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生物技術(shù)制藥 第四章抗體制藥 第一節(jié)概述第二節(jié)單克隆抗體第三節(jié)鼠源性單克隆抗體的改造第四節(jié)基因工程抗體和抗體工程第五節(jié)抗體診斷試劑第六節(jié)抗體治療藥物 第一節(jié)概述 1890年 Behring和北里柴三郎等發(fā)現(xiàn)了白喉抗毒素 并建立了血清療法 開抗體制藥之先河 1937年 Tiselius等人用電泳法將血清蛋白分為白蛋白 甲種 球蛋白 乙種 球蛋白和丙種 球蛋白 并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白組分 20世紀60年代初期 抗原決定簇 精制單價血清 1975年 K hler和Milstein等 單克隆抗體 其具有高度特異性 均一性 以及來源穩(wěn)定可大量生產(chǎn)等特點 1984年 人 鼠嵌合抗體1984年至今 單克隆抗體的鼠源性及分子過大的問題得以解決 可僅作為與抗原特異性結(jié)合試劑 單克隆抗體的應(yīng)用 用于疾病的診斷和治療 如利用單克隆抗體檢測與某些疾病相關(guān)的抗原 輔助臨床診斷 或用放射性核素標記單克隆抗體進行腫瘤顯像 進行免疫鑒定 用于臨床治療 如針對T淋巴細胞共有的分化抗原CD3的單克隆抗體 用作免疫抑制劑 單克隆抗體還可作為載體制備導(dǎo)向藥物 但是要解決以下兩個問題 1 鼠源性單克隆抗體的免疫原性 2 完整的抗體分子分子量過大 難以穿透實體腫瘤組織 達不到有效的治療濃度 單克隆抗體的應(yīng)用 基因工程技術(shù)為解決這兩個問題提供了可能 已通過基因工程技術(shù) 制備出改形抗體 單鏈抗體 單域抗體 最小識別單位等很多類型的抗體或抗體單位 基本消除了單克隆抗體的鼠源性 相對分子質(zhì)量只有完整抗體分子的1 80 1 3 而且鼠源性單克隆抗體的生物學(xué)活性如激活補體 促進吞噬功能 免疫調(diào)理 抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒作用等 只保留同抗原特異性結(jié)合的活性 第二節(jié)單克隆抗體 單克隆抗體是將抗體產(chǎn)生細胞與骨髓瘤細胞融合 通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系而生產(chǎn)的 由于這種抗體是針對一個抗原決定簇的抗體 又是單一的B淋巴細胞克隆產(chǎn)生的 因此稱為單克隆抗體 它是結(jié)構(gòu)和特異性完全相同的高純度抗體 制備的一般流程見下圖 單克隆抗體和多克隆抗體的制備 脾 B淋巴細胞 融合 融合 淋巴細胞 骨髓瘤細胞 克隆1 克隆2 克隆3 克隆4 第二節(jié)單克隆抗體 一 抗原與動物免疫二 細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)三 篩選陽性克隆與克隆化四 雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定五 單克隆抗體的大量制備六 單克隆抗體的純化 一 抗原與動物免疫 1 制備用于動物免疫的適當(dāng)抗原 化學(xué)合成抗原 如精制的地高辛 多數(shù)情況下抗原物質(zhì)只能得到部分純化 甚至是極不純的混合物 如部分純化的干擾素 通過克隆化選出最適當(dāng)?shù)膯慰寺】贵w 在制備惡性腫瘤細胞表面抗原的單克隆抗體時 情況較復(fù)雜 需用整個腫瘤細胞做為免疫原 經(jīng)過篩選 克隆化 制備出僅存在于腫瘤細胞而不存在于正常細胞上的表面標志分子上的單克隆抗體 一 抗原與動物免疫 2 