,1,第四章 衛(wèi)生微生物研究和檢測(cè)的方法,1,2,衛(wèi)生微生物檢測(cè)的特點(diǎn)及基本原則 衛(wèi)生指示微生物 衛(wèi)生微生物研究和檢測(cè)的方法 衛(wèi)生微生物研究和檢測(cè)方法的前景,2,3,第一節(jié),衛(wèi)生微生物檢測(cè)的特點(diǎn)及基本原則,3,4,1.衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)與醫(yī)學(xué)微生物檢驗(yàn)的區(qū)別與特點(diǎn) ? 2.樣品的采集原則 ？ 3.影響采樣代表性的因素有哪些？ 4.怎樣使采樣具有針對(duì)性？ 5.樣品采集后為什么要盡快送檢？ 6.怎樣保護(hù)樣品中的待檢微生物？ 7.樣品中抑菌物質(zhì) 去除方法有哪些？ 8.樣品的處理策略（目的）與方法 9.怎樣濃縮樣品中的微生物？ 10.環(huán)境中的微生物數(shù)量低，怎樣提高檢出率？,4,5,衛(wèi)生微生物檢測(cè)的特點(diǎn),1檢測(cè)的對(duì)象多 病原微生物+非致病和條件致病微生物 特別是能反映環(huán)境、食品、健康相關(guān)產(chǎn)品等樣品衛(wèi)生質(zhì)量的衛(wèi)生指示微生物。,5,6,2檢測(cè)的范圍廣，標(biāo)本的來(lái)源不僅局限于人體，也來(lái)源于空氣、水、食品等環(huán)境。,6,7,3檢測(cè)的方法更敏感，以檢測(cè)環(huán)境標(biāo)本中數(shù)量很低的致病微生物。 問(wèn)題：你知道哪些方法？你認(rèn)為什么方法更敏感？,7,8,4定量測(cè)定和分型檢測(cè)，以探明感染性疾病的傳染源、傳播途徑、流行情況等。,8,9,衛(wèi)生微生物檢測(cè)的基本原則,采集、保存、運(yùn)送、檢測(cè),9,10,總原則,生物安全 代表性/針對(duì)性 防污染 防殺菌 細(xì)標(biāo)記,10,11,生物安全,防人員感染：個(gè)人防護(hù)（？） 防標(biāo)本和環(huán)境的污染 ：無(wú)菌操作、恰當(dāng)處理污染廢棄物,11,裴曉方 xxpei,12,注意采樣的代表性,影響采樣代表性的因素包括: 采樣量 采樣部位 采樣時(shí)間 采樣的隨機(jī)性和均勻性 以及按批號(hào)抽樣,12,13,注意采樣的針對(duì)性,樣品種類(lèi) 恰當(dāng)時(shí)間 采樣量,13,14,避免采樣時(shí)外界微生物對(duì)樣品的新污染：所有采樣用具、容器需嚴(yán)格滅菌，并以無(wú)菌操作采樣。,14,15,避免采樣時(shí)對(duì)微生物的殺滅作用和引入新的抑菌物質(zhì)：如容器是否有消毒劑的殘留，或使用剛燒灼未冷卻的采樣工具。,15,裴曉方 xxpei,16,注意對(duì)樣品的詳細(xì)標(biāo)記： 樣品名稱(chēng) 編號(hào) 采樣時(shí)間 采樣者 檢測(cè)項(xiàng)目,16,2019/9/28,裴曉方 xxpei,17,樣品的運(yùn)送原則,盡快送檢 采集的樣品，應(yīng)在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)（一般不超過(guò)34小時(shí)）送到實(shí)驗(yàn)室，盡快送檢。 一方面可減少待測(cè)微生物的死亡。 另一方面可防止微生物的繁殖對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果的影響,17,2019/9/28,裴曉方 xxpei,18,保護(hù)待檢微生物,溫度調(diào)節(jié) 加入保護(hù)劑 去除其他不利于待測(cè)微生物生存的因素,18,2019/9/28,裴曉方 xxpei,19,pH 蛋白質(zhì) 抑制劑抑制非目的微生物 滲透壓 氣體,19,2019/9/28,裴曉方 xxpei,20,遵循完善的樣品交接制度,送往實(shí)驗(yàn)室的樣品，必須附有樣品送檢單，實(shí)驗(yàn)室收到樣品應(yīng)按送檢單逐項(xiàng)核對(duì)，檢查樣品是否符合檢驗(yàn)要求，確證無(wú)誤方可簽收待檢。