DB15/T XXXXXXXXX編制說明項目名稱：動物墊料中綠膿桿菌檢測 項目編號：內(nèi)質(zhì)監(jiān)標函（2018）154號-106 編制單位：呼和浩特海關(guān) 編制時間：2018.05-2019.10 一、 工作簡況本標準根據(jù)關(guān)于下達2018年第一批內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標準制修訂項目計劃的通知內(nèi)質(zhì)監(jiān)標函（2018）154號，本標準是由中華人民共和國呼和浩特海關(guān)提出并歸口，項目計劃編號為106。呼和浩特海關(guān)牽頭成立由相關(guān)領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員和具有標準化專業(yè)知識的人員組成的標準起草組。起草組在充分調(diào)查研究、綜合分析和試驗驗證的基礎(chǔ)上，起草標準初稿和編制說明，并廣泛征求意見。對意見進行匯總整理，修改完善標準初稿，形成地方標準征求意見稿。第一起草單位：中華人民共和國呼和浩特海關(guān)；第二起草單位：二連浩特海關(guān)；第三起草單位：二連浩特市疾病預(yù)防控制中心。本標準主要起草人：趙治國、敖威華、楊帆、延涵、王海艷、陳林軍、崔強、韓祎陟、郭文麗、馬彩霞。二、標準制定的背景及意義動物墊料與動物關(guān)系密切。近年來隨著生物科學研究的飛速發(fā)展，動物作為其研究中不可缺少的重要組成部分，備受各國政府的重視和科學家的關(guān)注。墊料是為動物營造舒適的人工環(huán)境，進行環(huán)境控制的基礎(chǔ)條件和必要材料，是對動物產(chǎn)生直接作用和影響的環(huán)境因素。動物墊料與動物健康、福利息息相關(guān)，同時也對養(yǎng)殖業(yè)、動物及其相關(guān)科研方面甚至社會經(jīng)濟發(fā)展有十分重大的影響。因此，墊料的質(zhì)量評定與控制非常必要。 我國動物墊料標準化、商品化尚處于初級階段。歐美等發(fā)達國家早已實行墊料商品化生產(chǎn)，有專業(yè)的工廠，并且各道工序的質(zhì)量要求非常嚴格。但我國對動物墊料的研究還處于初級階段，與墊料相關(guān)的文獻報道甚少，墊料生產(chǎn)監(jiān)管環(huán)節(jié)薄弱，檢測標準缺乏。近年來我國政府及從業(yè)人員逐漸認識到動物墊料中存在的問題，開始對墊料質(zhì)量評價方面的問題進行改進。因此要想使動物的質(zhì)量管理與國際接軌，動物墊料生產(chǎn)的標準化、商品化就變得至關(guān)重要。我國動物墊料標準化和質(zhì)量管理相對滯后，影響相關(guān)行業(yè)發(fā)展。我國對動物墊料的研究才剛剛起步，現(xiàn)行的國家標準和實驗動物相關(guān)管理條例中，對動物墊料的標準化規(guī)定幾乎空白，稀數(shù)資料對于墊料的規(guī)定只有：應(yīng)選用吸濕性好、塵埃少、無異味、無毒性、無油脂的材料；須經(jīng)消毒、滅菌后方可使用。如此籠統(tǒng)的規(guī)定在一定程度上制約了我國動物墊料標準不能緊跟國際標準，同時限制了藥品、生物制品、動物等產(chǎn)品的出口，還使科研論文將不能被同行接受。因此要想提高相關(guān)學科競爭力，就必須加強墊料標準化和質(zhì)量管理，從動物墊料微生物指標監(jiān)測入手。我國動物墊料微生物檢測標準幾乎空白，亟待建立相關(guān)標準。近年來，我國政府及從業(yè)人員逐漸認識到動物墊料對動物健康及下游產(chǎn)業(yè)的重大意義，墊料相關(guān)研究報道逐年增多，積累了一定的理論基礎(chǔ)。但目前，我國尚未對國內(nèi)墊料質(zhì)量建立統(tǒng)一評價體系、風險分析、國家標準及配套法規(guī)。其中，墊料中微生物特別是致病微生物的含量對動物健康、福利和產(chǎn)品等影響重大，但目前動物墊料中微生物檢測標準屬于空白，亟待建立科學完善的動物墊料微生物檢測標準，該工作將對國內(nèi)墊料建立統(tǒng)一質(zhì)量評價體系、風險分析及產(chǎn)品標準等有力促進。