編制說明項(xiàng)目名稱：動(dòng)物墊料中志賀氏菌檢測方法 項(xiàng)目編號：內(nèi)質(zhì)監(jiān)標(biāo)函（2018）154號-108 編制單位：呼和浩特海關(guān) 編制時(shí)間：2018.6-2019.12 一、 工作簡況本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)局關(guān)于下達(dá)2018年第一批內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目計(jì)劃的通知內(nèi)質(zhì)監(jiān)標(biāo)函（2018）154號，本標(biāo)準(zhǔn)是由呼和浩特海關(guān)提出并歸口，項(xiàng)目計(jì)劃編號為108。呼和浩特海關(guān)牽頭成立由相關(guān)領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員和具有標(biāo)準(zhǔn)化專業(yè)知識的人員組成的標(biāo)準(zhǔn)起草組。起草組在充分調(diào)查研究、綜合分析和試驗(yàn)驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，起草標(biāo)準(zhǔn)初稿和編制說明，并廣泛征求意見。對意見進(jìn)行匯總整理，修改完善標(biāo)準(zhǔn)初稿，形成地方標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿。第一起草單位：中華人民共和國呼和浩特海關(guān)；第二起草單位：內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院。主要起草人：趙治國、延涵、盛萬里、王海艷、陳林軍、崔強(qiáng)、敖威華、李軍燕、羅曉平、韓祎陟。二、標(biāo)準(zhǔn)制定的背景及意義動(dòng)物墊料與動(dòng)物關(guān)系密切。近年來隨著生物科學(xué)研究的飛速發(fā)展，動(dòng)物作為其研究中不可缺少的重要組成部分，備受各國政府的重視和科學(xué)家的關(guān)注。墊料是為動(dòng)物營造舒適的人工環(huán)境，進(jìn)行環(huán)境控制的基礎(chǔ)條件和必要材料，是對動(dòng)物產(chǎn)生直接作用和影響的環(huán)境因素。動(dòng)物墊料與動(dòng)物健康、福利息息相關(guān)，同時(shí)也對養(yǎng)殖業(yè)、動(dòng)物及其相關(guān)科研方面甚至社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展有十分重大的影響。因此，墊料的質(zhì)量評定與控制非常必要。 我國動(dòng)物墊料標(biāo)準(zhǔn)化、商品化尚處于初級階段。歐美等發(fā)達(dá)國家早已實(shí)行墊料商品化生產(chǎn)，有專業(yè)的工廠，并且各道工序的質(zhì)量要求非常嚴(yán)格。但我國對動(dòng)物墊料的研究還處于初級階段，與墊料相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道甚少，墊料生產(chǎn)監(jiān)管環(huán)節(jié)薄弱，檢測標(biāo)準(zhǔn)缺乏。近年來我國政府及從業(yè)人員逐漸認(rèn)識到動(dòng)物墊料中存在的問題，開始對墊料質(zhì)量評價(jià)方面的問題進(jìn)行改進(jìn)。因此要想使動(dòng)物的質(zhì)量管理與國際接軌，動(dòng)物墊料生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化、商品化就變得至關(guān)重要。我國動(dòng)物墊料標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量管理相對滯后，影響相關(guān)行業(yè)發(fā)展。我國對動(dòng)物墊料的研究才剛剛起步，現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)管理?xiàng)l例中，對動(dòng)物墊料的標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)定幾乎空白，稀數(shù)資料對于墊料的規(guī)定只有：應(yīng)選用吸濕性好、塵埃少、無異味、無毒性、無油脂的材料；須經(jīng)消毒、滅菌后方可使用。如此籠統(tǒng)的規(guī)定在一定程度上制約了我國動(dòng)物墊料標(biāo)準(zhǔn)不能緊跟國際標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)限制了藥品、生物制品、動(dòng)物等產(chǎn)品的出口，還使科研論文將不能被同行接受。因此要想提高相關(guān)學(xué)科競爭力，就必須加強(qiáng)墊料標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量管理，從動(dòng)物墊料微生物指標(biāo)監(jiān)測入手。我國動(dòng)物墊料微生物檢測標(biāo)準(zhǔn)幾乎空白，亟待建立相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。近年來，我國政府及從業(yè)人員逐漸認(rèn)識到動(dòng)物墊料對動(dòng)物健康及下游產(chǎn)業(yè)的重大意義，墊料相關(guān)研究報(bào)道逐年增多，積累了一定的理論基礎(chǔ)。但目前，我國尚未對國內(nèi)墊料質(zhì)量建立統(tǒng)一評價(jià)體系、風(fēng)險(xiǎn)分析、國家標(biāo)準(zhǔn)及配套法規(guī)。其中，墊料中微生物特別是致病微生物的含量對動(dòng)物健康、福利和產(chǎn)品等影響重大，但目前動(dòng)物墊料中微生物檢測標(biāo)準(zhǔn)屬于空白，亟待建立科學(xué)完善的動(dòng)物墊料微生物檢測標(biāo)準(zhǔn)，該工作將對國內(nèi)墊料建立統(tǒng)一質(zhì)量評價(jià)體系、風(fēng)險(xiǎn)分析及產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)等有力促進(jìn)。