編制說明項目名稱：動物墊料中大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢測方法 項目編號：內(nèi)質(zhì)監(jiān)標(biāo)函（2018）154號-109 編制單位：呼和浩特海關(guān) 編制時間：2018.6-2019.9 一、 工作簡況本標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)關(guān)于下達2018年第一批內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂項目計劃的通知內(nèi)質(zhì)監(jiān)標(biāo)函（2018）154號，本標(biāo)準(zhǔn)是由呼和浩特海關(guān)提出并歸口，項目計劃編號為109。呼和浩特海關(guān)牽頭成立由相關(guān)領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員和具有標(biāo)準(zhǔn)化專業(yè)知識的人員組成的標(biāo)準(zhǔn)起草組。起草組在充分調(diào)查研究、綜合分析和試驗驗證的基礎(chǔ)上，起草標(biāo)準(zhǔn)初稿和編制說明，并廣泛征求意見。對意見進行匯總整理，修改完善標(biāo)準(zhǔn)初稿，形成地方標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿。第一起草單位：中華人民共和國呼和浩特海關(guān)；第二起草單位：二連浩特市疾病預(yù)防控制中心；第三起草單位：內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院。主要起草人：趙治國、崔強、郭文麗、延涵、王海艷、陳林軍、敖威華、韓祎陟、羅曉平、李軍燕。二、標(biāo)準(zhǔn)制定的背景及意義動物墊料與動物關(guān)系密切。近年來隨著生物科學(xué)研究的飛速發(fā)展，動物作為其研究中不可缺少的重要組成部分，備受各國政府的重視和科學(xué)家的關(guān)注。墊料為動物營造舒適的人工環(huán)境，進行環(huán)境控制的基礎(chǔ)條件和必要材料，是對動物產(chǎn)生直接作用和影響的環(huán)境因素。動物墊料與動物健康、福利息息相關(guān)，同時也對養(yǎng)殖業(yè)、動物及其相關(guān)科研方面甚至社會經(jīng)濟發(fā)展有十分重大的影響。因此，墊料的質(zhì)量評定與控制十分重要。 我國動物墊料標(biāo)準(zhǔn)化、商品化尚處于初級階段。歐美等發(fā)達國家早已實行墊料商品化生產(chǎn)，有專業(yè)的工廠，并且各道工序的質(zhì)量控制要求非常嚴(yán)格。但我國對動物墊料的研究與應(yīng)用還處于初級階段，與墊料相關(guān)的文獻報道甚少，墊料生產(chǎn)監(jiān)管環(huán)節(jié)薄弱，檢測標(biāo)準(zhǔn)缺乏。近年來我國政府及畜牧從業(yè)人員逐漸認(rèn)識到動物墊料中存在的問題，開始對墊料質(zhì)量評價方面的問題進行改進。因此要想使動物的質(zhì)量管理與國際接軌，動物墊料生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化、商品化就變得至關(guān)重要。我國動物墊料標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量管理相對滯后，影響相關(guān)行業(yè)發(fā)展。我國對動物墊料的研究才剛剛起步，現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)和實驗動物相關(guān)管理條例中，對動物墊料的標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)定幾乎空白，僅有的資料對于墊料的規(guī)定只有：應(yīng)選用吸濕性好、塵埃少、無異味、無毒性、無油脂的材料；須經(jīng)消毒、滅菌后方可使用。如此籠統(tǒng)的規(guī)定在一定程度上制約了我國動物墊料標(biāo)準(zhǔn)不能緊跟國際標(biāo)準(zhǔn)，同時限制了藥品、生物制品、動物等相關(guān)產(chǎn)品的出口，還使科研論文將不能被同行接受。因此要想提高相關(guān)學(xué)科競爭力，就必須加強墊料標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量管理，從動物墊料微生物指標(biāo)監(jiān)測入手。我國動物墊料微生物檢測標(biāo)準(zhǔn)幾乎空白，亟待建立相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。近年來，我國政府及從業(yè)人員逐漸認(rèn)識到動物墊料對動物健康及下游產(chǎn)業(yè)的重大意義，墊料相關(guān)研究報道逐年增多，積累了一定的理論基礎(chǔ)。