穩(wěn)定的雜交瘤的獲得因免疫動物品系和骨髓瘤細胞在種系發(fā)生上距離越遠 產(chǎn)生的雜交瘤越不穩(wěn)定 故一般采用與骨髓瘤供體同一品系的動物進行免疫 目前常用的骨髓瘤細胞系多來自BALB c小鼠和Lou大鼠 因此免疫動物也多采用相應(yīng)的品系 最常用的也是BALB c小鼠 選擇動物時應(yīng)考慮到動物品系的免疫應(yīng)答基因 Ir 對抗原免疫應(yīng)答的影響 不同品系的小鼠與大鼠在對某類抗原的免疫應(yīng)答上是不同的 書中表4 1是骨髓瘤細胞系一覽表 可以參考 一 抗原與動物免疫 3 免疫方法 體內(nèi)免疫法和體外免疫法體內(nèi)免疫法 適用于免疫原性強 抗原量較多時應(yīng)用 一般用8 12周齡的雌性鼠 顆粒性抗原 如細菌 細胞抗原 的免疫原性強 可不加佐劑 直接注入腹腔107個細胞進行初次免疫 間隔1 3周 再追加免疫1 2次 可溶性抗原則按每只小鼠10 100 g抗原與福氏完全佐劑等量混合后注入腹腔內(nèi) 進行初次免疫 間隔2 4周 再用不加佐劑的原抗原追加免疫1 2次 一般在采集脾細胞前3日由靜脈注射最后一次抗原 其目的是使對應(yīng)的B淋巴細胞克隆受到可靠的最大限度的刺激 使其迅速地增殖分裂 因為細胞融合后增殖最好的細胞是迅速分裂的細胞 有人認為在常規(guī)免疫的基礎(chǔ)上用脾內(nèi)免疫法做追加免疫較佳 一 抗原與動物免疫 3 免疫方法 體內(nèi)免疫法和體外免疫法體外免疫法 用于不能采用體內(nèi)免疫法的情況下 如制備人源性單克隆抗體 或者抗原的免疫原性極弱且能引起免疫抑制時使用 體外免疫法所需要的抗原量少 一般只需幾個 g 免疫期短 僅4 5天 干擾因素少 已成功制備出針對多種抗原的單克隆抗體 但融合后產(chǎn)生的雜交瘤細胞株不夠穩(wěn)定 其基本方法是用4 8周齡BALB c小鼠的脾臟制成單個細胞懸液 再加入適當(dāng)抗原使其濃度達0 5 5 g ml 在5 CO2 37 下培養(yǎng)4 5天 再分離脾臟細胞 進行細胞融合 二 細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng) 1 細胞融合基本方法 取適量脾細胞 1 108 與骨髓瘤細胞 2 107 3 107 進行混合 在聚乙二醇 PEG 作用下誘導(dǎo)它們?nèi)诤?時間控制在2min以內(nèi) 然后用培養(yǎng)液將PEG融合液緩慢稀釋 2 用于融合的骨髓瘤細胞應(yīng)具備條件 融合率高 自身不分泌抗體 所產(chǎn)生的雜交瘤細胞分泌抗體的能力強且長期穩(wěn)定等特點 書中表4 1列舉了主要的骨髓瘤細胞系 其中SP2 0 P3 653細胞本身不分泌抗體 細胞融合后產(chǎn)生的雜交瘤細胞只分泌均一的 完全來自脾細胞的抗體分子 它們是目前較為理想的可供融合的骨髓瘤細胞 特別是SP2 0細胞系還具有容易培養(yǎng) 融合率高等特點 被國內(nèi)外多個實驗室廣泛采用 二 細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng) 3 誘導(dǎo)劑PEG的影響 PEG分子量以及濃度越大 促融率越高 但其粘度和對細胞的毒性也隨之增大 目前常用的PEG的濃度為40 50 相對分子質(zhì)量以4000為佳 但相對分子量400 6000 濃度在10 50 范圍之間的PEG都能使細胞融合 為了提高融合率 在PEG溶液中加入二甲基亞砜 DMSO 以提高細胞接觸的緊密性 增加融合率 但是 PEG和DMSO都對細胞有毒性 必須嚴格限制它們和細胞的接觸時間 可通過低速離心5min使細胞接觸更為緊密 然后用新配制的培養(yǎng)液來稀釋藥物并洗滌細胞 二 細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng) 