動物墊料中綠膿桿菌對動物的危害極大。動物墊料綠膿桿菌是影響動物健康和動物實驗結(jié)果的國際公認的重要環(huán)境因素之一，因此動物墊料中綠膿桿菌的檢測十分重要。綠膿桿菌是人獸共患的一種條件性病原菌。在自然界分布極廣,是多種家畜、經(jīng)濟動物以及野生動物和人都可感染的一種傳染病，對人畜危害嚴重。病畜及帶菌動物是主要傳染源，經(jīng)消化道、呼吸道及傷口感染。是燒傷、外傷和術(shù)后感染的主要病原菌, 綠膿桿菌感染可發(fā)生在人體任何部位和組織、常見于燒傷或創(chuàng)傷部位、中耳、角膜、尿道和呼吸道。也可引起心內(nèi)膜炎、胃腸炎、膿胸甚至敗血癥。綠膿桿菌經(jīng)常由傷口、燒傷部位、外科手術(shù)或治療、檢驗用各種插管，甚至使用不當?shù)碾[形眼鏡，而侵入人體。一旦綠膿桿菌侵入患者組織或血液后，常出現(xiàn)各種不同的臨床癥狀，如急性眼內(nèi)炎；或在囊狀纖維瘤患者身上，出現(xiàn)慢性呼吸道感染，進而演變成慢性肺炎；在免疫力缺失的癌癥患者或嚴重的燒傷病人身上，則出現(xiàn)急性的肺炎或菌毒血癥。院內(nèi)感染綠膿桿菌所引起的肺炎或菌毒血癥，致死率更高達70，其中主要的致病因子是綠膿桿菌外毒素。據(jù)報道10在醫(yī)院感染的病癥都是由綠膿桿菌所引致的，居病原菌之首。國內(nèi)外燒傷中心對細菌感染的臨床調(diào)查中發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌感染占50以上?；谝陨现虏⌒?，綠膿桿菌是疾病診斷中必檢微生物之一。禽類感染可呈現(xiàn)卡他性或出血性腸炎,或發(fā)生眼角膜炎。也可與葡萄球菌等混合感染呈現(xiàn)呼吸道疾病。綠膿桿菌也是奶牛乳房炎的重要病原菌之一。它引起的疾病不論在發(fā)達國家還是在發(fā)展中國家都嚴重地損害著動物及人類的健康，也給養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失。綠膿桿菌病的危害如此之大，使用綠膿桿菌污染的墊料容易引起動物發(fā)病，含有綠膿桿菌的動物產(chǎn)品又會導致公共衛(wèi)生事件的發(fā)生。動物體內(nèi)排出的綠膿桿菌，也可能污染食物導致人的食物中毒。因此檢測墊料中綠膿桿菌成為重中之重。建立動物墊料綠膿桿菌檢測標準，保障動物健康急不可待。動物墊料與動物糞便直接接觸，容易滋生細菌，尤其是腸道致病微生物，致使墊料被綠膿桿菌污染，從而威脅動物的健康與福利，并且對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展與國際間動物及產(chǎn)品貿(mào)易帶來巨大的影響，甚至威脅到人類社會的生產(chǎn)與生活。但是對于動物墊料綠膿桿菌檢測標準幾乎空白，還沒有統(tǒng)一的標準和方法，所以建立動物墊料綠膿桿菌檢測標準已刻不容緩。本實驗室具有多年微生物檢測的經(jīng)驗，本方法的開發(fā)和應(yīng)用，在檢測技術(shù)方面填補我區(qū)的空白、彌補了自治區(qū)沒有現(xiàn)行標準的不足，能夠使動物墊料中綠膿桿菌的檢測更加高效、準確、安全。本方法的開發(fā)和應(yīng)用將會使我區(qū)在動物墊料中綠膿桿菌的檢測先進性方面達到國內(nèi)領(lǐng)先水平，為我區(qū)動物墊料質(zhì)量安全管理部門更快更好的管控提供可靠保障。因此，加強動物墊料中綠膿桿菌的檢測對確保全區(qū)農(nóng)業(yè)持續(xù)、健康發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。三、主要起草過程2018.05-2018.08 地標前期基礎(chǔ)工作：收集動物墊料樣本，查閱綠膿桿菌資料，檢索綠膿桿菌檢測的相關(guān)文獻及標準。2018.09-2019.07 前期實驗條件的摸索：包括前處理方法的優(yōu)化、對照，不同墊料中綠膿桿菌的檢出率，最終確定實驗方案，編寫編制說明。