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附件8 液體乳中三聚氰胺的快速檢測 拉曼光譜法 （KJ201908） 1　 范圍 本方法規(guī)定了液體乳制品中三聚氰胺快速測定方法。 本方法適用于生鮮乳、滅菌乳、巴氏殺菌乳、調(diào)制乳和發(fā)酵乳等液態(tài)乳制品中三聚氰胺含量的快速測定。 2　 原理 樣品經(jīng)沉淀、溶劑提取，加表面增強拉曼試劑對信號增強，進行拉曼光譜掃描。以70410cm-1處的拉曼特征峰作為三聚氰胺定量基準峰，以92510cm-1或類似基質(zhì)中穩(wěn)定存在的拉曼峰為參比峰，根據(jù)三聚氰胺峰與參比峰的相對強度對三聚氰胺的濃度繪制標準曲線，內(nèi)置儀器內(nèi)進行判別。 3　 試劑和材料 除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的二級水。 3.1　 試劑 3.1.1　 三氯乙酸。 3.1.2　 三氯乙酸溶液（5%）：準確稱取三氯乙酸（3.1.1）50 g于1 L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻后備用。 3.1.3　 表面增強試劑：金或銀納米粒子溶膠，或相當者。 注：表面增強試劑的參考配制方法： 納米金溶膠：取100mL0.01%氯金酸（AuCl3HCl4H2O）水溶液加熱至沸，劇烈攪拌下準確加入1.0mL 1%檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7）水溶液，金黃色的氯金酸水溶液在2min內(nèi)變?yōu)榧t色，繼續(xù)煮沸15min，冷卻后用蒸餾水補加到100mL。增強試劑配制用水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。 納米銀溶膠：取200mL1.0mM硝酸銀（AgNO3）水溶液加熱沸騰，劇烈攪拌下逐滴準確滴加5.0mL1%檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7）水溶液，持續(xù)煮沸1h，溶液變?yōu)榛揖G色，冷卻后用蒸餾水補加到200mL。增強試劑配制用水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。 3.1.4　 促凝劑：金溶膠的促凝劑：稱取5.85 g氯化鈉，溶于100 mL水中，搖勻，備用，或配制成其他相當?shù)臒o機鹽溶液。銀溶膠的促凝劑：稱取5.85 g氯化鈉和2 g氫氧化鈉，溶于100 mL水中，搖勻，備用，或配制成其他相當?shù)臒o機鹽溶液。 3.2　 參考物質(zhì) 三聚氰胺參考物質(zhì)中文名稱、英文名稱、CAS號、分子式、相對分子質(zhì)量見表1，純度≥99%。 表1 三聚氰胺中文名稱、英文名稱、CAS登記號、分子式、相對分子質(zhì)量 中文名稱 英文名稱 CAS登錄號 分子式 相對分子質(zhì)量 三聚氰胺 Melamine 108-78-1 C3H6N6 126.12 注：或等同可溯源物質(zhì)。 3.3　 標準溶液配制 三聚氰胺標準工作液（500 g/mL）：精密稱取三聚氰胺標準品（3.2）適量，分別置于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為500 μg/mL的標準儲備液。于4℃避光保存，有效期1個月。 4　 儀器和設備 4.1　 便攜式拉曼光譜儀 穩(wěn)頻激光光源：發(fā)射波長為7851 nm，線寬<0.1 nm，能量≥250 mW；光譜分辨率≤15 cm-1；光譜響應范圍500 cm-1~2000 cm-1，或大于該響應范圍。 4.2　 移液器：200 L、1 mL和5 mL。 4.3　 渦旋振蕩器。 4.4　 離心機：轉(zhuǎn)速≥6000 r/min。 4.5　 電子天平：感量為0.01 g。 4.6　 塑料具塞離心管：2 mL。 5　 分析步驟 5.1　 試樣的提取 取0.5 g樣品加到2 mL離心管中，再加入1ml 5%三氯乙酸溶液，渦旋30 s混勻；放入離心機，以不低于6000 r/min轉(zhuǎn)速離心1 min；上清液備用。 