,20,2019/9/28,裴曉方 xxpei,21,實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)原則,21,2019/9/28,裴曉方 xxpei,22,相應(yīng)的硬件條件和設(shè)備 具有合格的檢驗(yàn)人員 標(biāo)準(zhǔn)/公認(rèn)的檢驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制,22,環(huán)境,實(shí)驗(yàn)室環(huán)境不應(yīng)影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性 工作區(qū)與辦公區(qū)分開(kāi) 工作面積應(yīng)滿(mǎn)足檢驗(yàn)工作的需要 溫度、濕度、照度、噪聲和潔凈度等應(yīng)符合工作要求 整體布局應(yīng)采用單方向工作流程，避免交叉污染 一般樣品檢驗(yàn)：潔凈區(qū)（超凈工作臺(tái)或潔凈實(shí)驗(yàn)室） 病原微生物分離鑒定： BSL-2,23,2019/9/28,裴曉方 xxpei,24,應(yīng)有檢測(cè)不同病原菌的 相應(yīng)的條件和設(shè)備 微生物按其是否致病、致病力強(qiáng)弱、危害人體的嚴(yán)重性、傳染性的大小、當(dāng)?shù)厝巳旱拿庖咚健⒂袩o(wú)免疫制劑和特效治療藥物等可分成不同的危害等級(jí)。 在不同生物安全級(jí)別實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,24,2019/9/28,裴曉方 xxpei,25,實(shí)驗(yàn)室生物安全與管理 很重視 ?,25,2019/9/28,裴曉方 xxpei,26,病毒滅活不徹底引發(fā)實(shí)驗(yàn)室感染,2004北京、安徽發(fā)生非典疫情原因調(diào)查結(jié)果。調(diào)查組認(rèn)為，本起疫情來(lái)自中國(guó)疾控制中心實(shí)驗(yàn)室內(nèi)感染，而引起實(shí)驗(yàn)室感染的環(huán)節(jié)，是腹瀉病毒室工作人員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)SARS病毒滅活不徹底。,26,2019/9/28,裴曉方 xxpei,27,實(shí)驗(yàn)室生物安全與管理,生物危害 非工作人員嚴(yán)禁入內(nèi),27,2019/9/28,裴曉方 xxpei,28,實(shí)驗(yàn)室生物危害,在微生物和生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室研究過(guò)程中生物因子（病原微生物）對(duì)人、環(huán)境、生態(tài)和社會(huì)造成的危害和污染。,28,2019/9/28,裴曉方 xxpei,29,實(shí)驗(yàn)室生物安全,為了避免微生物和醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室中在進(jìn)行各種有危害或有潛在危害的生物因子活動(dòng)過(guò)程中，可能對(duì)人、環(huán)境和社會(huì)造成的危害或潛在危害，而采取的防護(hù)措施（硬件）和管理措施（軟件），達(dá)到對(duì)人、環(huán)境和社會(huì)的安全防護(hù)目的,29,2019/9/28,裴曉方 xxpei,30,微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全,主要考慮實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)，即實(shí)驗(yàn)室工作人員所處理的實(shí)驗(yàn)對(duì)象含有致病的微生物及其毒素時(shí)，通過(guò)在實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)建造、使用個(gè)體防護(hù)設(shè)施、嚴(yán)格遵從標(biāo)準(zhǔn)化的工作及操作程序和規(guī)程等方面采取綜合措施，確保實(shí)驗(yàn)室工作人員不受實(shí)驗(yàn)對(duì)象的感染，確保周?chē)h(huán)境不受實(shí)驗(yàn)對(duì)象的污染。,30,2019/9/28,裴曉方 xxpei,31,實(shí)驗(yàn)室生物安全級(jí)別,31,2019/9/28,裴曉方 xxpei,32,感染性微生物的危險(xiǎn)度等級(jí)分類(lèi),危害等級(jí)I (低個(gè)體危害，低群體危害) 不會(huì)導(dǎo)致健康工作者和動(dòng)物致病的細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲(chóng)等生物因子。 