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DNA重組技術、轉基因技術,生物體外,基因,DNA分子水平,人類需要的新的生物類型或生物產品,基因重組,一、基因工程的概念,優(yōu)點：,克服遠緣雜交不親和的障礙,定向改造生物的遺傳性狀,與雜交育種相比,與誘變育種相比,1,1．基因拼接的理論基礎（從結構上分析，為什么不同生物的DNA能夠重組?） (1)DNA的基本組成單位都是四種脫氧核苷酸。 (2)雙鏈DNA分子都是規(guī)則的雙螺旋結構。,一、基因工程誕生的理論基礎,2．外源基因在受體內表達的理論基礎 (1)基因是控制生物性狀的獨立遺傳單位。 (2)遺傳信息的傳遞都遵循中心法則。 (3)生物界共用一套遺傳密碼。（遺傳密碼破譯）,2,識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。(6個,4、5、8個),（2）作用：,（4）結果：,形成兩種末端,1、限制酶——“分子手術刀”（小結）,切割作用是在DNA分子內部進行的，故名限制性核酸內切酶。,磷酸二酯鍵,大本 考向對練 （2）書寫,3,限制酶存在于原核生物中的作用是什么?,思考,原核生物容易受到外源DNA的入侵 限制酶的作用:切割外源DNA,使之失效,限制酶為什么不會剪切原核生物本身的DNA?,思考,防御機制,1.原核生物中不存在該酶的識別序列,2.識別序列被修飾，讓限制酶不能切割 如在甲基化酶 的作用下把甲基轉移到堿基上,,4,要想獲得某個特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產生幾個黏性末端？,提問,要切兩個切口，產生四個黏性末端。,如果把限制酶來切割的黏性末端能相連，那么這兩種酶必須滿足的條件是？,這兩種酶切割的片段會產生相同的黏性末端，,雙酶切指用兩種限制酶分別切割切割目的基因和載體，這樣做的優(yōu)點是？,防止目的基因和載體的自身環(huán)化，并防止目的基因的反向連接，從而確保目的基因定向插入到特定位置,5,2.“分子縫合針”————DNA連接酶,(2)分類 注意書寫,,E.Coli DNA連接酶,T4 DNA連接酶,想一想:DNA連接酶與DNA聚合酶功能的異同？,(1)來源： (2)作用：,(1)來源： (2)作用：,(1)作用：,恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。,大腸桿菌 “縫合”黏性末端,T4噬菌體 “縫合”黏性末端和平末端,6,DNA連接酶與DNA聚合酶功能的異同,,將單個核苷酸連接到 已有的核酸片段上。,形成磷酸二酯鍵,以一條DNA鏈為模板。,將兩個雙鏈DNA片段之間的切口連接起來。,不需要模板。,7,為什么要用載體？,3. “分子運輸車” —基因進入受體細胞的載體：,1、無法復制（原因） 2、無法表達（原因） 3、目的基因是否進入到受體細胞需要借助于載體上的標記基因簡單快速的檢測出來。 4、基因直接進入細胞的概率很低；,8,作為載體必須具備哪些條件,1）能夠在受體細胞中復制，使目的基因穩(wěn)定存在。 2）具一至多個限制酶切點，以便外源基因插入。 3）具有某些標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。,9,天然的DNA分子可以直接作為載體嗎？為什么？ 1、載體DNA必須具備自我復制能力 2、載體DNA必須具備一到多個合適的酶切位點供目的基因插入。 3、載體DNA必須帶有標記基因。 4、載體DNA必須安全并大小合適。 實際上天然的DNA并不完全具備上述條件，都要進行人工改造。,10,一.目的基因的獲取,1、目的基因主要是指 ____________________也可以是一些具有調控作用的因子。,編碼蛋白質的結構基因,3、常用方法：,,人工合成法,,反轉錄法,化學合成法,利用PCR技術擴增,從基因文庫中獲取,2、獲得途徑,,從自然界已有物種中分離,人工方法合成,11,基因文庫,,基因組文庫,部分基因文庫 （如:cDNA文庫）,基因文庫？,(1) 從基因文庫中獲取目的基因,將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫,12,基因組文庫與cDNA文庫的比較P10表,小,大,有,無,有,無,某種生物的全部基因,某種生物的部分基因,部分基因可以,可以,13,（2）利用PCR技術擴增目的基因,1、定義：PCR——多聚酶鏈式反應 是一項生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。 通過此技術，可獲取大量的目的基因。,DNA復制,2、原理：,3、條件：,4、過程：,一段已知目的基因的核苷酸序列,一對引物；模板DNA；dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）；熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；,6、儀器：,PCR擴增儀,根據(jù)這一序列設計相應的引物,為什么？,14,PCR反應過程,PCR擴增時，退火溫度的設定是成敗的關鍵。 退火溫度過高會破壞_________的堿基配對。退火溫度的設定與引物長度、堿基組成有關， 長度相同但____________的引物需要設定更高的退火溫度。,引物與模板 GC含量高,15,（3）人工合成 原理 （2條？）