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擬攻讀博士學(xué)位計(jì)劃書 ——定鞭金藻（Haptophytes）在中國典型海域的群落結(jié)構(gòu)及其生態(tài)學(xué)功能 目 錄 第一部分：對(duì)國內(nèi)外現(xiàn)有研究的認(rèn)識(shí)............................................................................................ 1 1、引言（Introduction）........................................................................................................... 1 1.1 海洋微型生物生態(tài)學(xué)概述（Summary on Marine Microbial Ecology）................ 1 1.2 定鞭金藻門類（Taxonomy of Haptophyta）............................................................ 2 2、定鞭金藻的研究現(xiàn)狀（Research Status of Haptophytes）............................................... 4 2.1 定鞭金藻的代表性物種（Typical Species of Haptophytes）.................................. 4 2.2 定鞭金藻有害藻華的毒理學(xué)機(jī)制及其他環(huán)境效應(yīng)（Toxicological Mechanisms on Harmful Algae Blooms for Haptophytes and Other Environmental Effects）..................7 2.3 顯 微 技 術(shù) 、 流 式 細(xì) 胞 技 術(shù) 及 分 子 生 物 學(xué) 技 術(shù) 等 在 定 鞭 金 藻 研 究 中 的 應(yīng) 用 （Application of Microtechnique, Flow Cytometry and Molecular Biotech- nologies Etc. for Haptophytes Research）............................................................................................... 9 2.4 生態(tài)（毒理）學(xué)在定鞭金藻研究中的應(yīng)用（Application of Eco-(Toxico-)logy for Haptophytes Research）...................................................................................................11 2.5 生 物 信 息 學(xué) 在 定 鞭 金 藻 研 究 中 的 應(yīng) 用 （ Application of Bioinformatics for Haptophytes Research）...................................................................................................12 3、定鞭金藻的研究意義及展望（Research Meanings and Future Research for Haptophytes） ................................................................................................................................................... 14 第二部分：讀博工作安排與預(yù)期目標(biāo).......................................................................................... 15 參考文獻(xiàn)：....................................................................................................................................... 17 第 20 頁 共 22 頁 第一部分：對(duì)國內(nèi)外現(xiàn)有研究的認(rèn)識(shí) 1、引言（Introduction） 1.1 海洋微型生物生態(tài)學(xué)概述（Summary on Marine Microbial Ecology） 海洋微型生物生態(tài)學(xué)是一門新興學(xué)科，是科學(xué)技術(shù)高速發(fā)展的產(chǎn)物。它將地 球上最大的“海洋”與最小的“微型生物”通過“生態(tài)學(xué)”聯(lián)系起來，實(shí)現(xiàn)了宏 觀與微觀的耦合（陳宜瑜院士語）。近 20 年來，新方法、新技術(shù)在海洋領(lǐng)域的應(yīng) 用導(dǎo)致了一系列有關(guān)微型生物的重大發(fā)現(xiàn)，推動(dòng)了學(xué)科的形成和迅速發(fā)展[1]。 自上世紀(jì) 70 年代以來，人們不斷加深了對(duì)海洋微型生物的認(rèn)識(shí)，新生的理 論與認(rèn)識(shí)在傳承經(jīng)典的同時(shí)，也時(shí)常出現(xiàn)“打破”或“顛覆”式的超越（圖 1）。 海洋微型生物是地球上的第一批“居民”，是改造地球環(huán)境的先鋒。從古至今， 海洋微型生物都在為調(diào)節(jié)全球變化默默無聞地工作著。