4 培養(yǎng)基的正確選擇 常用的選擇培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)基 它是次黃嘌呤 H 氨基喋呤 A 和胸腺嘧啶 T 配制的 其中氨基喋呤 A 能阻斷DNA合成的主要途徑 瘤 瘤融合細胞和瘤細胞因不能合成DNA而死亡 脾 脾融合細胞和瘤細胞在這樣的條件下 幾天內(nèi)亦迅速死亡 由于SP2 0等骨髓瘤細胞都是次黃嘌呤 H 鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 HGPRT 缺乏株 脾細胞中卻有這種酶 因此脾 瘤融合的雜交瘤細胞可利用HGPRT酶 用次黃嘌呤 H 和胸腺嘧啶 T 合成DNA 使雜交瘤細胞得以生長 二 細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng) 5 選擇性培養(yǎng)方法 通常將融合的細胞懸浮于HAT的培養(yǎng)液 配方見書中表4 2 加入到含有飼養(yǎng)細胞的96孔板內(nèi) 根據(jù)情況每2 3天換液一次 換液時吸去1 2 2 3培養(yǎng)液 加入等量的新鮮培養(yǎng)液 在融合后7天內(nèi)用HAT培養(yǎng)液 殺死瘤 瘤融合細胞后 第7 14天改用HT培養(yǎng)液 14天以后用普通的RPMI1640完全培養(yǎng)液 配方書中表4 3 從融合后8 9天就可對所有克隆生長孔的培養(yǎng)上清進行抗體檢測 篩選出產(chǎn)生抗體的陽性克隆 二 細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng) 6 飼養(yǎng)細胞 由于在最適的條件下大約有105個脾細胞才能形成一個雜交瘤細胞 大量瘤細胞在HAT培養(yǎng)液中相繼死亡 單個或少數(shù)的雜交瘤細胞多半不能存活 所以通常要加入飼養(yǎng)細胞才能使其繁殖 常用的飼養(yǎng)細胞有小鼠腹腔巨噬細胞 脾細胞和胸腺細胞等 一般認為飼養(yǎng)細胞能釋放某些生長刺激因子 并能滿足雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性 小鼠腹腔巨噬細胞還能清除死亡細胞 故應(yīng)用的較多 三 篩選陽性克隆與克隆化 1 篩選陽性克隆 因為產(chǎn)生特定抗原的抗體產(chǎn)生細胞只占所有脾細胞的5 左右 所以要進行每孔培養(yǎng)上清的抗體活性的篩選工作 以選擇出陽性克隆 然后進行克隆化培養(yǎng) 為了盡快地篩選出陽性克隆 必須采用微量 快速 特異 敏感 簡便并一次能檢測大批標本的方法 常用的檢測方法有免疫酶技術(shù) 免疫熒光技術(shù)和放射免疫技術(shù)等 一般來說 免疫酶技術(shù)和放射免疫技術(shù)均適用于可溶性抗原及顆粒性抗原的抗體檢測 免疫熒光技術(shù)適用于細胞抗原的抗體檢測 特別是制備以檢測患者活檢組織標本為目的的抗體時 免疫熒光法更有意義 在篩選抗體的同時 還能對所識別的抗原進行定位判定 1 精制破傷風(fēng)毒素抗原 吸附 約10 g ml 4 3h 洗滌 2 加雜交瘤培養(yǎng)上清液 4 1h 3 加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體 4 1h 洗滌 洗滌 4 加酶作用底物 呈色孔為陽性克隆孔 ELISA用于破傷風(fēng)抗體的篩選 三 篩選陽性克隆與克隆化 2 克隆化 有限稀釋法和軟瓊脂法篩選出來的陽性克隆中 可能含有不分泌抗體的細胞或有多株分泌抗體的細胞 而且剛剛?cè)诤汐@得的雜交瘤細胞不穩(wěn)定 染色體容易丟失 因此應(yīng)盡早克隆化 