但目前，我國尚未對國內(nèi)墊料質(zhì)量建立統(tǒng)一評價體系、風(fēng)險分析、國家標(biāo)準(zhǔn)及配套法規(guī)。其中，墊料中微生物特別是致病微生物的含量對動物健康、福利和產(chǎn)品等影響重大，但目前動物墊料中微生物檢測標(biāo)準(zhǔn)屬于空白，亟待建立科學(xué)完善的動物墊料微生物檢測標(biāo)準(zhǔn)，該工作將對國內(nèi)墊料建立統(tǒng)一 質(zhì)量評價體系、風(fēng)險分析及產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)等有力促進。大腸埃希氏菌O157 ( Escherichia coli O157) 是一種出血性致病性大腸桿菌, 能引起人類出血性腹瀉和溶血性尿毒綜合征, 其感染已成為世界性公共衛(wèi)生問題。我國于1987 年首次從出血性結(jié)腸炎患者中分離到O157：H7/NM 型大腸埃希氏菌。以后陸續(xù)有10 余個省份在市售食品、進口食品、家禽家畜和腹瀉病患者中檢出該菌。局部地區(qū)還發(fā)生了流行, 表明該病已逐漸成為威脅人群健康的重要公共衛(wèi)生問題。如何控制E.coli O157：H7/NM 的感染是目前公共衛(wèi)生學(xué)中的重要課題, 現(xiàn)已證實家畜( 禽) 是E.coli O157：H7/NM公認(rèn)的宿主動物, 且?guī)Ь啪臅r間較長, 經(jīng)食物傳播是E.coliO157：H7/NM的最主要的傳播途徑, 感染力強, 只要有1 00010 000 個菌從口中進入就會在腸內(nèi)大量繁殖, 呈食物中毒型暴發(fā)。近年來E.coliO157主要的疫情的發(fā)生地德國已有16個州發(fā)生疫情，確診病例和疑似病例超過4000人。另外，瑞典、丹麥、荷蘭、法國、英國、波蘭、奧地利等10多個歐洲國家和美國近期也都出現(xiàn)了上述病例報告，現(xiàn)已造成30多人死亡。E.coliO157感染是一種人畜共患病。凡是體內(nèi)染有該菌的人及帶菌家畜、家禽等都可傳播。如牛肉、奶制品的污染大多來自帶菌牛；帶菌動物在其活動范圍內(nèi)也可通過排泄的糞便污染。由E.coliO157引起的食物中毒已造成數(shù)十億美元的損失。因此對家畜( 禽) 及畜禽產(chǎn)品中E.coli O157：H7/NM的檢驗, 將有助于控制食物源致病菌的污染, 為人類健康提供服務(wù)。動物墊料中E.coli O157：H7/NM對動物的危害極大。動物墊料E.coli O157：H7/NM是影響動物健康和動物實驗結(jié)果的國際公認(rèn)的重要環(huán)境因素之一，因此動物墊料中E.coli O157：H7/NM的檢測十分重要。E.coli O157：H7/NM常寄居在人和動物的消化道，感染后的主要癥狀正是出血性腹瀉，引起人和動物的出血性腹瀉和腸炎，嚴(yán)重者可伴發(fā)溶血尿毒綜合征，病原隨糞便排出體外，E.coli O157：H7/NM在37環(huán)境條件下可耐受5小時，耐低溫，能在冰箱等低溫條件下長期生存；在自然界的水中可存活數(shù)周至數(shù)月，其廣泛分布在水和土壤中。當(dāng)機體免疫力降低或侵入腸道外組織時，成為條件致病菌而引起疾病，不但能通過污染食物導(dǎo)致人的食物中毒，而且還能引起家畜、家禽及其他動物發(fā)生急性、慢性或隱性感染，對動物造成很大的威脅。近年由E.coli O157：H7/NM大腸埃希氏菌引起的暴發(fā)流行日趨增多, 其較高的死亡率引起重視。隨著流行病學(xué)調(diào)查深入, 在不同宿主動物中發(fā)現(xiàn)了E.coli O157：H7/NM的存在, 在北美和歐洲, 健康牛和病牛的糞便帶菌率從不足1 %10 %, 其它動物如羊、雞、豬、兔、鵝、馬、鹿、海鷗等動物亦是該菌的貯存宿主。動物體內(nèi)排出的E.coli O157：H7/NM，也可能污染食物導(dǎo)致人的食物中毒。因此檢測墊料中E.coli O157：H7/NM成為重中之重。建立動物墊料E.coli O157：H7/NM檢測標(biāo)準(zhǔn)，保障動物健康急不可待。動物墊料與動物糞便直接接觸，容易滋生細(xì)菌，尤其是腸道致病微生物，致使墊料被E.coli O157：H7/NM污染，從而威脅動物的健康與福利，并且對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展與國際間動物及產(chǎn)品貿(mào)易帶來巨大的影響，甚至威脅到人類社會的生產(chǎn)與生活。對于動物墊料E.coli O157：H7/NM檢測標(biāo)準(zhǔn)幾乎空白，還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和方法，所以建立動物墊料E.coli O157：H7/NM檢測標(biāo)準(zhǔn)已刻不容緩。本實驗室具有多年微生物檢測的經(jīng)驗，本方法的開發(fā)和應(yīng)用，在檢測技術(shù)方面填補我區(qū)的空白、彌補了自治區(qū)沒有現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的不足，能夠使動物墊料中E.coli O157：H7/NM的檢測更加高效、準(zhǔn)確、安全。