危害等級(jí) (中等個(gè)體危害，有限群體危害) 能引起人或動(dòng)物發(fā)病，但一般情況下對(duì)健康工作者、群體、家畜或環(huán)境不會(huì)引起嚴(yán)重危害的病原體。實(shí)驗(yàn)室感染不導(dǎo)致嚴(yán)重疾病，具備有效治療和預(yù)防措施，并且傳播風(fēng)險(xiǎn)有限。,32,2019/9/28,裴曉方 xxpei,33,感染性微生物的危險(xiǎn)度等級(jí)分類(lèi),危害等級(jí)III (高個(gè)體危害，低群體危害) 能引起人類(lèi)或動(dòng)物嚴(yán)重疾病，或造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，但通常不能因偶然接觸而在個(gè)體間傳播，或能使用抗生素、抗寄生蟲(chóng)藥治療的病原體。 危害等級(jí) (高個(gè)體危害，高群體危害) 能引起人類(lèi)或動(dòng)物非常嚴(yán)重的疾病，一般不能治愈，容易直接或間接或因偶然接觸在人與人，或動(dòng)物與人，或人與動(dòng)物，或動(dòng)物與動(dòng)物間傳播的病原體。,33,2019/9/28,裴曉方 xxpei,34,實(shí)驗(yàn)室可以分為,基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室 一級(jí)生物安全水平（BSL-1) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室 二級(jí)生物安全水平（BSL-2) 防護(hù)實(shí)驗(yàn)室 三級(jí)生物安全水平（BSL-3) 最高防護(hù)實(shí)驗(yàn)室 四級(jí)生物安全水平（BSL-4) 根據(jù)操作不同危險(xiǎn)度等級(jí)微生物所需的實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)特點(diǎn)、建筑構(gòu)造、防護(hù)設(shè)施、儀器、操作以及操作程序來(lái)決定實(shí)驗(yàn)室的生物安全水平。,34,2019/9/28,裴曉方 xxpei,35,傳染病分類(lèi)傳染病防治法,甲類(lèi)傳染病是指：鼠疫、霍亂。（2） 乙類(lèi)傳染病是指：傳染性非典型肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、脊髓灰質(zhì)炎、人感染高致病性禽流感、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、流行性乙型腦炎、登革熱、炭疽、細(xì)菌性和阿米巴性痢疾、肺結(jié)核、傷寒和副傷寒、流行性腦脊髓膜炎、百日咳、白喉、新生兒破傷風(fēng)、猩紅熱、布魯氏菌病、淋病、梅毒、鉤端螺旋體病、血吸蟲(chóng)病、瘧疾。（25）,35,2019/9/28,裴曉方 xxpei,36,傳染病分類(lèi) 傳染病防治法,丙類(lèi)傳染病是指：流行性感冒、流行性腮腺炎、風(fēng)疹、急性出血性結(jié)膜炎、麻風(fēng)病、流行性和地方性斑疹傷寒、黑熱病、包蟲(chóng)病、絲蟲(chóng)病，除霍亂、細(xì)菌性和阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉病、手足口病。（11） 對(duì)乙類(lèi)傳染病中傳染性非典型肺炎、炭疽中的肺炭疽和人感染高致病性禽流感，采取本法所稱(chēng)甲類(lèi)傳染病的預(yù)防、控制措施。,36,2019/9/28,裴曉方 xxpei,37,傳染病分類(lèi) ,根據(jù)病原微生物的傳染性、感染后對(duì)個(gè)體或者群體的危害程度，將病原微生物分為四類(lèi)： 第一類(lèi)病原微生物，是指能夠引起人類(lèi)或者動(dòng)物非常嚴(yán)重疾病的微生物，以及我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)或者已經(jīng)宣布消滅的微生物。 第二類(lèi)病原微生物，是指能夠引起人類(lèi)或者動(dòng)物嚴(yán)重疾病，比較容易直接或者間接在人與人、動(dòng)物與人、動(dòng)物與動(dòng)物間傳播的微生物。,病原微生物實(shí)驗(yàn)室 生物安全管理?xiàng)l例,37,2019/9/28,裴曉方 xxpei,38,傳染病分類(lèi) ,第三類(lèi)病原微生物，是指能夠引起人類(lèi)或者動(dòng)物疾病，但一般情況下對(duì)人、動(dòng)物或者環(huán)境不構(gòu)成嚴(yán)重危害，傳播風(fēng)險(xiǎn)有限，實(shí)驗(yàn)室感染后很少引起嚴(yán)重疾病，并且具備有效治療和預(yù)防措施的微生物。 