2019.08-2019.09 驗證單位進行驗證。2019.10 編寫地標并定初稿。四、現(xiàn)行法律、法規(guī)和強制性標準的關(guān)系本標準遵循GB/T 1.1-2009 標準化工作導則 第1部分：標準的結(jié)構(gòu)和編寫和GB/T 20001.4-2015 標準編寫規(guī)則 第4部分：試驗方法標準的規(guī)則編寫。還參照相關(guān)國家標準編寫指南的要求。在編制本標準的過程中參考了以下標準：ISO 22717:2015 Cosmetics. Microbiology. Detection of Pseudomonas aeruginosa、AOAC Official Method 991.49 Testing Disinfectants Against Pseudomonas aeruginosa、SN/T 2099進出口食品中綠膿桿菌檢測方法、GB 7918.4化妝品微生物標準檢驗方法 綠膿桿菌、DB 22/T 394.3-2017保健用品微生物檢驗方法 第3部分：銅綠假單胞菌測定、GB 8538-2016食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法、GB/T 14926.17-2001實驗動物 綠膿桿菌檢驗方法、SN/T 4458-2016出口中藥材微生物學檢驗；綜合參考了國內(nèi)外與綠膿桿菌檢測相關(guān)的檢測標準，力求該標準能夠高效準確的檢測墊料中綠膿桿菌，同時兼顧標準的廣泛應(yīng)用。本標準完全符合現(xiàn)行法律法規(guī)和強制性標準規(guī)定，不存在任何與現(xiàn)行法律法規(guī)和強制性標準相違背之處。相關(guān)強制性標準2項：GB 14925-2010 實驗動物 環(huán)境及設(shè)施，本標準規(guī)定了實驗動物及動物實驗設(shè)備和環(huán)境的技術(shù)要求及檢測方法，同時規(guī)定了墊料、飲水和籠具的原則要求。但針對墊料該標準僅規(guī)定了“墊料的材質(zhì)應(yīng)符合動物的健康和福利要求，應(yīng)滿足吸濕性好、塵埃少、無異味、無毒性、無油脂、耐高溫、耐高壓等條件；墊料必須經(jīng)滅菌處理后方可使用”，本地標適用于墊料中綠膿桿菌檢測，明確規(guī)定了不同類別墊料取樣方法，標準中綠膿桿菌鑒定過程增加了新的鑒定手段，確保檢測結(jié)果更加準確。5、 主要內(nèi)容及檢測方法的確定5.1 取樣方法的確定及優(yōu)化根據(jù)動物墊料的物理性狀將其分為顆粒狀/粉末狀墊料和平面狀墊料，針對不同性狀的墊料采取不同的取樣方法。5.1.1 顆粒狀或粉末墊料樣品取樣方法國內(nèi)外食品和飼料中霉菌檢測法中常用的取樣方法為稱取法，本標準中針對顆粒狀或粉末墊料樣品（木屑、玉米芯、秸稈、紙屑等）參考通用做法采用稱取25 g的方法進行取樣。5.1.2 平面墊料樣品取樣方法針對平面墊料（膠墊、托盤等）采用表面涂抹取樣法，無菌操作將涂抹25 cm2100 cm2平面樣品的棉拭子置入裝有 25 mL100 mLSCDLP中，混勻作為原液。5.2 增菌液和培養(yǎng)基的選擇5.2.1 增菌液的選擇國內(nèi)外標準和資料中用到的增菌液主要有：SCDLP液體培養(yǎng)基、NAC液體培養(yǎng)基、滅菌生理鹽水、磷酸鹽緩沖稀釋液和營養(yǎng)肉湯（NB）等。不同標準中使用最多的是SCDLP，本標準也選用該增菌液。5.2.2 分離培養(yǎng)基 本標準選用的綠膿桿菌分離培養(yǎng)基為國內(nèi)外標準中比較認可的假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基、假單胞菌CN選擇性培養(yǎng)基，在保證檢測結(jié)果的同時，兼顧不同標準所用培養(yǎng)基的一致性，節(jié)約實驗室成本。