5.2　 測定步驟 5.2.1　 拉曼光譜儀器參考條件 激光能量≥250 mW，數(shù)據(jù)采集時間≥2 s。 5.2.2　 測定 在儀器樣品池中依次加入100 L促凝劑，100 L表面增強試劑，50 L樣品（5.1），快速搖晃均勻，等待20 s檢測（檢測需在樣品加入后1 min內(nèi)完成）。 5.3　 質(zhì)控試驗 每批樣品應同時進行空白試驗和加標質(zhì)控試驗。 5.3.1　 空白試驗 稱取空白試樣，按照5.1和5.2步驟與樣品同法操作。 5.3.2　 加標質(zhì)控試驗 準確稱取空白試樣10 g置于15 mL具塞離心管中，加入50 μL三聚氰胺標準工作液（500 g/mL）（3.3），使三聚氰胺濃度為2.5 mg/kg，按照5.1和5.2步驟與樣品同法操作。 6　 結(jié)果判定要求 儀器軟件將測試結(jié)果與標準譜圖庫中的三聚氰胺進行匹配計算，根據(jù)譜圖704 cm-1（10 cm-1）處特征拉曼光譜及內(nèi)置校準曲線，對樣品中的三聚氰胺進行結(jié)果判定：顯示測試結(jié)果并判定陰性或陽性。陰性代表該樣品不含有三聚氰胺或低于2.5 mg/kg，陽性則代表該樣品含有三聚氰胺且大于等于2.5 mg/kg。液態(tài)乳表面增強拉曼光譜圖參見圖1。 圖1 液態(tài)乳表面增強拉曼光譜圖 6.1　 質(zhì)控試驗要求 空白試樣測定結(jié)果應為陰性，加標質(zhì)控樣品測定結(jié)果應為陽性。 7　 性能指標 7.1　 檢測限 2.5mg/kg。 7.2　 靈敏度 靈敏度應≥99%。 7.3　 特異性 特異性應≥85%。 7.4　 假陰性率 假陰性率應≤1%。 7.5　 假陽性率 假陽性率應≤15%。 注：性能指標計算方法見附錄A。 8　 確證 本方法為初篩方法，當檢測結(jié)果為陽性時，應對結(jié)果進行確證。 9　 其他 本方法所述納米表面增強試劑及促凝劑信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時不做限定。方法使用者在使用替代試劑或操作步驟前，須對其進行考察，應滿足本方法規(guī)定的各項性能指標。 本方法參比標準為GB/T 22388-2008 《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》。 附錄A 快速檢測方法性能計算表 表A.1 性能指標計算方法 樣品情況a 檢測結(jié)果b 總數(shù) 陽性 陰性 陽性 N11 N12 N1.=N11+N12 陰性 N21 N22 N2.=N21+N22 總數(shù) N.1=N11+N12 N.2=N21+N22 N=N1.+N2.或N.1+N.2 顯著性差異(х2) c2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21), 自由度（df）=1 靈敏度（p+，%） p+=N11/N1. 特異性（p-，%） p-=N22/N2. 假陰性率（pf-，%） pf-=N12/N1.=100-靈敏度 假陽性率（pf+，%） pf+=N21/N2.=100-特異性 相對準確度，%c （N11+N22）/(N1.+N2.) 注： a由參比方法檢驗得到的結(jié)果或者樣品中實際的公議值結(jié)果； b由待確認方法檢驗得到的結(jié)果。靈敏度的計算使用確認后的結(jié)果。 N：任何特定單元的結(jié)果數(shù)，第一個下標指行，第二個下標指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。 C為方法的檢測結(jié)果相對準確性的結(jié)果，與一致性分析和濃度檢測趨勢情況綜合評價。 本方法負責起草單位：江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院。 驗證單位：山東省食品藥品檢驗研究院、江南大學、四川省食品藥品檢驗檢測院 主要起草人：徐春祥、張淵、張征、顏春榮、胡明燕、劉麗強、姚歡 — END — — 5 —