第四類(lèi)病原微生物，是指在通常情況下不會(huì)引起人類(lèi)或者動(dòng)物疾病的微生物。 第一類(lèi)、第二類(lèi)病原微生物統(tǒng)稱(chēng)為高致病性病原微生物。,病原微生物實(shí)驗(yàn)室 生物安全管理?xiàng)l例,38,人員-食品微生物檢驗(yàn),具有微生物專(zhuān)業(yè)背景和相應(yīng)資質(zhì) 掌握生物安全知識(shí)和消毒知識(shí)，能夠理解并正確實(shí)施檢驗(yàn)（防止人為污染樣品、保護(hù)環(huán)境、自身安全） 顏色視覺(jué)障礙 涉及到辨色的實(shí)驗(yàn),39,2019/9/28,裴曉方 xxpei,40,具有合格的檢驗(yàn)人員 必須經(jīng)常接受專(zhuān)業(yè)技術(shù)培訓(xùn)， 掌握檢驗(yàn)項(xiàng)目的基本原理及技術(shù)方法 技術(shù)質(zhì)量考核：可用幾種基本技術(shù)作考核評(píng)價(jià)的指標(biāo)。細(xì)菌計(jì)數(shù)：可使用分散性和穩(wěn)定性好的枯草菌CMCC（B）63501株制作芽孢懸液。請(qǐng)幾名被試人員用直徑9cm10cm的普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，作表面涂沫接種計(jì)數(shù)，重復(fù)作5次，求平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，以標(biāo)準(zhǔn)差小，和顯微鏡直接計(jì)數(shù)折算值接近的為佳。生化試驗(yàn)重現(xiàn)性：用銅綠色假單胞菌CMCC（B）1012株，。模擬樣品檢出考核：選合適的基質(zhì)如奶粉，加入指標(biāo)菌，如普通變形桿菌CMCC（B）49001株?？己饲跋茸黝A(yù)備試驗(yàn)。指定檢驗(yàn)方法，確定檢出最小菌數(shù)。然后用最小菌數(shù)的5倍量、10倍量加入模擬基質(zhì)中，進(jìn)行檢出試驗(yàn)，從盲檢結(jié)果的正誤進(jìn)行評(píng)定。,40,2019/9/28,裴曉方 xxpei,41,采用標(biāo)準(zhǔn)/公認(rèn)的檢驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè),凡有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、部頒標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)檢查方法的均按標(biāo)準(zhǔn)方法檢驗(yàn)。沒(méi)有國(guó)家或部頒標(biāo)準(zhǔn)，按上級(jí)疾病預(yù)防控制中心的要求，參照共同協(xié)定的方法檢驗(yàn),41,2019/9/28,裴曉方 xxpei,42,加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制,儀器設(shè)備的質(zhì)控： 培養(yǎng)基、試劑的質(zhì)量控制： 消毒滅菌效果的控制： 建立良好的實(shí)驗(yàn)記錄制度： 建立良好的核查、校對(duì)制度 報(bào)告與核查制度,42,2019/9/28,裴曉方 xxpei,43,根據(jù)衛(wèi)生檢驗(yàn)的特點(diǎn)采取特殊措施,做好應(yīng)對(duì)突發(fā)事件的準(zhǔn)備 如果一個(gè)樣品需做多種分析，檢測(cè)微生物 優(yōu)先 樣品處理：均質(zhì)化、乳化后再行稀釋?zhuān)灰志镔|(zhì)去除；目的菌濃縮 (樣品的處理策略（目的）與方法?) 微生物的復(fù)蘇,43,2019/9/28,裴曉方 xxpei,44,避免微生物實(shí)驗(yàn)室感染,氣溶膠 避免微生物污染操作環(huán)境 作好培養(yǎng)廢棄物、用具和樣品等的處理 作好個(gè)人防護(hù),44,2019/9/28,裴曉方 xxpei,45,第二節(jié),衛(wèi)生指示微生物,45,2019/9/28,裴曉方 xxpei,46,指示微生物 indicator microorganism 是在常規(guī)衛(wèi)生監(jiān)測(cè)中，用以指示樣品衛(wèi)生狀況及安全性的（非致?。