,反轉錄法：,目的基因的mRNA,雜交雙鏈 (單鏈RNA/單鏈DNA),單鏈DNA,逆轉錄酶,,,,DNA聚合酶,雙鏈DNA (cDNA),根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,蛋白質的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的脫氧核苷酸序列,推測,推測,,,目的基因,化學合成,,16,3.基因表達載體的組成：,a、目的基因,b、啟動子,c、終止子,d、標記基因 為什么不能將基因直接導入受體細胞？,,位于基因的首端,是RNA聚合酶識別和結合位點。,位于基因的尾端,終止轉錄。,鑒別并篩選含有目的基因的受體細胞。,2、基因表達載體的作用,,a、使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代,b、同時使目的基因能表達和發(fā)揮作用,17,三、將目的基因導入受體細胞,目的基因進入_____ ____內，并且在受體細胞內維持_ ___和___ __的過程。,轉化:,受體細胞,穩(wěn)定,表達,1、導入植物細胞:,2、導入動物細胞:,3、導入微生物細胞:,常用方法：,農桿菌轉化法、基因槍法、花粉管通道法,顯微注射法,感受態(tài)細胞法（或Ca2+轉化法）,18,1、將目的基因導入植物細胞,（1）農桿菌轉化法,特點:,,能感染雙子葉植物和祼子植物,對單子葉植物無感染能力,Ti質粒的T—DNA可轉移至受體細胞并整合到其染色體DNA上,,轉化過程:,Ti質粒 目的基因,構建,表達載體,植物細胞,植物細胞染色DNA,新性狀,農桿菌,農桿菌的作用？,19,3、將目的基因導入微生物細胞,常用法：,常用受體細胞：大腸桿菌,微生物作受體細胞原因： 繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少,過程：,Ca2+處理大腸桿菌,,感受態(tài)細胞,,表達載體與感受態(tài)細胞混合,,感受態(tài)細胞吸收DNA,（用Ca2+處理，增加細菌細胞壁的通透性）,,感受態(tài)細胞法（或Ca2+轉化法）,為什么把大腸桿菌處理成 感受態(tài)細胞？,20,(1)________________→目的基因的有無， 。。關鍵 (2)分子雜交技術→_________________ 是否發(fā)揮作用的第一步 (3)_______________→目的基因是否翻譯 (4)生物性狀的表達與否 抗蟲抗病接種實驗抗逆實驗，蛋白質功能活性的比較(個體水平),DNA分子雜交技術,目的基因是否轉錄,抗原—抗體雜交,,分子水平,四、目的基因的檢測與鑒定 每項技術原理是什么？,21,檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因,1、導入檢測,目的：,方法：,DNA分子雜交技術,過程：,①.首先取出轉基因生物的基因組DNA ②.將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針。 ③使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明目的基因已插入染色體DNA中,四、目的基因的檢測與鑒定,22,從轉基因生物中提取的基因組DNA,探針：,雜交的對象：,用放射性同位素標記的含目的基因的DNA片段,15N,15N,14N,探針,轉基因生 物的DNA,變性,變性,,,,,,,14N,,,,23,2、轉錄檢測,目的：,檢測目的基因是否轉錄出了mRNA,方法：,分子雜交技術,用放射性同位素標記的含目的基因的 DNA片段,探針：,雜交的對象：,從轉基因生物中提取的mRNA.,24,3、翻譯檢測,目的：,檢測目的基因是否翻譯成蛋白質,方法:,抗原抗體雜交技術,從轉基因生物中提取的蛋白質,抗原：,抗體：,將目的基因編碼的蛋白質注射進動物體內進行免疫產生的相應抗體,4、個體生物學水平的鑒定,25,課本24 用于基因治療的基因種類 ①正?；颍簭慕】等梭w上分離得到的功能正常的基因，用以取代病變基因，或依靠其表達產物。 ②反義基因。即通過產生的mRNA分子，與病變基因產生的mRNA 進行互補，來阻斷非正常蛋白質的合成。 ③自殺基因：即編碼可以殺死癌變細胞的蛋白酶基因。,26,(4)對天然蛋白質進行改造，應該直接對蛋白質分子進行操作，還是通過對基因的操作來實現(xiàn)？______________________。 原因是：________________________________。,應該通過對基因的操作來實現(xiàn)對天然蛋白質的改造,首先，天然蛋白質都是由基因編碼的，改造了基因也就是對蛋白質進行了改造，而且改造過的蛋白質可以通過改造過的基因遺傳下去。 如果對蛋白質直接改造，一方面蛋白質空間結構復雜，改造困難，即使改造成功，被改造過的蛋白質分子也無法遺傳；其次，對基因進行改造比對蛋白質直接進行改造要容易操作，難度要小得多。,27,①獲取目的基因（例如血清白蛋白基因） ②構建基因表達載體（在血清白蛋白基因前加特異表達的啟動子） ③顯微注射導入哺乳動物受精卵中 ④形成胚胎 ⑤將胚胎送入母體動物 ⑥發(fā)育成轉基因動物（只有在產下的雌性個體中，轉入的基因才能表達）。,思考:用基因工程技術實現(xiàn)動物乳腺生物反應器來生產人類血清白蛋白的操作過程是怎樣的？,乳腺生物反應器的優(yōu)點：①產量高；②質量好； ③成本低；④易提取。,,28,