在這個(gè)過程中，海洋微型 生物是生物量和生產(chǎn)力的主要貢獻(xiàn)者，是生命和非生命系統(tǒng)聯(lián)系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是 生源要素循環(huán)的重要驅(qū)動(dòng)力[1, 2]。然而，人們對(duì)海洋微型生物的認(rèn)識(shí)還非常有限， 已經(jīng)研究過的海洋微型生物不到總量的 1%[3]。 圖 1 海洋微型生物（微型生物生態(tài)學(xué)）研究進(jìn)程 Fig.1 Research process for Marine Microbes (Microbial Ecology) 由圖 1 可知，每一重要理論的認(rèn)識(shí)都是通過某些代表性的海洋微型生物（往 往是整個(gè)類群的研究）實(shí)現(xiàn)的，從而推動(dòng)了海洋環(huán)境，乃至全球環(huán)境的研究。因 此，對(duì)典型的海洋微型生物的環(huán)境行為﹑效應(yīng)等進(jìn)行深入研究有重要價(jià)值。 1.2 定鞭金藻門類（Taxonomy of Haptophyta） 定鞭金藻（Prymnesiophyceae），又稱為土棲藻或普林藻，因其具有附著鞭毛 （Haptonema），20 世紀(jì) 50 年代前后通常稱其為觸絲藻（Haptophyceae）。在早期 分類中，定鞭金藻是從金藻綱（Chrysophyceae）中分離出來的一個(gè)獨(dú)立類群（因 其色素體帶黃色）[4]。直到 1962 年，Christensen 才將其定為金藻門（Chrysophyta） 的一個(gè)綱，即定鞭金藻綱（Prymnesiophyceae）（如圖 2-①）[5]。但將定鞭金藻從 金藻門中獨(dú)立出來，“自立”定鞭金藻門（Haptophyta），經(jīng)歷了一個(gè)比較復(fù)雜的 歷史分類過程。以定鞭金藻門、顆石藻目（Coccolithales）藻類為例，20 世紀(jì)初 期，顆石藻只是一個(gè)屬（Coccolithophoridae）；同時(shí)，具有兩條規(guī)則鞭毛的海藻 都?xì)w屬于等鞭金藻目（Isochrysidales），并因其會(huì)產(chǎn)生棕黃色的色素體而被歸于 金藻綱中。這種分類忽略了其他具有兩條規(guī)則鞭毛的金藻。此后，又發(fā)現(xiàn)了另一 種含有 3 條（類）鞭毛（兩條為鞭毛-flagella，另一條為頂鞭絲-haptonema（捕食 作用） 的微藻，并將其歸入為 Prymnesiaceae 科中。20 世紀(jì)中葉，一個(gè)新屬微 藻（巴夫藻屬-Pavlova）被發(fā)現(xiàn)，因其具有“第三條”鞭毛而被歸入 Prymnesiaceae 中。20 年后，有更多的種被歸入巴夫藻屬，從而新立了一個(gè)科——巴夫藻科 （Pavlovaceae）；20 世紀(jì)中葉的另一個(gè)重要突破是定鞭金藻的結(jié)構(gòu)得到了闡釋， 且在淡水和海域都發(fā)現(xiàn)了它的蹤跡。至此，形成了 1 目 2 綱——等鞭金藻目 （Isochrysidales）、定鞭金藻綱（Prymnesiaceae）和巴夫藻目（Pavlovaceae），并 組成了一個(gè)門（class）——定鞭金藻門（Haptophyta）。此后的超微結(jié)構(gòu)觀察顯示， 以上各類微藻都屬于粘著性植物（haptophytes），結(jié)合亞分子研究，說明以上分 類在形態(tài)學(xué)上是合理的[6]。 根據(jù)定鞭金藻鞭毛的規(guī)則性，此后又將含有規(guī)則鞭毛的藻類歸入定鞭金藻類 群 ， 而 將 不 規(guī) 則 鞭 毛 微 藻 歸 入 巴 夫 藻 類 群 ， 即 成 立 了 定 鞭 金 藻 綱 （Prymnesiophyceae）和巴夫藻綱（Pavlovophyceae）（圖 2▲）?？紤]到顆石藻類 群具有超過 15 個(gè)現(xiàn)存屬和 30 多個(gè)化石屬，而等鞭金藻、定鞭金藻和棕囊藻類群 屬較少（不超過 4 個(gè)），因此成立了 4 個(gè)目——定鞭金藻目（Prymnesiales）、顆 石藻目（Coccolithales）、棕囊藻目（Phaeocystales）和等鞭金藻目（Isochrysidales） （如 2★）。雖然自 1976 年 Hibberd 將定鞭金藻獨(dú)立為一個(gè)門（Haptophyta）以 來，對(duì)其分類有了較系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，但將定鞭金藻定義為一個(gè)綱（Haptophyceae） 的情況仍有出現(xiàn)[7, 8]。而我國對(duì)定鞭金藻的分類比較不統(tǒng)一，如胡鴻鈞等[9]已將 定鞭金藻獨(dú)立為一門，但王立等[10]仍將定鞭金藻綱中的三毛金藻屬（Primnesium） 和等鞭金藻屬（Isochrysis）歸于金藻門，對(duì)于巴夫藻類群的歸屬問題在藻類學(xué)著 名專著《中國淡水藻類——系統(tǒng)、分類和生態(tài)》中也未曾收錄[9]。顆石藻目微藻 種群數(shù)量與定鞭金藻綱很接近，但 4 目分類已經(jīng)應(yīng)用了 30 多年，因此上述分類 仍舊是當(dāng)前的分類基礎(chǔ)[6]（如圖 2 所示）。 圖 2 定鞭金藻系統(tǒng)分類示意圖 Fig.2 Schematic diagram for systematic classification of Haptophyta 2、定鞭金藻的研究現(xiàn)狀（Research Status of Haptophytes） 2.1 定鞭金藻的代表性物種（Typical Species of Haptophytes） 定鞭金藻門下屬兩個(gè)綱，共5個(gè)目。其共有特點(diǎn)是：單細(xì)胞或群體，具周質(zhì) 膜，有2條等長的鞭毛（及一條頂鞭絲），色素體2個(gè)，帶狀，有的細(xì)胞壁具有碳 酸鈣小片。生殖時(shí)細(xì)胞縱裂，或產(chǎn)生2條鞭毛的游動(dòng)孢子。在淡水或海水中都有 分布種類。巴夫藻目和定鞭金藻目的主要區(qū)別是前者的鞭毛是不規(guī)則的，且含有 眼壺（eyespot）及類瘤體結(jié)構(gòu)（knob-like body），同時(shí)，二者的分子生物學(xué)差異 也得到了證實(shí)[6]。