┪⑸铮ɑ蚣?xì)菌）。,46,2019/9/28,裴曉方 xxpei,47,分為四種類(lèi)型,菌落總數(shù)（細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)） 大腸菌群、糞鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌 其它指示菌：特定菌、某些致病菌 病毒（包括噬菌體）,47,2019/9/28,裴曉方 xxpei,48,選擇指示微生物的總原則,數(shù)量大易于檢出 檢驗(yàn)方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、方便 有一定的代表性，其數(shù)量變化能反映樣品衛(wèi)生狀況及安全性,48,2019/9/28,裴曉方 xxpei,49,衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)中最重要的指示微生物,大腸菌群 指示糞便污染,49,2019/9/28,裴曉方 xxpei,50,作為糞便污染指示菌的條件有哪些？,大量存在于人及溫血?jiǎng)游锬c道，未被糞便污染的樣品中無(wú)此種菌存在； 在外環(huán)境中的抵抗力，包括對(duì)消毒劑的抵抗力與腸道致病菌大致相似或稍強(qiáng)； 在外環(huán)境中不繁殖，存活時(shí)間與腸道致病菌大致相似或稍長(zhǎng)； 檢驗(yàn)方法簡(jiǎn)便，易于定量計(jì)數(shù)。,50,2019/9/28,裴曉方 xxpei,51,為什么常常通過(guò)檢測(cè)指示微生物 反映樣品衛(wèi)生安全性？,51,2019/9/28,裴曉方 xxpei,52,與人類(lèi)健康密切的樣品，如直接進(jìn)口的食品、飲用水，除檢測(cè)衛(wèi)生指示微生物外，還要求直接檢測(cè)某些致病菌如： 沙門(mén)菌 志賀菌 金黃色葡萄球菌,52,2019/9/28,裴曉方 xxpei,53,常用的指示微生物,53,2019/9/28,裴曉方 xxpei,54,菌落總數(shù)Aerobic Plate Count,概念：菌落總數(shù)是指被檢樣品的單位重量(g)、容積(ml)、表面積(cm2)或體積(m3)內(nèi)，所含有的能在某種培養(yǎng)基上經(jīng)一定條件、一定時(shí)間培養(yǎng)后長(zhǎng)出的菌落數(shù)量。以菌落形成單位數(shù)（colony forming unit ，cfu）表示。,54,2019/9/28,裴曉方 xxpei,55,種類(lèi)：菌落總數(shù)包括細(xì)菌菌落總數(shù)、霉菌菌落總數(shù)和酵母菌菌落總數(shù)。 衛(wèi)生學(xué)意義：用于判定檢樣被微生物污染的程度或動(dòng)態(tài)觀察，也是某些樣品的衛(wèi)生限量標(biāo)準(zhǔn)。 測(cè)定方法：常用標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法(standard plate-counting method)和表面涂布法（Spatula Method ）,55,2019/9/28,裴曉方 xxpei,56,標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法(standard plate-counting method),又稱(chēng)為 傾注平板計(jì)數(shù)法 At what temperature should pour plates be dispensed? Desired temperature is 45 ± 1°C.,56,生長(zhǎng)在固體培養(yǎng)基上，來(lái)源于一個(gè)?細(xì)胞，肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞群體。,57,2019/9/28,裴曉方 xxpei,58,58,菌落計(jì)算方法 （1）菌落計(jì)數(shù)方法 做平板菌落計(jì)數(shù)時(shí)，可用肉眼觀查，必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落總數(shù)。,59,（2）菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告 平板菌落數(shù)的選擇 選取菌落數(shù)在30300之間的平板作為菌落總數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)平板，應(yīng)采用兩個(gè)平板平均數(shù)，其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)。