本方法的開發(fā)和應(yīng)用將會使我區(qū)在動物墊料中E.coli O157：H7/NM的檢測先進性方面達到國內(nèi)領(lǐng)先水平，為我區(qū)動物墊料質(zhì)量安全管理部門更快更好的管控提供可靠保障。因此，加強動物墊料中E.coli O157：H7/NM的檢測對確保全區(qū)農(nóng)業(yè)持續(xù)、健康發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。三、主要起草過程2018.06-2018.08 地標(biāo)前期基礎(chǔ)工作：收集動物墊料樣本，查閱E.coli O157：H7/NM資料，檢索E.coli O157：H7/NM檢測的相關(guān)文獻及標(biāo)準(zhǔn)。2018.09-2019.09 前期實驗條件的摸索：包括前處理方法的優(yōu)化、對照，不同墊料中E.coli O157：H7/NM的檢出率，最終確定實驗方案，編寫編制說明。2019.10-2019.11 驗證單位進行驗證。2019.12 編寫地標(biāo)并定初稿。四、現(xiàn)行法律、法規(guī)和強制性標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系本標(biāo)準(zhǔn)遵循GB/T 1.1-2009 標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫和GB/T 20001.4-2015 標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則 第4部分：試驗方法標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)則編寫。還參照相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)編寫指南的要求。在編制本標(biāo)準(zhǔn)的過程中參考了以下標(biāo)準(zhǔn)：ISO 16654:2017 Microbiology Of Food And Animal Feeding Stuffs - Horizontal Method For The Detection Of Escherichia Coli O 157、 AOAC Official Method 996.10 Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157：H7、BAM:EnumerationofEscherichiacoliandtheColiformBacteria、美國FDA細(xì)菌學(xué)分析手冊第八版（BAM） E.coli O157：H7、GB 14925-2010實驗動物環(huán)境及設(shè)施、GB 4789.6-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗、 GB 4789.36-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢驗、GB/T 22429-2008 食品中沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157及單核細(xì)胞增生李斯特菌的快速篩選檢驗 酶聯(lián)免疫法、SNT 0973-2010 進出口肉、肉制品及其他食品中腸出血性大腸桿菌O157:H7檢測方法、江蘇省DB32/T 2599-2013 畜禽腸出血性大腸桿菌O157:H7 的檢測；綜合參考了國內(nèi)外與E.coli O157：H7檢測相關(guān)的檢測標(biāo)準(zhǔn)，力求該標(biāo)準(zhǔn)能夠高效準(zhǔn)確的檢測墊料中E.coli O157：H7，同時兼顧標(biāo)準(zhǔn)的廣泛應(yīng)用。本標(biāo)準(zhǔn)完全符合現(xiàn)行法律法規(guī)和強制性標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，不存在任何與現(xiàn)行法律法規(guī)和強制性標(biāo)準(zhǔn)相違背之處。相關(guān)強制性標(biāo)準(zhǔn)2項：GB 14925-2010 實驗動物 環(huán)境及設(shè)施，本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了實驗動物及動物實驗設(shè)備和環(huán)境的技術(shù)要求及檢測方法，同時規(guī)定了墊料、飲水和籠具的原則要求。但針對墊料該標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了“墊料的材質(zhì)應(yīng)符合動物的健康和福利要求，應(yīng)滿足吸濕性好、塵埃少、無異味、無毒性、無油脂、耐高溫、耐高壓等條件；墊料必須經(jīng)滅菌處理后方可使用” 。