一般融合后獲得的雜交瘤細胞要經(jīng)過大約3次的克隆化 才能達到100 孔內(nèi)均為抗體陽性細胞克隆 常用的克隆化方法有有限稀釋法和軟瓊脂法 有限稀釋法是把雜交瘤細胞懸液稀釋后 加入到96孔細胞培養(yǎng)板中 使每個孔中在理論上只含有一個細胞 第一次克隆化時也要應(yīng)用HT培養(yǎng)液 以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培養(yǎng)液 由于單個細胞難以存活 克隆化時也需加入飼養(yǎng)細胞輔助其生長 三 篩選陽性克隆與克隆化 2 克隆化 有限稀釋法和軟瓊脂法軟瓊脂法是在培養(yǎng)液中加入0 5 左右的瓊脂糖凝膠 細胞分裂后形成小球樣團塊 由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài) 可用毛細吸管將小球吸出 團塊打碎后 移入96孔板中繼續(xù)培養(yǎng) 用這種方法可以吸出大量克隆細胞進行培養(yǎng) 因初代細胞很不易增殖 所以用軟瓊脂法進行克隆化容易成功 四 雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定 1 雜交瘤細胞的鑒定正常鼠的脾細胞染色體數(shù)為40 全部是端著絲粒染色體 小鼠骨髓瘤細胞的染色體數(shù)變異較大 SP2 0細胞為62 68 NS 1細胞為54 64 大多數(shù)為非整倍性 并且有中部著絲點染色體和亞中部著絲點染色體 雜交瘤細胞的染色體在數(shù)目上接近兩種親本細胞染色體數(shù)目的總和 在結(jié)構(gòu)上除多數(shù)為端著絲粒染色體外 還應(yīng)出現(xiàn)少數(shù)標志染色體 染色體數(shù)目較多又比較集中的雜交瘤細胞能穩(wěn)定分泌高效價的抗體 而染色體數(shù)目少且比較分散的雜交瘤細胞分泌抗體的能力較低 四 雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定 2 抗體性狀的鑒定由于不同類和不同亞類的免疫球蛋白生物學(xué)特性差異較大 諸如補體活化 免疫調(diào)理 ADCC效應(yīng)等等 因此要對制備的雜交瘤細胞產(chǎn)生的單克隆抗體 進行Ig類和亞類的鑒定 可用羊或兔抗Ig不同類和亞類的抗體 進行免疫擴散或ELISA法來鑒定 在單克隆抗體鑒定中還必須進行親和力測定 它可為正確選擇不同用途的單克隆抗體提供依據(jù) 另外根據(jù)需要不同 還應(yīng)對單克隆抗體的特異性 純度和識別抗原的相對分子量等進行測定 五 單克隆抗體的大量制備 1 體外培養(yǎng)法可獲得10 g ml的抗體 2 動物體內(nèi)誘生法 可獲得5 20mg ml的抗體 目前多采用后者生產(chǎn)制備單克隆抗體 因為雜交瘤細胞的兩種親本細胞均來自BALB c小鼠 所以應(yīng)選用BALB c小鼠來制備單克隆抗體 為了使雜交瘤細胞在腹腔內(nèi)增殖良好 可于注入細胞的幾周前 預(yù)先將具有刺激性的有機溶劑降植烷 pristane 注入腹腔內(nèi) 以破壞腹腔內(nèi)膜 建立雜交瘤易于增殖的環(huán)境 動物體內(nèi)誘生法操作簡便 也比較經(jīng)濟 所得單克隆抗體量較多且效價亦高 還可有效地保存雜交瘤細胞株和分離已污染雜菌的雜交瘤細胞株 缺點是小鼠腹水中混有來自小鼠的多種雜蛋白 給純化帶來難度 五 單克隆抗體的大量制備 書中介紹了體外培養(yǎng)法和動物體內(nèi)誘生法的具體步驟以及其它一些近來發(fā)展的方法 這里不一一介紹 利用懸浮培養(yǎng)方式可增加細胞生長空間 雜交瘤細胞生長旺盛 單克隆抗體產(chǎn)量得到提高 連續(xù)懸浮培養(yǎng)的細胞密度可達2 