動(dòng)物墊料中志賀氏菌對動(dòng)物的危害極大。動(dòng)物墊料志賀氏菌是影響動(dòng)物健康和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的國際公認(rèn)的重要環(huán)境因素之一，因此動(dòng)物墊料中志賀氏菌的檢測十分重要。志賀氏菌屬的細(xì)菌，是細(xì)菌性痢疾的病原菌，屬于腸桿菌科，分4個(gè)群：痢疾志賀氏菌、福氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌。由志賀氏菌引起的細(xì)菌性痢疾是最為常見的，它不僅可以通過食物和水源傳播，也可以通過糞口傳播和接觸傳播。造成志賀氏菌感染的大多數(shù)原因是由環(huán)境衛(wèi)生惡劣、食材或者人類、動(dòng)物攜帶志賀氏菌等原因造成的，也通常通過水源污染和接觸傳播引起。人和靈長類動(dòng)物是志賀氏菌的最宜寄主，但是近年來我國也有養(yǎng)雞場大規(guī)模爆發(fā)志賀氏菌感染的事件。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告，全球每年約有1.2億志賀氏菌引起嚴(yán)重腸道感染的病例，估計(jì)造成60余萬死亡病例。10100個(gè)志賀氏菌，經(jīng)口投喂即可造成腸道感染。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，在志賀氏菌流行的季節(jié)，養(yǎng)殖場周圍的床鋪、桌椅、門把手等生活用具，甚至是感染者的手指上都可以檢出志賀氏菌。志賀氏菌引起的疾病不論在發(fā)達(dá)國家還是在發(fā)展中國家都嚴(yán)重地?fù)p害著動(dòng)物及人類的健康，也給養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。我國食源性致病菌中，由志賀氏菌引起的感染人數(shù)占細(xì)菌性食源性疾病總病例的8.5%。志賀氏菌病的危害如此之大，使用志賀氏氏菌污染的墊料容易引起動(dòng)物發(fā)病及攜帶病菌，含有志賀氏菌的動(dòng)物產(chǎn)品又會(huì)導(dǎo)致公共衛(wèi)生事件的發(fā)生。動(dòng)物體內(nèi)排出的志賀氏菌，即可能污染食物導(dǎo)致人的食物中毒，也可能由于人類接觸而造成的疾病的發(fā)生。因此檢測墊料中志賀氏菌成為重中之重。建立動(dòng)物墊料志賀氏菌檢測標(biāo)準(zhǔn)，保障動(dòng)物健康急不可待。動(dòng)物墊料與動(dòng)物糞便直接接觸，容易滋生細(xì)菌，尤其是腸道致病微生物，致使墊料被志賀氏菌污染，從而威脅動(dòng)物的健康與福利，并且對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展與國際間動(dòng)物及產(chǎn)品貿(mào)易帶來巨大的影響，甚至威脅到人類社會(huì)的生產(chǎn)與生活。但是對于動(dòng)物墊料志賀氏菌檢測標(biāo)準(zhǔn)幾乎空白，還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和方法，所以建立動(dòng)物墊料志賀氏菌檢測標(biāo)準(zhǔn)已刻不容緩。本實(shí)驗(yàn)室具有多年微生物檢測的經(jīng)驗(yàn)，本方法的開發(fā)和應(yīng)用，在檢測技術(shù)方面填補(bǔ)我區(qū)的空白、彌補(bǔ)了自治區(qū)沒有現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的不足，能夠使動(dòng)物墊料中志賀氏菌的檢測更加高效、準(zhǔn)確、安全。本方法的開發(fā)和應(yīng)用將會(huì)使我區(qū)在動(dòng)物墊料中志賀氏菌的檢測先進(jìn)性方面達(dá)到國內(nèi)領(lǐng)先水平，為我區(qū)動(dòng)物墊料質(zhì)量安全管理部門更快更好的管控提供可靠保障。因此，加強(qiáng)動(dòng)物墊料中志賀氏菌的檢測對確保全區(qū)農(nóng)業(yè)持續(xù)、健康發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。三、主要起草過程2018.06-2018.08 地標(biāo)前期基礎(chǔ)工作：收集動(dòng)物墊料樣本，查閱志賀氏菌資料，檢索志賀氏菌檢測的相關(guān)文獻(xiàn)及標(biāo)準(zhǔn)。2018.10-2019.09 前期實(shí)驗(yàn)條件的摸索：包括前處理方法的優(yōu)化、對照，不同墊料中志賀氏菌的檢出率，最終確定實(shí)驗(yàn)方案，編寫編制說明。2019.10-2019.11 驗(yàn)證單位進(jìn)行驗(yàn)證。2019.12 編寫地標(biāo)并定初稿。四、現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系本標(biāo)準(zhǔn)遵循GB/T 1.1-2009 標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫和GB/T 20001.4-2015 標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則 第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)則編寫。還參照相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)編寫指南的要求。在編制本標(biāo)準(zhǔn)的過程中參考了以下標(biāo)準(zhǔn)：ISO 21567：2004 Microbiology of food and animalfeeding stuffs Horizontal method for the detection of shigella spp.