平皿內(nèi)如有鏈狀菌落生長(zhǎng)時(shí)（菌落之間無(wú)明顯界線），若僅有一條鏈，可視為一個(gè)菌落數(shù)；如果有不同來(lái)源的幾條鏈，則應(yīng)將每條鏈作為一個(gè)菌落計(jì)。,60,稀釋度的選擇 應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。若有兩上稀釋度，其生長(zhǎng)的菌落數(shù)均在30300之間，則視兩者之比如何來(lái)決定。若其比值小于或等于2，應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)；若大于2則報(bào)告其中較小的數(shù)字。 若所有稀釋度平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。 若所有稀釋度均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之。,61,若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300之間，其中一部分大于300或小于30時(shí)，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。 菌落數(shù)的報(bào)告 菌落數(shù)在100以?xún)?nèi)時(shí)，按其實(shí)有數(shù)報(bào)告，大于100時(shí)，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)，也可用10的指數(shù)來(lái)表示。,62,63,2019/9/28,裴曉方 xxpei,64,表面涂布法（ Spatula Method ）,傾注平板計(jì)數(shù)法,表面涂布法,64,2019/9/28,裴曉方 xxpei,65,65,2019/9/28,裴曉方 xxpei,66,糞便污染指示菌,大腸菌群（coliform group）：是一群能在3537C、24小時(shí)內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的、需氧或兼性厭氧的、革蘭陰性的無(wú)芽胞桿菌。是存在于人和溫血?jiǎng)游锬c道中的一大群菌。,66,2019/9/28,裴曉方 xxpei,67,主要包括：四個(gè)屬的菌 埃希氏菌屬(Escherichae) 克雷伯氏菌屬(Klebsiella) 腸桿菌屬(Enterobacter) 枸櫞酸桿菌屬（Citrobacter）,67,2019/9/28,裴曉方 xxpei,68,根據(jù)生長(zhǎng)溫度的差異，將能在37C生長(zhǎng)的稱(chēng)為總大腸菌群，而在44.5C仍能生長(zhǎng)的大腸菌群稱(chēng)為耐熱大腸菌群(thermo-tolerant coliform group) 或糞大腸菌群（faecal coliform Fc），耐熱大腸菌群的主要成員是埃希氏菌屬的菌。,68,2019/9/28,裴曉方 xxpei,69,大腸桿菌（Escherichae coli）：,普遍存在于人和動(dòng)物的腸道內(nèi)（新鮮糞便中每克可達(dá)109 CFU），近年來(lái)隨著測(cè)定新方法的發(fā)現(xiàn)和建立，大腸桿菌作為糞便污染的指示菌的應(yīng)用越來(lái)越多。 利用大腸桿菌產(chǎn)生的葡萄糖苷酸酶，分解吲哚葡萄糖苷酸，產(chǎn)生有色物質(zhì)，而使大腸桿菌菌落顯色，對(duì)大腸桿菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定。,69,2019/9/28,裴曉方 xxpei,70,作為糞便污染的指示菌，大腸桿菌檢出的意義最大，其次是耐熱大腸菌群，總大腸菌群的檢出意義略差一些。