5.3 典型或可疑菌落的鑒定 本標準對典型或可疑菌落的鑒定過程，參考了國內(nèi)外綠膿桿菌檢測標準和藥典等成熟做法，綜合了生化反應(yīng)等必要鑒定過程，并囊括了全自動細菌鑒定系統(tǒng)和飛行時間質(zhì)譜檢測方法，做到了與國際接軌，縮短檢測時間，增加檢測通量，減少檢測人員工作量。5.4 培養(yǎng)時間和溫度最新的ISO 22717:2015采用了32.52.5的預(yù)增菌溫度，使綠膿桿菌培養(yǎng)溫度范圍擴大為為3035，而我國常用的綠膿桿菌培養(yǎng)溫度為361，也在這一范圍內(nèi)，本標準將繼續(xù)采用我國常用的361對綠膿桿菌進行檢測培養(yǎng)。本標準各種培養(yǎng)基培養(yǎng)時間也與國內(nèi)外標準常用時間相統(tǒng)一。六、方法驗證為驗證本方法的有效性和適用性，選擇5家不同行業(yè)的檢測機構(gòu)對本方法進行驗證，驗證內(nèi)容為方法的適用性、準確度、檢出率及相關(guān)樣品的檢測，結(jié)果顯示該方法穩(wěn)定可靠，符合相關(guān)要求。七、結(jié)論綜上所述，本標準在制定過程中所涉及到的各項技術(shù)指標均經(jīng)過方法學的驗證，并切實可行，完全達到了編制標準的要求。八、重大意見分歧的處理依據(jù)和結(jié)果未發(fā)生。九、國內(nèi)外情況簡要說明國內(nèi)尚沒有建立統(tǒng)一的國家標準檢測方法。檢索國家標準1項和地方標準2項：GB 14925-2010 實驗動物 環(huán)境及設(shè)施、江蘇省地方標準DB 32/T 2129-2012 實驗動物 墊料、北京市地方標準DB 11/T 1126-2014實驗動物 墊料。根據(jù)文獻報道尚未發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古自治區(qū)內(nèi)有相關(guān)單位從事這項研究。10、 標準草稿征求意見情況匯總表序號意見提出單位/專家采納不采納（說明原因）1建議在標準適當位置增加“綠膿桿菌檢測流程圖”。二連浩特海關(guān)技術(shù)中心/王伊琴采納2建議將新型“飛行時間質(zhì)譜法”加入到標準。包頭海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心/張鵬翔采納3建議只保留綠膿菌素、硝酸鹽還原產(chǎn)氣、明膠液化、42生長試驗，去掉乙酰胺、葡萄糖酸鹽、精氨酸雙水解酶試驗。蘭州海關(guān)技術(shù)中心/張宇霞采納4平面墊料樣品應(yīng)用表格方式給出采樣量。貴陽海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心/羅阿東采納5無參考文獻：1 GB/T 1.1-2009標準化工作導則 第1部分：標準的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則.2 GB/T 20001.4-2015標準編寫規(guī)則 第4部分：試驗方法標準.3 GB 14925-2010實驗動物 環(huán)境及設(shè)施.4 DB 32/T 2129-2012實驗動物 墊料.5 DB 11/T 1126-2014實驗動物 墊料.6 SN/T 2099-2008進出口食品中綠膿桿菌檢測方法.7 GB 7918.4-1987化妝品微生物標準檢驗方法 綠膿桿菌.8 DB 22/T 394.3-2017.保健用品微生物檢驗方法 第3部分：銅綠假單胞菌測定.9 GB 8538-2016食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法.10 GB/T 14926.17-2001實驗動物 綠膿桿菌檢驗方法.11 SN/T 4458-2016出口中藥材微生物學檢驗.12 ISO 22717:2015 Cosmetics. Microbiology. Detection of Pseudomonas aeruginosa.13 AOAC Official Method 991.49 Testing Disinfectants Against Pseudomonas aeruginosa.8