巴夫藻目的代表性物種是綠色巴夫藻（Pavlova viridis）和路氏 巴夫藻（Pavlova lutheri），其典型特征是定鞭絲不能彎曲，而定鞭金藻目如小定 鞭金藻（Prymnesium parvum）和三毛金藻（Prymnesium parvum Cater）的定鞭絲 可以彎曲，且較發(fā)達(dá)，這對(duì)其占據(jù)優(yōu)勢的生態(tài)位有重要作用。定鞭絲極度退化的 兩個(gè)類群是顆石藻目和等鞭金藻目微藻，前者的原生質(zhì)外有鱗片，如赫氏顆石藻 （Emiliania huxleyi）和鈣板金藻（Calcidiscus leptoporus）；而后者的細(xì)胞裸露， 原生質(zhì)外無鱗片，鞭毛等長，如等鞭金藻（Isochrysis zhanjiangesis，Isochrysis Parke 等）和叉鞭金藻（Dicrateria zhanjiangesis，Dicrateria inornata，Dicrateria Parke 等）。棕囊藻屬最早由Hariot于1892年在Pouchet發(fā)現(xiàn)，目前主要將其分為6類： Phaeocystis pouchetii、Phaeocystis globosa、Phaeocystis scrobiculata、Phaeocystis antarctica、Phaeocystis cordata、Phaeocystis Jahnii[11]，主要分布于南、北兩極及 寒、溫帶[12]（如圖3所示，圖片來源于NCBI數(shù)據(jù)庫[13]）。其中，路氏巴夫藻、等 鞭金藻是主要的海洋經(jīng)濟(jì)微藻[14]。 1 2 A B C D E A.1&2 路氏巴夫藻 Pavlova lutheri；B.1&2 小定鞭金藻 Prymnesium parvum；C. Coccolithophore sp.； D.1 等鞭金藻 Isochrysis、2 叉鞭金藻 Dicrateria；E.1 Phaeocystis sp. Cells、2 Phaeocystis globosa 圖 3 定鞭金藻的代表性物種 Fig.3 The typical species of Haptophytes 2.2 定鞭金藻有害藻華的毒理學(xué)機(jī)制及其他環(huán)境效應(yīng)（Toxicological Mechanisms on Harmful Algae Blooms for Haptophytes and Other Environmental Effects） 2.2.1 有害藻華 有害藻華（Harmful Algae Blooms，HABs）事件通常發(fā)生于低海拔的上升流 區(qū)域（upwelling regions）[15]，是由近海藻類種群密度過高而致，且常伴隨著毒 素的釋放。這會(huì)造成當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)破壞，經(jīng)濟(jì)受損，同時(shí)會(huì)對(duì)旅游業(yè)﹑養(yǎng)殖業(yè)及水域 管理造成不可估量的損失[16]。自 Chrysochromulina polylepis 藻華首次（1988 年） 在歐洲爆發(fā)以來，人們開始了對(duì) HABs 的關(guān)注[17]。 有害藻華的發(fā)生，主要是綠藻門（Chlorophyta）﹑藍(lán)藻門（Cyanophyta）﹑ 硅藻門（Bacillariophyta）、金藻門（Chyosophyta）、定鞭金藻門（Haptophyta）和 甲藻門（Pyrrophyta）的代表性物種單獨(dú)或混合作用的結(jié)果。其中，銅綠微囊藻 （ Microcystis aeruginosa ）、 魚 腥 藻 （ Anabaena sp. ）、 漢 氏 菱 形 藻 （ Nitzschia hantzschiana ）、 小 等 刺 硅 鞭 藻 （ Dictyocha fibula ）、 小 定 鞭 金 藻 （ Prymnesium parvum）和薄甲藻（Glenodinium pulvisculus）是六大門類的代表性物種[18]。對(duì)各 代表性藻類進(jìn)行研究，是實(shí)現(xiàn)有害藻華防治的理論依據(jù)，也是海洋微型生物生態(tài) 學(xué)在海洋環(huán)境研究及全球氣候變化監(jiān)測等領(lǐng)域的重要內(nèi)容之一。 2.2.2 有害藻華的爆發(fā)及毒理學(xué)機(jī)制 藻華發(fā)生時(shí)的有害性主要有兩種情況：釋放毒性物質(zhì)或因藻群繁殖而大量消 耗 水 體 的 溶 解 氧 [19] 。 據(jù) 報(bào) 道 顯 示 ， 顆 石 藻 （ Emiliania huxleyi 和 Calcidiscus leptoporus）和棕囊藻（Phaeocystis sp.：P. pouchetii-北極洲，P. globosa-熱帶和亞 熱帶海域和 P. Antarctica-南極洲）是有害藻華爆發(fā)的主要定鞭金藻類群[15, 20]。通 常認(rèn)為，有害藻華的發(fā)生與光照和溫度[21-23]、鹽度[22, 24]、N/P 濃度與比例[23, 25-29] 有關(guān)，甚至還會(huì)受水體中病毒數(shù)量、活性等的影響[30]。 目前，對(duì)棕囊藻有害藻華的爆發(fā)研究比較深入。該藻自身具有毒性，危害較 大。首先，該藻球形群體外圍具有一層柔軟的膠質(zhì)被且藻體含多糖，當(dāng)大量繁殖 形成赤潮時(shí)，含膠質(zhì)和糖的藻體便緊緊貼在魚鰓上。影響魚的呼吸和攝食，致使 魚類窒息，缺氧而死亡。其次，該藻巨大的生物量（尤其是黎明和傍晚時(shí)）可造 成水體缺氧導(dǎo)致災(zāi)害。再加上藻體和藻細(xì)胞死亡腐爛后會(huì)產(chǎn)生溶血毒素等有毒物 質(zhì)，對(duì)水體環(huán)境的破壞將持續(xù)一定時(shí)間，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致魚類大面積死亡，尤其對(duì) 網(wǎng)箱養(yǎng)殖和對(duì)蝦育苗危害更大。