,70,GB/T 4789.3-2008大腸菌群MPN計(jì)數(shù),初發(fā)酵,復(fù)發(fā)酵,71,大腸菌群月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯發(fā)酵結(jié)果,初發(fā)酵,陽(yáng)性,陽(yáng)性,陽(yáng)性,陰性,72,復(fù)發(fā)酵,煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯,接種,樣本,陰性,陽(yáng)性,大腸菌群煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯發(fā)酵結(jié)果,73,08版大腸菌群MPN計(jì)數(shù)較03版的優(yōu)勢(shì)有：, 08版操作更簡(jiǎn)單，適合批量檢測(cè) 08版檢出的概率大 乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基基本上不具備修復(fù)已損傷的細(xì)胞的作用，而月桂基硫酸鹽胰蛋白胨則可以。 08版減少了人為的誤差 03版需要挑選菌落，受人主觀的影響很大，沒(méi)有挑對(duì)或挑取的不夠多都會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果，而08版采取增菌液接種，會(huì)減少假陰性。,74,GB/T 4789.3-2008新增大腸菌群平板計(jì)數(shù),平板計(jì)數(shù),證實(shí)試驗(yàn),75,典型菌落： 紫紅色，菌落周?chē)屑t色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大,大腸菌群在結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）上的生長(zhǎng)情況,76,GB/T 4789.3-2008新增大腸菌群PetrifilmTM測(cè)試片法,77,準(zhǔn)備PetrifilmTM測(cè)試片,接種1ml樣本液,緩慢蓋上上層膜,用壓板輕壓培養(yǎng)基,樣本接種結(jié)果,紅色有氣泡的菌落確認(rèn)為大腸菌群,78,大腸桿菌MPN計(jì)數(shù),初發(fā)酵,復(fù)發(fā)酵,伊紅美藍(lán)平板分離培養(yǎng),營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面或平板培養(yǎng),生化試驗(yàn),79,大腸桿菌VRB-MUG平板計(jì)數(shù)法,檢驗(yàn)時(shí)用已知MUG陽(yáng)性菌株（如大腸桿菌ATCC25922）和產(chǎn)氣腸桿菌（如ATCC13048）做陽(yáng)性和陰性對(duì)照,80,大腸桿菌PetrifilmTM測(cè)試片計(jì)數(shù)法,與大腸菌群PetrifilmTM測(cè)試片計(jì)數(shù)法方法一致 結(jié)果判讀 大腸桿菌 大腸菌群,藍(lán)色帶氣泡的菌落,紅色帶氣泡的菌落,81,2019/9/28,裴曉方 xxpei,82,糞鏈球菌 （fecal Strptococcus Fs）,82,2019/9/28,裴曉方 xxpei,83,產(chǎn)氣莢膜梭菌 （Clostirdia）,是一類(lèi)能還原亞硫酸鹽為硫化物、厭氧生長(zhǎng)的、革蘭陽(yáng)性梭狀芽胞桿菌。是人和動(dòng)物，特別是食草動(dòng)物腸道內(nèi)的常住菌，數(shù)量少于大腸桿菌，每克糞便約為105106。由于該菌能形成芽孢，對(duì)含氯消毒劑及外界不良環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗力，在外環(huán)境中存活時(shí)間較長(zhǎng)。所以若樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌被大量檢出而大腸菌群數(shù)量很少時(shí)，則表示樣品曾受過(guò)糞便污染，即有陳舊性污染。常被作為水或土壤衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中的指標(biāo)菌。,83,2019/9/28,裴曉方 xxpei,84,其它指示微生物,（1）不得檢出的致病菌 （2）腸道病毒的指標(biāo)微生物 1）大腸桿菌噬菌體f2(coli phage) 2）脊髓灰質(zhì)炎病毒(polio virus)減毒疫苗株I,84,2019/9/28,裴曉方 xxpei,85,第三節(jié)衛(wèi)生微生物研究和檢測(cè)的方法,85,2019/9/28,裴曉方 xxpei,86,衛(wèi)生微生物樣品特點(diǎn)： 目的菌數(shù)量低 細(xì)菌受損 雜菌多,數(shù)量低濃縮 細(xì)菌受損復(fù)蘇 雜菌多選擇性增菌和分離,86,2019/9/28,裴曉方 xxpei,87,（一）樣品處理,1樣品混勻： 2樣品濃縮：,87,2019/9/28,裴曉方 xxpei,88,（一）樣品處理,1樣品混勻：液體樣品常通過(guò)電動(dòng)、手搖或敲打震蕩，使之混勻；固體樣品需通過(guò)置滅菌乳缽內(nèi)研磨均勻，或于高速組織搗碎機(jī)或勻漿器中在少量液體存在下，搗碎混勻后再取樣，或使用商品化的均質(zhì)器混合待檢樣品。