療方案 使人源化抗體和小分子抗體互為補(bǔ)充 Thanks