2012 年，南極海域出現(xiàn)大面積海藻爆發(fā)，美國 宇航局“大地”衛(wèi)星上搭載的 Modis 設(shè)備拍攝到數(shù)張圖像?？茖W(xué)家分析造成這次 事故的主要是棕囊藻[31] 。研究較多的另一有害藻華爆發(fā)種是小定鞭金藻（P. parvum）。研究表明，其生長和爆發(fā)與生態(tài)環(huán)境有重要關(guān)系。其中，水體鹽度與 溫度是兩個(gè)主要因素。當(dāng)鹽度在 0.3-3.0%，溫度在 5-30℃時(shí)，P. parvum 易對(duì)其 他水生動(dòng)植物產(chǎn)生危害[22, 24]。有研究認(rèn)為，鹽度在 4.0-8.0 ppt 時(shí) P. parvum 易達(dá) 到生長峰值[32]，而溫度為 15-24℃時(shí)會(huì)發(fā)生藻華[33]。 有 害 藻 華 的 爆 發(fā) 與 其 對(duì) 其 他 生 物 的 毒 害 作 用 往 往 是 一 個(gè) 同 步 過 程 。 以 Prymnesium parvum 為例，當(dāng)環(huán)境發(fā)生改變時(shí)（主要是受食物源的影響），P. parvum 會(huì)根據(jù)不同的環(huán)境條件作出不同的響應(yīng)。環(huán)境中是否存在可供光合生長利用的無 機(jī) N/P 是決定 P. parvum 是否會(huì)大量繁殖并產(chǎn)生毒素的關(guān)鍵因素。而藻類的過度 繁殖及對(duì)其他生物的危害又會(huì)反過來破壞整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)，產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)。P. parvum 的生長繁殖及危害機(jī)理如圖 4 所示。 圖 4 P. parvum 生長繁殖及危害機(jī)理示意圖（綜合自文獻(xiàn)[34-37]） Fig.4 Schematic diagram about growth-reproduction and toxicological mechanisms of P. parvum （Summarized from the references [34-37]） 2.2.3 定鞭金藻的其他環(huán)境效應(yīng) 定鞭金藻大量繁殖，消耗水體中的溶解氧并釋放有毒物質(zhì)是其環(huán)境效應(yīng)的一 方面。此外，定鞭金藻會(huì)分泌大量的二甲基丙酸噻啶（dimethylsulfoniopropionate， DMSP），該物質(zhì)具有滲透調(diào)節(jié)作用（osmoregulation），以抵抗捕食者及抗氧化。 同時(shí)，定鞭金藻藻華發(fā)生時(shí)二甲基硫化物 DMS 是大氣中硫的主要貢獻(xiàn)者，DMS 具有吸潮作用，使大氣中云的密度增加，易形成酸雨。此外，硫化物會(huì)以小顆粒 形式存在，導(dǎo)致太陽光大量返回宇宙中，因此地球氣溫下降[15, 19, 38, 39]。然而，此 結(jié)論有待進(jìn)一步研究。 定鞭金藻藻華的另一個(gè)作用是海洋的鈣質(zhì)沉淀（calcareous sediments）。其中， 鈣質(zhì)石藻（calcareous coccolithophores）是主要貢獻(xiàn)者，其優(yōu)勢種是赫氏顆石藻 （Emiliania huxleyi），但貢獻(xiàn)最大的是鈣板金藻（Calcidiscus leptoporus）[15, 40, 41]。 2.3 顯微技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)及分子生物學(xué)技術(shù)等在定鞭金藻研究中的應(yīng)用 （ Application of Microtechnique, Flow Cytometry and Molecular Biotech- nologies Etc. for Haptophytes Research） 微型生物個(gè)體極小，成為研究發(fā)展的首要障礙。微型生物的研究進(jìn)展很大程 度上取決于技術(shù)的進(jìn)步。從技術(shù)手段來說，微型生物的研究經(jīng)歷了三大“變革”： 以顯微技術(shù)為基礎(chǔ)的觀察分析，以流式細(xì)胞技術(shù)（FCM）為基礎(chǔ)的快速測定和 以分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的多樣性分析與功能基因分析[1]。定鞭金藻作為微型生 物的一支，也經(jīng)歷了以上三個(gè)方法學(xué)的發(fā)展過程。 2.3.1 種群分類及生物多樣性分析 按照國際慣用的生物粒級(jí)尺度標(biāo)準(zhǔn)，海洋單細(xì)胞浮游生物大致可劃分為三 類：網(wǎng)采浮游生物（Netplankton），20~200 μm；納微型浮游生物（Nanoplankton）， 2~20 μm；皮微型浮游生物（Picoplankton），0.2~2 μm[1]。據(jù)此，定鞭金藻基本都 屬于納微型浮游生物，如 P. parvum 是一種單細(xì)胞微藻，細(xì)胞大小為 8-15 m4-10 m（長寬）[42]；棕囊藻細(xì)胞呈球形或近球形，直徑為 2.5~7.0 μm，但群體膠質(zhì) 囊大小可達(dá) 110~2600 μm[10]。隨著更多超微型海洋生物的發(fā)現(xiàn)，基于粒級(jí)尺度的 劃分標(biāo)準(zhǔn)已不適用，但顯微技術(shù)仍然是微型生物研究必不可少的手段。常用的顯 微技術(shù)有透射電子顯微技術(shù)（Transmission Electronic Microscopy，TEM）和表面 （落式）熒光顯微技術(shù)（Epifluorescence Microscopy，EFM）[43-46]。而流式細(xì)胞 技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)定鞭金藻的快速分類與定量[1, 47]。 