、 美國FDA細(xì)菌學(xué)分析手冊第八版（BAM） 志賀氏菌、GB 14925-2010實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施、GB 4789.5-2012食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 志賀氏氏菌檢驗(yàn)、GB 4789.31-2013食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌、志賀氏菌和致瀉大腸埃希氏菌的腸桿菌科噬菌體診斷檢驗(yàn)、GB/T 14926.47-2008 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 志賀菌檢測方法、GB/T 8381.2-2005飼料中志賀氏菌的檢測方法。綜合參考了國內(nèi)外與志賀氏菌檢測相關(guān)的檢測標(biāo)準(zhǔn)，力求該標(biāo)準(zhǔn)能夠高效準(zhǔn)確的檢測墊料中志賀氏菌，同時(shí)兼顧標(biāo)準(zhǔn)的廣泛應(yīng)用。本標(biāo)準(zhǔn)完全符合現(xiàn)行法律法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，不存在任何與現(xiàn)行法律法規(guī)和強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)相違背之處。相關(guān)強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)2項(xiàng)：GB 14925-2010 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 環(huán)境及設(shè)施，本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)備和環(huán)境的技術(shù)要求及檢測方法，同時(shí)規(guī)定了墊料、飲水和籠具的原則要求。但針對墊料該標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了“墊料的材質(zhì)應(yīng)符合動(dòng)物的健康和福利要求，應(yīng)滿足吸濕性好、塵埃少、無異味、無毒性、無油脂、耐高溫、耐高壓等條件；墊料必須經(jīng)滅菌處理后方可使用” 。本地標(biāo)適用于墊料中志賀氏菌檢測，明確規(guī)定了不同類別墊料取樣方法，標(biāo)準(zhǔn)中志賀氏菌鑒定過程增加了新的鑒定手段，確保檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確。5、 主要內(nèi)容及檢測方法的確定5.1 取樣方法的確定及優(yōu)化根據(jù)動(dòng)物墊料的物理性狀將其分為顆粒狀/粉末狀墊料和平面狀墊料，針對不同性狀的墊料采取不同的取樣方法。5.1.1 顆粒狀或粉末墊料樣品取樣方法國內(nèi)外食品和飼料中志賀氏菌檢測法中常用的取樣方法為稱取法，本標(biāo)準(zhǔn)中針對顆粒狀或粉末墊料樣品（木屑、玉米芯、秸稈、紙屑等）參考通用做法采用稱取25 g的方法進(jìn)行取樣。5.1.2 平面墊料樣品取樣方法針對平面墊料（膠墊、托盤等）采用表面涂抹取樣法，無菌操作將涂抹25 cm2-100 cm2平面樣品的棉拭子置入裝有 25 mL-100 mL無菌稀釋液中，混勻作為原液。5.2 稀釋液和培養(yǎng)基的選擇5.2.1 預(yù)增菌稀釋液的選擇國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)和資料中用到的預(yù)增菌液主要有：GN增菌液和志賀氏增菌肉湯。研究表明，GN增菌液中的志賀氏菌生長率明顯低于志賀氏菌增菌肉湯，且4小時(shí)之后其他腸桿菌的生長率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過志賀氏菌，影響檢測效果。志賀氏菌增菌肉湯為含磷酸鹽緩沖液的胰胨葡萄糖肉湯含表面活性劑吐溫80及選擇性新生霉素。此培養(yǎng)基目前被我國國標(biāo)、ISO及FDA等采納，用于志賀氏菌的增菌。其優(yōu)點(diǎn)在于添加了葡萄糖和吐溫80加上厭氧培養(yǎng)，志賀氏菌都能較好的得到修復(fù)并生長，主要干擾菌能夠得到很好的抑制。5.2.2 分離培養(yǎng)基 常見的志賀氏菌分離培養(yǎng)基有麥康凱（MAC）瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽（XLD）瓊脂和志賀氏菌顯色培養(yǎng)基，SS瓊脂、HE瓊脂等。SS瓊脂對志賀1型有抑制。HE瓊脂雖然對志賀氏良好的選擇性，但是志賀氏菌在其上生長的菌落無色透明，菌落特征不明顯，不易于觀察。本標(biāo)準(zhǔn)選用的志賀氏菌分離培養(yǎng)基均為國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)中比較認(rèn)可的麥康凱（MAC）瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽（XLD）瓊脂和志賀氏菌顯色培養(yǎng)基，同國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.5所用培養(yǎng)基相同，保證檢測結(jié)果的同時(shí)，兼顧不同標(biāo)準(zhǔn)所用培養(yǎng)基的一致性，節(jié)約實(shí)驗(yàn)室成本。5.3 典型或可疑菌落的鑒定 本標(biāo)準(zhǔn)對典型或可疑菌落的鑒定過程，參考了國內(nèi)外志賀氏菌檢測標(biāo)準(zhǔn)和藥典等成熟做法，綜合了生化反應(yīng)等必要鑒定過程，并囊括了全自動(dòng)微生物檢測系統(tǒng)，增加了飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測方法，做到了與國際接軌，縮短檢測時(shí)間，增加檢測通量，減少檢測人員工作量。