,88,2019/9/28,裴曉方 xxpei,89,2樣品濃縮：,常用的樣品濃縮方式有 沉淀法 過(guò)濾法 吸附法,89,2019/9/28,裴曉方 xxpei,90,（1）沉淀法：細(xì)菌可通過(guò)普通離心機(jī)離心沉淀而濃縮，或者通過(guò)差速離心，去除雜質(zhì)，收集菌體，達(dá)到濃縮的目的。病毒濃縮需采用高速或超速離心機(jī)。,90,2019/9/28,裴曉方 xxpei,91,91,2019/9/28,裴曉方 xxpei,92,92,2019/9/28,裴曉方 xxpei,93,93,2019/9/28,裴曉方 xxpei,94,（2）過(guò)濾法：是將樣品在負(fù)壓或正壓作用下，通過(guò)孔徑為0.45m的濾膜，細(xì)菌被阻留在膜上，而達(dá)到濃縮的目的。樣品中的病毒可通過(guò)膜的靜電吸附濃縮。過(guò)濾法不但可濃縮微生物，還可消除樣品中的抑制劑對(duì)后續(xù)培養(yǎng)的影響。,94,2019/9/28,裴曉方 xxpei,95,95,2019/9/28,裴曉方 xxpei,96,96,2019/9/28,裴曉方 xxpei,97,97,2019/9/28,裴曉方 xxpei,98,98,2019/9/28,裴曉方 xxpei,99,99,2019/9/28,裴曉方 xxpei,100,（3）吸附沉淀法：可分為特異性和非特異性吸附兩類(lèi)。非特異性吸附如利用加入化學(xué)制劑，形成沉淀，細(xì)菌被共沉淀的方法；而特異性吸附則是利用配體與受體的親和力，吸附待檢微生物，如為濃縮檢樣中的流感病毒，利用該病毒具有血凝素，可與紅細(xì)胞結(jié)合的特點(diǎn)，將檢品中加入紅細(xì)胞吸附病毒，低速離心收集紅細(xì)胞，而達(dá)到濃縮病毒的目的。,100,2019/9/28,裴曉方 xxpei,101,（二）損傷菌的復(fù)蘇,環(huán)境樣品中的微生物，因經(jīng)受冷、熱、脫水干燥、輻照、高滲透壓或消毒劑的作用，可能引起亞致死性損傷，受損傷的微生物用一般的培養(yǎng)方法不易培養(yǎng)，需預(yù)先進(jìn)行復(fù)蘇（resuscitation）或修復(fù)（repair）后，才能進(jìn)行常規(guī)的檢測(cè)。修復(fù)的基本方法是在細(xì)菌繁殖之前，將其置于無(wú)選擇性壓力的培養(yǎng)環(huán)境中，一般降低培養(yǎng)溫度培養(yǎng)一定時(shí)間后，再進(jìn)行常規(guī)檢驗(yàn)。,101,2019/9/28,裴曉方 xxpei,102,（三）選擇性增菌與分離,1物理方法：主要通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)的溫度、氣體條件和光照，進(jìn)行選擇性增菌與分離的方法。 2化學(xué)方法：利用目的微生物的特定生理功能在分離培養(yǎng)基中加入抑制其他微生物生長(zhǎng)和顯示目的微生物的化學(xué)制劑，配制成選擇性鑒別培養(yǎng)基，達(dá)到對(duì)目的微生物增菌分離的目的。學(xué)習(xí)后應(yīng)能舉例說(shuō)明。,102,2019/9/28,裴曉方 xxpei,103,（四）定量計(jì)數(shù)方法,1傾注平板計(jì)數(shù)法 2表面涂布計(jì)數(shù)法 3MPN法：即最可能數(shù)法(most probable number, MPN) 4其它方法：包括顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、比濁計(jì)數(shù)法、微菌落快速計(jì)數(shù)法、生化方法間接推算微生物量，以及半定量法（semi-quantitative method）等。,103,2019/9/28,裴曉方 xxpei,104,分型鑒定的方法,噬菌體分型 細(xì)菌素分型 耐藥譜分型 血清學(xué)分型 質(zhì)粒圖譜分型,104,2019/9/28,裴曉方 xxpei,105,其他方法,微生物鑒定系統(tǒng) 免疫 核酸雜交 PCR G+C含量 基因芯片 蛋白質(zhì)芯片,105,2019/9/28,裴曉方 xxpei,106,第四節(jié) 衛(wèi)生微生物研究 和檢測(cè)方法的前景,106,