雖然分子生物學(xué)技術(shù)起步較早，但真正被大規(guī)模應(yīng)用于海洋微型生物方面的 研究還是在 90 年代以后，其代表性研究是 Giovannoni 等利用 PCR 擴(kuò)增 16S rRNA 片段的技術(shù)研究了大西洋馬尾藻海的浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[48]。與傳統(tǒng)分類方法不同 的是，分子生物學(xué)技術(shù)是基于物種遺傳物質(zhì)的異同而進(jìn)行歸類的，正是因?yàn)榉肿?生物學(xué)的參與（與形態(tài)觀察相結(jié)合），才使得對(duì)定鞭金藻的傳統(tǒng)分類有了新突破， 其結(jié)果如圖 2 所示。根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道顯示，被廣泛用于定鞭金藻種群分類及生物多 樣性分析的分子生物學(xué)技術(shù)（手段）主要有：PCR 擴(kuò)增技術(shù)[49-51]、DNA 測序技 術(shù)[52]、（PCR-）DGGE 技術(shù)[52-55]、TGGE 技術(shù)[54]、HPLC 技術(shù)[56]、實(shí)時(shí)定量 PCR[57, 58]、qPCR 技術(shù)[54]、AFLP 技術(shù)[59]等。近些年，環(huán)境基因組技術(shù)和環(huán)境蛋白質(zhì)組 技術(shù)已成功應(yīng)用于對(duì)假微型海鏈藻（Thalassiosira pseudonana）和三角褐指藻 （Phaeodactylum tricornutum）的種群分析[15]，但在定鞭金藻方面的研究未見報(bào) 道。 2.3.2 毒理學(xué)（生理生態(tài)）研究 微藻的生理生態(tài)與細(xì)胞的物理化學(xué)特征和生物化學(xué)特征有關(guān)，如細(xì)胞的大 小、細(xì)胞質(zhì)的顆粒性、細(xì)胞色素的含量及 DNA 或 RNA 含量等[1]。對(duì)微藻生理生 態(tài)開展研究，能夠?yàn)榻沂居泻υ迦A爆發(fā)的機(jī)制、毒理學(xué)作用及其防治提供有效措 施，這也是實(shí)現(xiàn)海洋微型生物生態(tài)學(xué)研究的必要途徑。 流式細(xì)胞技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于海洋微型生物的生理生態(tài)研究，如細(xì)胞膜電位 分析、細(xì)胞活性分析、單細(xì)胞色素分析及細(xì)胞分選等[1]，該技術(shù)目前也實(shí)現(xiàn)了對(duì) 定鞭金藻的化學(xué)分析[60]。據(jù)現(xiàn)有報(bào)道顯示，RT-PCR 技術(shù)也實(shí)現(xiàn)了對(duì)定鞭金藻堿 性磷酸酶的表達(dá)測定[61]，而探針技術(shù)、HPLC 技術(shù)等也是定鞭金藻生理生態(tài)學(xué)研 究的一項(xiàng)輔助技術(shù)[56, 62, 63]。有報(bào)道顯示，將流式細(xì)胞技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)聯(lián)合 用于此方面的研究是可行的[64]。此外，海洋微型生物流式圖像技術(shù)、細(xì)胞膜電位 測定技術(shù)（同位素標(biāo)記技術(shù)、熒光分光光度法等）、時(shí)序紅外顯微技術(shù)（TIREM）、 活細(xì)胞測定技術(shù)（核酸染色技術(shù)、Live/Dead BaclightTM 細(xì)菌活性工具包、放射自 顯影技術(shù)等）、原子力顯微鏡技術(shù)和酶聯(lián)放大-熒光原位雜交技術(shù)（CARD-FISH）、 熒光原位雜交-微放射自顯影技術(shù)（Micro-FISH）和碳源利用分析技術(shù)等[1]都可在 定鞭金藻的生理生態(tài)研究中得到更深入的研究與推廣。 然而，生理生態(tài)的研究不能只局限于微觀世界，從微藻的個(gè)體水平、種群、 群落水品及其生態(tài)位等宏觀方面分析藻類的生態(tài)學(xué)效應(yīng)是今后研究的重要內(nèi)容 之一。這對(duì)于指導(dǎo)有害藻華的防治，漁業(yè)的生產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)微藻的開發(fā)及生態(tài)環(huán)境的 監(jiān)測與修復(fù)等都有十分重要的指導(dǎo)意義（詳見 2.4）。 2.3.3 監(jiān)測與防治 定鞭金藻藻華會(huì)對(duì)魚類及其他水生動(dòng)﹑植物產(chǎn)生毒害作用[34, 35, 65-67]。此外， 有研究表明，P. parvum 會(huì)對(duì)內(nèi)陸水源產(chǎn)生危害[42]。而在湖泊富營養(yǎng)化研究中， 定鞭金藻可以作為水體富營養(yǎng)化指示物種[18]。因此，開發(fā)定鞭金藻監(jiān)測與防治新 技術(shù)對(duì)指導(dǎo)漁業(yè)生產(chǎn)、保護(hù)水體環(huán)境及人類健康有重要價(jià)值。 常用的定鞭金藻監(jiān)測技術(shù)包括 RT-PCR 技術(shù)[58]、AFLP 技術(shù)[16, 59]、分子探針 技術(shù)[62, 68]、細(xì)胞計(jì)數(shù)法[69]等。不同種屬定鞭金藻具有不同的特性，對(duì)顆石藻屬 定鞭金藻而言，衛(wèi)星遙感技術(shù)在近些年得到了廣泛的應(yīng)用[6, 70]；但小定鞭金藻卻 無法利用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)追蹤監(jiān)測[42]。隨著技術(shù)的進(jìn)步，近些年對(duì)定鞭金藻引發(fā)的 HABs 也實(shí)現(xiàn)了數(shù)學(xué)模型擬合（預(yù)測），如數(shù)學(xué)模型（CZCS、Sea-WiFS、MODIS 等）[6, 70-72]﹑數(shù)據(jù)流技術(shù)[42]等的應(yīng)用。 若預(yù)測不準(zhǔn)確或不及時(shí)，對(duì)定鞭金藻的治理則顯得非常重要。因?yàn)槎ū藿鹪?