5.4 培養(yǎng)時(shí)間和溫度最新的ISO 21567:2004使用了41.51的預(yù)增菌溫度，我國常用的志賀氏菌培養(yǎng)溫度為41.51。本標(biāo)準(zhǔn)將繼續(xù)采用我國常用的41.51對志賀氏菌進(jìn)行檢測培養(yǎng)。本標(biāo)準(zhǔn)各種培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)間也與國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)常用時(shí)間相統(tǒng)一。六、方法驗(yàn)證為驗(yàn)證本方法的有效性和適用性，選擇5家不同行業(yè)的檢測機(jī)構(gòu)對本方法進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證內(nèi)容為方法的適用性、準(zhǔn)確度、檢出率及相關(guān)樣品的檢測，結(jié)果顯示該方法穩(wěn)定可靠，符合相關(guān)要求。七、結(jié)論綜上所述，本標(biāo)準(zhǔn)在制定過程中所涉及到的各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均經(jīng)過方法學(xué)的驗(yàn)證，并切實(shí)可行，完全達(dá)到了編制標(biāo)準(zhǔn)的要求。八、重大意見分歧的處理依據(jù)和結(jié)果未發(fā)生。九、國內(nèi)外情況簡要說明國內(nèi)尚沒有建立統(tǒng)一的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。檢索國家標(biāo)準(zhǔn)1項(xiàng)和地方標(biāo)準(zhǔn)2項(xiàng)：GB 14925-2010 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 環(huán)境及設(shè)施、江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB32/T 2129-2012 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 墊料、北京市地方標(biāo)準(zhǔn)DB11/T 1126-2014實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 墊料。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道尚未發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古自治區(qū)內(nèi)有相關(guān)單位從事這項(xiàng)研究。10、 標(biāo)準(zhǔn)草稿征求意見情況匯總表序號意見提出單位/專家采納不采納（說明原因）1建議增加“志賀氏菌檢測流程圖”二連海關(guān)技術(shù)中心/王伊琴采納2建議將規(guī)范性引用文件按照國標(biāo)在前，行標(biāo)在后的順序，小號在前，大號在后。包頭海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心/張鵬翔采納3建議仔細(xì)核對全文格式。蘭州海關(guān)技術(shù)中心/張宇霞采納45參考文獻(xiàn)：1 標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則，GB/T 1.1-2009.2 標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則 第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)，GB/T 20001.4-2015.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 環(huán)境及設(shè)施，GB 14925-2010.4 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 志賀氏菌檢驗(yàn)，GB 4789.5-2012.5 飼料中志賀氏菌的檢測方法，GB/T 8381.2-2005.6 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌、志賀氏菌和致瀉大腸埃希氏菌的腸桿菌科噬菌體診斷檢驗(yàn)，GB 4789.31-2013.7 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 志賀菌檢測方法，GB/T 14926.47-2008 .8 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 墊料，DB32/T 2129-2012.9 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 墊料，DB11/T 1126-2014.10 李志明. 志賀氏菌傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法研究進(jìn)展J. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào), 2019, 10(03):15-19.11 任慧婧, 劉蕓, 王美會(huì), et al. 志賀氏菌檢測方法的研究進(jìn)展J. 河南農(nóng)業(yè), 2015(14):52-53.12 ISO 21567：2004 Microbiology of food and animalfeeding stuffs Horizontal method for the detection of shigella spp.13 AOAC Official Method 967.25-967.28 SalmonellainProcessed Foods Detection.14 美國FDA細(xì)菌學(xué)分析手冊第八版（BAM） 志賀氏菌.