0 107細胞 ml 收集的單克隆抗體可達到400 g ml左右 如在培養(yǎng)液中加入固體顆粒作為細胞生長的載體 增大單位體積的表面積 利于雜交瘤細胞生長 細胞密度可達108細胞 ml 并能收獲更多的單抗 此稱為微載體懸浮培養(yǎng)法 固體顆粒用DEAE SephadexA50等材料制成 六 單克隆抗體的純化 動物體內(nèi)誘生法制備單克隆抗體具體方法及過程1 澄清和沉淀處理小鼠腹水中含有紅細胞 細胞碎塊 纖維蛋白凝塊及脂質(zhì)等 應(yīng)首先用離心力1000g離心5min 去除殘留的小顆粒物質(zhì) 再用0 2 m的微孔濾膜過濾 除掉污染的細菌 支原體和脂質(zhì) 用飽和硫酸銨沉淀抗體 50 飽和硫酸銨能回收90 以上的單克隆抗體 2 分離根據(jù)用途可選用不同的方法 主要分離方法有凝膠過濾 陰離子交換層析 親和層析等 六 單克隆抗體的純化 2 分離 1 凝膠過濾用于IgG和IgM類單克隆抗體的分離純化 常用SephadexG200作分離介質(zhì) 可收集到三個峰 最高峰為IgM 另兩個峰為IgG 抗體回收率達50 80 能去除污染的微量雜蛋白 抗體純度可達95 以上 2 陰離子交換層析用于IgG類單克隆抗體的分離純化 在pH7 4條件下 IgG1和IgG2能結(jié)合在DEAE填料上 其中IgG2a可在較低離子強度條件下洗脫下來 其純度較高 IgG2b IgG3在低離子強度下易發(fā)生沉淀 可增加離子強度以提高產(chǎn)量 但其純度相對較低 在pH5 5條件下 把雜交瘤細胞培養(yǎng)的上清液加到瓊脂糖柱上時 所有的抗體都能結(jié)合到柱上 而55 的雜蛋白可被洗脫掉 再用不同離子強度的洗脫劑洗下 續(xù) 2 離子交換法在最適離子強度及pH條件下 以離子交換層析分離單克隆抗體可以純化25 100倍 高容量 高流速 化學(xué)穩(wěn)定的新型離子交換劑適宜單克隆抗體的大規(guī)模純化 3 親和層析多用蛋白A親和層析 適用于IgG類單克隆抗體的純化 IgG與蛋白A的結(jié)合與pH有密切關(guān)系 鼠源性單克隆抗體在pH8 0時 IgG2b IgG3幾乎全部結(jié)合于蛋白A柱上 IgG1稍差 用pH3 5緩沖液可洗脫IgG2b pH4 0緩沖液可洗脫下IgG3 pH4 5緩沖液可洗脫下IgG2a pH6 0可洗脫下IgG1 用蛋白A親和層析收獲的抗體純度很高 但也有極微量的雜蛋白 第三節(jié)鼠源性單克隆抗體的改進 改造鼠源性單克隆抗體的目的 一是降低免疫原性 二是降低相對分子量 增加組織通透性 如將鼠源性單克隆抗體的C區(qū)用人的Ig分子的C區(qū)置換 則對人的免疫原性消失 對鼠源性抗體的改造已有很多成果報道 見書中表4 4 給出了改造后的單抗的類型和特性 有人 鼠嵌合抗體 人IgC 小鼠IgV 150000 改形抗體 將小鼠CDRs替換為人CDRs 150000 Fab 完整L鏈和Fd 50000 FV VH和VL 25000 單鏈抗體 SCFV VH 多肽 VL 27000 單域抗體 VH或VL 12500 最小識別單位 MRU 一個CDR 2000 一 人 鼠嵌合抗體 制備方法 提取雜交瘤細胞系的mRNA 經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 并以其為模板 采用特異引物 用PCR方法分別擴增VL和VH基因 再分別連接真核表達所需的上游啟動子 前導(dǎo)肽序列和下游剪切供體信號 增強子真核調(diào)控序列后 將VL基因克隆到人Ig的CL基因表達載體上 將VH基因克隆到人IgG1的C基因真核表達載體上 再將人 鼠嵌合的V C區(qū)基因質(zhì)粒DNA等量混合 在脂質(zhì)體介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細胞SP2 