的生長與爆發(fā)與 N/P 濃度和比例、溫度、pH、鹽度等有關(guān)，通過調(diào)控發(fā)生赤潮 的水域理化條件是實(shí)現(xiàn)藻華控制的途徑之一。同時(shí)，可利用化學(xué)殺藻劑對(duì)定鞭金 藻實(shí)行快速控制，如對(duì) P. parvum 的治理常用的殺藻劑有氟啶草酮（fluridone） ﹑五氟磺草胺（penoxsulam）﹑芐嘧磺隆（bensulfuron）﹑丙炔氟草胺（flumioxzin） ﹑唑草酮（carfentrazone）和 top-ramazone 等[73]。 2.4 生態(tài)（毒理）學(xué)在定鞭金藻研究中的應(yīng)用（Application of Eco-(Toxico-)logy for Haptophytes Research） 生態(tài)毒理學(xué)是運(yùn)用數(shù)學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、生態(tài)學(xué)及毒理學(xué)等多種學(xué)科的理論 和方法，研究各種有毒有害物質(zhì)對(duì)動(dòng)物、植物、微生物等非人類生物及生態(tài)系統(tǒng) 的損害作用及其防護(hù)的科學(xué)[74]。對(duì)于海洋生物而言，海洋生態(tài)學(xué)的研究重點(diǎn)為種 群生態(tài)學(xué)、群落生態(tài)學(xué)和生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)學(xué)三個(gè)層次，其內(nèi)容包括種群/群落的組 成與結(jié)構(gòu)、物種的時(shí)空變化與分布情況、種群/群落生態(tài)位及生態(tài)功能和種群/群 落與環(huán)境之間的效應(yīng)關(guān)系[75]。 定鞭金藻物種多樣性很豐富，且有多個(gè)種屬會(huì)形成有害藻華，研究有害藻華 產(chǎn)生的外界原因及有害藻華對(duì)外界產(chǎn)生的影響是非常有必要的。只有了解了外界 對(duì)定鞭金藻的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)及定鞭金藻對(duì)外界的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)，才能更好地 指導(dǎo)定鞭金藻有害藻華的預(yù)防與控制。 2.4.1 外界（其他生物與環(huán)境）對(duì)定鞭金藻的生態(tài)學(xué)作用 定鞭金藻的生活周期因種而異，有時(shí)也會(huì)受環(huán)境因素的影響而改變，主要包 括營養(yǎng)條件、捕食者及其他環(huán)境因素。一般來說，定鞭金藻的生長、衰亡有其固 有的周期，通常不會(huì)對(duì)外界環(huán)境造成不可恢復(fù)的損害。但人類活動(dòng)極大地影響了 環(huán)境的穩(wěn)定性，進(jìn)而破壞了生物的生存環(huán)境，這是導(dǎo)致生態(tài)事故如有害藻華爆發(fā) 的主要原因。 營養(yǎng)條件如 N/P 等物質(zhì)的含量及比例是影響定鞭金藻有害藻華爆發(fā)的首因 [25, 29, 35, 36]，N/P 是否充足會(huì)直接對(duì)定鞭金藻種群和群落組成與結(jié)構(gòu)造成破壞。有 報(bào)道顯示，P. parvum 有害藻華爆發(fā)時(shí)，往往也表明其他種群的衰亡[35-37]。這個(gè) 過程中，起關(guān)鍵作用的是 N/P 濃度，但最終會(huì)影響到其他種群的數(shù)量級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn) 而產(chǎn)生毒理學(xué)效應(yīng)（圖 4）。其他條件如溫度、光照、pH 等也會(huì)影響定鞭金藻的 種群結(jié)構(gòu)，時(shí)空分布等，這也是定鞭金藻受外界環(huán)境影響而改變的一個(gè)重要方面 （詳見 2.2.2）。此外，環(huán)境中的捕食者數(shù)量及種類也會(huì)對(duì)定鞭金藻的種群數(shù)量及 生態(tài)學(xué)功能產(chǎn)生沖擊，如捕食者對(duì)棕囊藻的影響[76-79]。其中，原生動(dòng)物（protozoan） 和后生動(dòng)物（metazoan）是主要的捕食者，且是在定鞭金藻生活周期中的單細(xì)胞 周期起作用[76, 78]。這些捕食者的存在也會(huì)對(duì)其他的微藻產(chǎn)生影響[80, 81]，因此這是 一個(gè)很復(fù)雜的過程[76]，最終會(huì)導(dǎo)致定鞭金藻生態(tài)功能的減弱甚至喪失。 2.4.2 定鞭金藻對(duì)外界（其他生物與環(huán)境）的生態(tài)（毒理學(xué)）作用 定鞭金藻有害藻華的發(fā)生與外界環(huán)境密切相關(guān)，同時(shí)，有害藻華又會(huì)對(duì)外界 環(huán)境產(chǎn)生效應(yīng)，因此二者在研究中是一個(gè)密不可分的統(tǒng)一過程。當(dāng)藻類大量繁殖 時(shí)，會(huì)消耗水中的溶解氧，從而抑制其他生物的正常生活；在不同生理生態(tài)條件 下，定鞭金藻甚至還會(huì)分泌藻毒素，毒害其他生物[42]。顆石藻屬和棕囊藻屬定鞭 金藻還會(huì)產(chǎn)生 DMSP 和 DMS 等污染空氣的物質(zhì)，顆石藻形成的鈣質(zhì)沉淀還會(huì)導(dǎo) 致海洋生產(chǎn)力結(jié)構(gòu)與功能的改變[6, 82]。 總之，生態(tài)（毒理）學(xué)是研究定鞭金藻的可靠方法，從整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)著手考 慮問題，對(duì)指導(dǎo)有害藻華防治有重要作用。生態(tài)（毒理）學(xué)研究的輔助手段很多， 如形態(tài)觀察，色譜、質(zhì)譜、色質(zhì)聯(lián)用、核磁共振等代謝分析，蛋白質(zhì)分析和基因 分析，文庫克隆，分子雜交，數(shù)學(xué)建模等。尤其是數(shù)學(xué)模型的建立，對(duì)定鞭金藻 的防治起到了很好的預(yù)警作用（2.3.3）。 2.5 生 物 信 息 學(xué) 在 定 鞭 金 藻 研 究 中 的 應(yīng) 用 （ Application of Bioinformatics for Haptophytes Research） 生物信息學(xué)是研究生物信息的采集，處理，存儲(chǔ)，傳播，分析和解釋等各方 面的一門學(xué)科。它通過綜合利用生物學(xué)，計(jì)算機(jī)科學(xué)和信息技術(shù)而揭示大量而復(fù) 雜的生物數(shù)據(jù)所賦有的生物學(xué)奧秘。傳統(tǒng)的生物分類及多樣性分析以物種的形態(tài) 結(jié)構(gòu)和生理特征為主要依據(jù)，但生物世界千變?nèi)f化，形態(tài)學(xué)差異有時(shí)不足以完全 表明其進(jìn)化地位及聚類情況。新興分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為生物多樣性的分析提 供了基礎(chǔ)，同時(shí)也為基于基因水平、蛋白質(zhì)水平的其他研究提供了條件，從而在 微觀、宏觀，毒理學(xué)機(jī)制等方面都實(shí)現(xiàn)了很大的突破。將分子生物學(xué)技術(shù)研究成 果在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行分析，是生物信息學(xué)的首要目標(biāo)，這便于不同領(lǐng)域、不同地域 的研究人員快速地進(jìn)行信息交流，以促進(jìn)生物學(xué)研究的快速發(fā)展。 通過對(duì)定鞭金藻的數(shù)據(jù)檢索（NCBI 數(shù)據(jù)庫）可知，當(dāng)前世界上對(duì)定鞭金藻 開展的研究比較廣泛，但仍然有很多未知領(lǐng)域亟待突破。如圖 5-A 所示，定鞭金 藻基因組的完整測序只有 4 個(gè)報(bào)道，分別是：赫氏顆石藻（Emiliania huxleyi）、 球等鞭金藻（Isochrysis galbana）和路氏巴夫藻（Pavlova lutheri）（雙擊見鏈接）。 針對(duì)表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed Sequence Tags，ESTs）開展的研究有 172949 個(gè)記 錄，然而與此相對(duì)應(yīng)的蛋白只有 2037 個(gè)記錄，其具體分布情況如圖 5-B~D；以 Prymnesium parvum 為例，對(duì)其 ESTs 開展的研究有 23443 條記錄（具體的研究 情況以圖 6 示之），卻只報(bào)道了 26 個(gè)蛋白（包括重復(fù)）。此外，當(dāng)前研發(fā)成功并 提交 NCBI 數(shù)據(jù)庫的定鞭金藻探針只有 4 個(gè)，且都為南極棕囊藻（Phaeocystis antarctica）探針（GenBank 登錄號(hào)分別為：Pr009611603~Pr009611006）。 以上情況說明，生物信息學(xué)對(duì)于研究定鞭金藻非常重要，由此可以把握國內(nèi) 外對(duì)此開展研究的最新動(dòng)態(tài)；同時(shí)也說明，當(dāng)前國際上對(duì)定鞭金藻開展的研究還 不夠深入，不夠系統(tǒng)。因此，今后對(duì)定鞭金藻開展廣泛、深入的研究還有非常廣 闊的前景。 B A C D 圖 5 國內(nèi)外對(duì)定鞭金藻開展的研究現(xiàn)狀 Fig.5 Research status of Haptophyta at home and abroad 3 、 定 鞭 金 藻 的 研 究 意 義 及 展 望 （ Research Meanings and Future Research for Haptophytes） 目前，對(duì)定鞭金藻的研究已較全面，從研究內(nèi)容來說，主要分為物種多樣性 分析、種群的分布特征與豐度、生態(tài)位及生態(tài)功能研究（如光合作用）、生長/ 反之特征、毒理學(xué)研究、定鞭金藻與環(huán)境之間的互效關(guān)系及檢測手段、治理方法 等（如圖 6 所示）。開展以上研究，主要有以下幾點(diǎn)意義： ① 通過對(duì)定鞭金藻物種多樣性、分布及豐度，以及爆發(fā)機(jī)制、毒理學(xué)機(jī)制 和環(huán)境效應(yīng)等方面的研究，可以對(duì)環(huán)境的變化與治理起指示和指導(dǎo)作用； ② 通過①，可以進(jìn)一步對(duì)人類生產(chǎn)、生活起引導(dǎo)作用（更好地調(diào)節(jié)人類與 環(huán)境間的關(guān)系）； ③ 通過定鞭金藻種群分類，生活史，分布特征及遺傳物質(zhì)多樣性研究，可 以促進(jìn)對(duì)不同地質(zhì)時(shí)代的環(huán)境特征與物種演化的深入了解； ④ 通過研究定鞭金藻的生理生化特性，對(duì)促進(jìn)經(jīng)濟(jì)微藻的研發(fā)有積極作用。 圖 6 定鞭金藻的研究內(nèi)容示意圖（綜合自文獻(xiàn)[32, 34, 37, 42, 55, 62, 65, 66, 68, 83-86]） Fig.6 Schematic diagram of research contents for Haptophytes （Summarized from the references[32,34,37,42,55,62,65-66,68,83-86]） 然而，對(duì)定鞭金藻的以上研究是一個(gè)綜合的過程，研究過程不可能面面俱到， 要做到全面、深入的了解有待新技術(shù)的誕生，也有待更多的人力、物力、財(cái)力的 投入。