0 轉(zhuǎn)染后用含霉酚酸進行篩選 形成集落的細胞即為共轉(zhuǎn)染細胞 所分泌的抗體為嵌合抗體 它保持鼠源性單克隆抗體的抗原結(jié)合的特異性 但對人的免疫原性大幅下降了 如若用人IgG1或IgG3的C基因替換鼠IgG1或IgG2b 則可有效地加強多肽的ADCC效應(yīng)與免疫調(diào)理作用 二 改形抗體 Ig分子中參與構(gòu)成抗原結(jié)合部位的區(qū)域是H和L鏈V區(qū)中的互補性決定區(qū) CDR區(qū) 而不是整個可變區(qū) H和L鏈各有三個CDR 其他部分稱為框架區(qū) 如果用鼠源性單克隆抗體的CDR序列替換人Ig分子中CDR序列 則可使人的Ig分子具有鼠源性單克隆抗體的抗原結(jié)合特異性 抗體分子中鼠源性部分只占很小比例 可基本消除免疫原性 這種改形抗體 reshapingantibody 又稱CDR移植抗體 CDRgraftingantibody 書中表4 5給出幾種改形抗體及其潛在的臨床應(yīng)用 三 小分子抗體 基因工程小分子抗體僅表達鼠源性單克隆抗體的V區(qū)片段 其相對分子量僅為原抗體的1 80 1 3 也就是說 保留了CDR區(qū) 而Ig分子的C區(qū)不表達 現(xiàn)在研制的小分子抗體有以下幾種類型 1 Fab抗體 由完整的輕鏈和重鏈 VH和CH1 所組成 2 FV抗體 由VH和VL組成 天然FV片段中VH和VL為非共價性結(jié)合 3 單鏈抗體 singlechainantibodySCA或singlechainFV SCFV 由VH和VL通過一段連接肽 linker 連接而成的重組蛋白 有分子量小 穿透力強 免疫原性小特點 可與效應(yīng)分子相連接構(gòu)建新功能抗體分子 是構(gòu)建免疫毒素和雙特異抗體的理想元件 4 單域抗體 由VH VL 單個可變區(qū)組成的 只有抗體分子的1 12 而且表面疏水性強 與抗原非特異結(jié)合能力也強 5 最小識別單位 MRU 是由單個CDR區(qū)構(gòu)成的小分子抗體 親和力較低 四 雙功能抗體 雙功能抗體就是雙特異性抗體 biospecificantibody BsAb 它是一種非天然性的抗體 其結(jié)合抗原的兩個臂具有不同的特異性 1 化學(xué)交聯(lián)法2 生物學(xué)方法 雜種 雜交瘤 雜交瘤細胞與脾細胞融合得到可分泌兩種親代抗體和雜種抗體的雜種 雜交瘤細胞 3 基因工程方法采用適當(dāng)?shù)慕宇^連接不同抗體的VH和VL區(qū) 使它們不能形成鏈內(nèi)的分子內(nèi)配對 讓其形成原抗體的分子內(nèi)配對 構(gòu)建雙特異性 SCFV 2 五 抗體融合蛋白 類型有 1 配基 配基型融合蛋白 如CD4 Fc 2 配基 Ig嵌合型蛋白 如IL 2 Ig 3 配基 FV型嵌合蛋白 如CD4 FVCD3 40受體 FV型融合蛋白 5 酶 抗體型融合蛋白 其中較為成熟的是配基 Ig型嵌合蛋白 而酶 抗體型融合蛋白 即抗體酶 abeneyme 在藥物治療中應(yīng)用前景廣闊 它可在靶向位置上將前體藥物轉(zhuǎn)化成有效的藥物 避免對正常組織的傷害 此法稱為抗體介導(dǎo)的酶前體藥物治療 五 抗體融合蛋白 構(gòu)建抗體融合蛋白的原則是 將第一個蛋白的終止密碼子刪除 再接上帶有終止密碼子的第二個蛋白基因 即可實現(xiàn)兩個基因共表達 在抗體的N端和C端融合其它蛋白都可以獲得成功 關(guān)鍵是兩個蛋白間的接頭序列l(wèi)inker 一般說來3 5個氨基酸就可滿足大部分融合蛋白的正確折疊的要求 如加入一段有疏水性和一定伸展性的長鏈 可緩解兩種蛋白的相互干擾 第四節(jié)基因工程抗體和抗體工程 一 