就當(dāng)前技術(shù)水平而言，對(duì)定鞭金藻的研究可以從以下幾點(diǎn)入手： ① 開展國際合作、交流，將不同時(shí)空的研究成果進(jìn)行比對(duì)，以期實(shí)現(xiàn)交叉、 綜合與新的突破； ② 篩選新種，對(duì)新種的生理生化特性，種群特性，生態(tài)功能等展開研究； ③ 持續(xù)地監(jiān)測同一環(huán)境條件下定鞭金藻的各種變化，同時(shí)進(jìn)行橫、縱向比 對(duì)，尋找異同點(diǎn)，為環(huán)境研究提供新思路； ④ 對(duì)定鞭金藻不同種屬（甚至綱、目）的遺傳物質(zhì)進(jìn)行深入研究，更全面 地揭示其分子水平差異性；尤其是要突出研究 ESTs 及其相關(guān)蛋白，為定鞭金藻 有害藻華的防治提供新的理論基礎(chǔ)； ⑤ 綜合開發(fā)新的監(jiān)測技術(shù)（如探針、示蹤技術(shù)等）； ⑥ 進(jìn)一步研究定鞭金藻的生態(tài)（毒理）學(xué)功能，為海洋微型生物生態(tài)學(xué)研 究作出新的貢獻(xiàn)； ⑦ 開發(fā)海洋經(jīng)濟(jì)微藻（如路氏巴夫藻和球棕囊藻等）。 第二部分：讀博工作安排與預(yù)期目標(biāo) 由以上分析可知，目前國內(nèi)外已廣泛開展對(duì)定鞭金藻的各類研究。在種群分 類及物種多樣性分析方面，定鞭金藻綱的顆石藻目和棕囊藻目等到了較完整的認(rèn) 識(shí)；對(duì)于定鞭金藻綱的定鞭金藻目和等鞭金藻目以及巴夫藻綱中的巴夫藻目的群 落結(jié)構(gòu)研究不夠深入。在我國，總體上還未對(duì)定鞭金藻門形成系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，這不 僅體現(xiàn)在門類分析方面，在物種多樣性、群落結(jié)構(gòu)多樣性、生態(tài)系統(tǒng)多樣性等方 面也存在“零敲碎打”的現(xiàn)象，諸如巴夫藻（巴夫藻目）、顆石藻（顆石藻目） 和金色藻（定鞭金藻目）（圖 2）的研究幾無報(bào)道，而對(duì)棕囊藻目和等鞭金藻目 的代表性物種研究較多。另外，定鞭金藻門的多數(shù)藻種都會(huì)形成有害藻華，進(jìn)而 會(huì)影響海域生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及功能的發(fā)揮。定鞭金藻藻華在我國的研究， 仍然以棕囊藻為主，而國外已對(duì)定鞭金藻目中的小定鞭金藻（P. parvum）展開了 深入研究，尤其是美國、德國等發(fā)達(dá)國家對(duì)其分布特征、光合作用、生長/繁殖 特性、毒理學(xué)作用及與環(huán)境之間的互效關(guān)系等方面作了很詳細(xì)的研究與報(bào)道；此 外，國外對(duì)顆石藻目中的赫氏顆石藻和鈣板顆石藻的研究也提升到了環(huán)境效應(yīng)方 面。再者，對(duì)于有害藻華的防治，也因以上研究進(jìn)程的遲緩也得不到很好的發(fā)展。 近年來，我國正大力投資于海洋生物學(xué)與環(huán)境學(xué)的研究，在“十二五”規(guī)劃 中，還專門成立了一項(xiàng)國家重點(diǎn)項(xiàng)目——《近海海洋綜合調(diào)查與評(píng)價(jià)》，也因此 形成了一個(gè)新熱潮——中國區(qū)域海洋學(xué)研究。國家海洋局對(duì)此如此重視，是因?yàn)?我國三面臨海，地理位置事宜微藻生活，四大海區(qū)——東海、黃海、渤海和南海 ——更是廣泛分布著各種微藻，種群資源豐富，也包括定鞭金藻。由此可知，在 我國典型海域開展定鞭金藻的系統(tǒng)研究，完整地勾畫出定鞭金藻在典型海區(qū)的群 落結(jié)構(gòu)和生態(tài)學(xué)功能，具有十分重要的意義。 然而，從整體而言（圖 5），開展對(duì)定鞭金藻藻華爆發(fā)機(jī)制、毒理學(xué)機(jī)制及 探針技術(shù)等的研究仍然存在著廣闊的空間。與其他門類微藻相比，國內(nèi)外對(duì)定鞭 金藻的研究還比較零散，但業(yè)已證明，定鞭金藻中有諸多種屬對(duì)漁業(yè)生產(chǎn)（棕囊 藻、小定鞭金藻等）、人類飲水健康（小定鞭金藻等）和經(jīng)濟(jì)微藻培養(yǎng)（路氏巴 夫藻、等鞭金藻）等有重要的研究價(jià)值。 以上分析表明，開展我國典型海域的定鞭金藻群落機(jī)構(gòu)分析及生態(tài)學(xué)功能研 究很有必要。一方面，它可以彌補(bǔ)我國海區(qū)對(duì)定鞭金藻門類研究的不足；另一方 面，它還可以提升我國在國際上研究微藻的水平，為全球環(huán)境研究作出應(yīng)有的貢 獻(xiàn)。基于此，本人擬在讀博期間主要完成以下幾項(xiàng)工作： ① 完成對(duì)定鞭金藻在我國典型海區(qū)的生物多樣性分析（比如，可以將海區(qū) 限定在臺(tái)灣海峽及南海），在此基礎(chǔ)上，爭取開發(fā)（或改進(jìn)）出若干種適于分析 生物多樣性的新技術(shù)。 ② 分析定鞭金藻在不同時(shí)空的群落演替關(guān)系，及其與海洋微型浮游動(dòng)物的 捕食/被捕食關(guān)系。 ③ 分析定鞭金藻在海洋生產(chǎn)力（碳循環(huán)）中的貢獻(xiàn)，探討氮循環(huán)和磷循環(huán) 中定鞭金藻生長/繁殖特性及其對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成的影響（如對(duì)其他海生生物的毒 理學(xué)作用等），研發(fā)相關(guān)的探針技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的有效修復(fù)。 可采取的方法學(xué)為：特征色素分析技術(shù)、PCR 技術(shù)（qPCR、PCR-DGGE、 RT-PCR 等）、流式圖像技術(shù)、DGGE/TGGE 技術(shù)、AFLP 技術(shù)、SSU rRNA 建庫、 FISH、高通量測序技術(shù)、環(huán)境基因組技術(shù)和環(huán)境蛋白質(zhì)組技術(shù)、生物信息學(xué)分 析、毒理學(xué)分析、生態(tài)學(xué)分析、數(shù)學(xué)建模、遙感技術(shù)的應(yīng)用等； 簡明技術(shù)路線： 參考文獻(xiàn)： [1] 焦念志. 海洋微型生物生態(tài)學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2006. 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