噬菌體抗體庫技術(shù)的基本方法1 獲得目的基因2 抗體庫技術(shù)的載體 現(xiàn)在普遍使用噬菌粒 phagemid 載體 其中的pHEN1為新一代載體 轉(zhuǎn)化效率高 有利于提高庫容量 3 淘篩 抗原固定化后 對噬菌粒群的吸附 洗滌和洗脫后再感染擴增 與輔助噬菌體超感染獲得大容量次級文庫 再反復(fù)與抗原吸附 經(jīng)幾輪淘篩后 淘汰了非目的克隆 且使目的克隆大量擴增 四 表達與鑒定 目的克隆經(jīng)過鑒定后 再導(dǎo)入感受態(tài)菌株 進行可溶性表達 其產(chǎn)物用westernblot分析確定后 就完成了全過程 二 噬菌體抗體庫技術(shù)的特點 1 模擬天然全套抗體庫抗體文庫 1011庫容 能包含B細胞全部克隆 建庫的外源基因來自人外周血 骨髓或脾臟的淋巴細胞提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA擴增 使用的通用引物采自多個人體 具有人的種屬普遍性 VH和VL隨機重組增加抗體的多樣性 2 避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù)3 可獲得高親和力的人源化抗體在噬菌體抗體庫中 VH和VL基因的隨機重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟過程 所用抗體基因又都是來自人體 因此產(chǎn)生的抗體必然都是高親和力的 三 基因工程抗體的表達 1 原核細胞表達2 真核細胞表達3 轉(zhuǎn)基因植物表達4 轉(zhuǎn)基因動物表達 第五節(jié)抗體診斷試劑 一 血清學(xué)鑒定用的抗體類試劑1 鑒定病原菌的抗體試劑 診斷血清制備步驟 1 制備細菌抗原 O 菌體 抗原 H 鞭毛 抗原 2 免疫動物和制備抗體血清2 乙型肝炎病毒表面抗原 HBsAg 的反向被動血凝診斷試劑3 妊娠診斷試劑4 抗ABO血型系統(tǒng)血清 二 免疫標記技術(shù)用的抗體類試劑 給抗體標記放射性核素 熒光素或酶活性 能將抗原抗體反應(yīng)放大 使常規(guī)方法難以觀察或檢測的反應(yīng)得以顯現(xiàn) 因而大幅度提高抗原抗體反應(yīng)的敏感性 用于對微量抗原物質(zhì)進行定性或定量檢測 結(jié)合顯微鏡或電子顯微鏡技術(shù) 還可對抗原物質(zhì)作出組織內(nèi)或細胞內(nèi)的定位測定 除用于臨床診斷外 還能為探討發(fā)病機制提供有力的研究手段 免疫標記技術(shù)有三種基本類型 免疫熒光技術(shù) 免疫酶技術(shù)和放射免疫技術(shù) 二 免疫標記技術(shù)用的抗體類試劑 1 熒光抗體診斷試劑熒光色素如異硫氰酸熒光素 FITC 等標記抗體球蛋白 即成為熒光抗體 用熒光抗體浸染含有抗原物質(zhì)的組織切片或細胞 熒光抗體與抗原集合 在熒光顯微鏡下成為可發(fā)光的可視物 從而達到診斷或定位的目的 1 熒光抗體的制備 2 免疫熒光測定法有直接和間接兩種方法 二 免疫標記技術(shù)用的抗體類試劑 2 免疫酶抗體診斷試劑免疫酶技術(shù)是用酶標記抗體來檢測抗原的方法 本法分為免疫酶染色 組化法 和酶免疫測定 EIA 兩種類型 1 免疫酶染色法用抗體診斷試劑 常用的酶為HRP 其底物為二氨基聯(lián)苯胺 DAB 兩者作用可生成棕褐色沉淀物質(zhì) 使抗原呈色 2 酶免疫測定用抗體診斷試劑 見書中介紹的幾種試劑 重點掌握酶免疫法的基本概念 比如ELISA方法 夾心法 間接法 3 放射免疫用抗體診斷試劑 三 導(dǎo)向診斷藥物 放射免疫顯像定位技術(shù) 第六節(jié)抗體治療藥物 一 放射性核素標記的抗體治療藥物二 抗癌藥物偶聯(lián)的抗體藥物三 毒素偶聯(lián)的抗體藥物