本地標(biāo)適用于墊料中E.coli O157：H7/NM檢測，明確規(guī)定了不同類別墊料取樣方法，標(biāo)準(zhǔn)中E.coli O157：H7/NM鑒定過程增加了新的鑒定手段，確保檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確。5、 主要內(nèi)容及檢測方法的確定5.1 取樣方法的確定及優(yōu)化根據(jù)動物墊料的物理性狀將其分為顆粒狀/粉末狀墊料和平面狀墊料，針對不同性狀的墊料采取不同的取樣方法。5.1.1 顆粒狀或粉末墊料樣品取樣方法國內(nèi)外食品和飼料中霉菌檢測法中常用的取樣方法為稱取法，本標(biāo)準(zhǔn)中針對顆粒狀或粉末墊料樣品（木屑、玉米芯、秸稈、紙屑等）參考通用做法采用稱取25 g的方法進行取樣。5.1.2 平面墊料樣品取樣方法針對平面墊料（膠墊、托盤等）采用表面涂抹取樣法，無菌操作將涂抹25 cm2-100 cm2平面樣品的棉拭子置入裝有 25 mL-100 mL mEC+n肉湯中，混勻作為原液。5.2 培養(yǎng)基的選擇5.2.1 選擇性增菌培養(yǎng)基國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)和資料中用到的預(yù)增菌稀釋液主要有：改良EC肉湯(mEC+n)、滅菌生理鹽水、添加新生霉素的肉湯（EC）、胰酪胨大豆肉湯（TSB）、通用前增菌肉湯（UPB）和營養(yǎng)肉湯（NB）等。其中，改良EC肉湯的主要成分胰蛋白胨提供碳氮源；氯化鈉可維持均衡的滲透壓；乳糖是可發(fā)酵的糖類；磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀為緩沖劑，這些成分為E.coli O157：H7/NM的生長、繁殖提供了豐富的營養(yǎng)環(huán)境和良好的生長環(huán)境；其中三號膽鹽和新生霉素能夠抑制通常在飼料中存在的雜菌，所以改良EC肉湯的選擇性培養(yǎng)最好，而不同標(biāo)準(zhǔn)中使用最多的是改良EC肉湯，因此本標(biāo)準(zhǔn)也選用該預(yù)增菌稀釋液。5.2.2 分離培養(yǎng)基 由于改良山梨醇麥康凱瓊脂（CT-SMAC）中的三號膽鹽、結(jié)晶紫能夠抑制革蘭氏陽性菌的生長，亞碲酸鉀抑制非O157的大腸桿菌，而頭孢克肟抑制變形桿菌，因此本標(biāo)準(zhǔn)選用的E.coli O157：H7/NM分離培養(yǎng)基均為國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)中比較認(rèn)可的CT-SMAC和大腸埃希氏菌O157顯色培養(yǎng)基，同國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.36-2016所用培養(yǎng)基相同，保證檢測結(jié)果的同時，兼顧不同標(biāo)準(zhǔn)所用培養(yǎng)基的一致性，節(jié)約實驗室成本。 5.3 典型或可疑菌落的鑒定 本標(biāo)準(zhǔn)對典型或可疑菌落的鑒定過程，參考了國內(nèi)外E.coli O157：H7/NM檢測標(biāo)準(zhǔn)和藥典等成熟做法，綜合了生化反應(yīng)、血清學(xué)試驗等必要鑒定過程，并囊括了全自動微生物檢測系統(tǒng)和酶聯(lián)免疫檢測系統(tǒng)快速方法，增加了飛行時間質(zhì)譜檢測方法，做到了與國際接軌，縮短檢測時間，增加檢測通量，減少檢測人員工作量。5.4 培養(yǎng)時間和溫度最新的ISO 16654:2017采納了美國和日本標(biāo)準(zhǔn)中常用的361的增菌溫度，而我國常用的E.coli O157：H7/NM培養(yǎng)溫度為361，也在這一范圍內(nèi)，本標(biāo)準(zhǔn)將繼續(xù)采用我國常用的361對E.coli O157：H7/NM進行檢測培養(yǎng)。本標(biāo)準(zhǔn)各種培養(yǎng)基培養(yǎng)時間也與國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)常用時間相統(tǒng)一。六、方法驗證為驗證本方法的有效性和適用性，選擇5家不同行業(yè)的檢測機構(gòu)對本方法進行驗證，驗證內(nèi)容為方法的適用性、準(zhǔn)確度、檢出率及相關(guān)樣品的檢測，結(jié)果顯示該方法穩(wěn)定可靠，符合相關(guān)要求。七、結(jié)論綜上所述，本標(biāo)準(zhǔn)在制定過程中所涉及到的各項技術(shù)指標(biāo)均經(jīng)過方法學(xué)的驗證，并切實可行，完全達到了編制標(biāo)準(zhǔn)的要求。八、重大意見分歧的處理依據(jù)和結(jié)果未發(fā)生。九、國內(nèi)外情況簡要說明國內(nèi)尚沒有建立統(tǒng)一的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。檢索國家標(biāo)準(zhǔn)1項和地方標(biāo)準(zhǔn)2項：GB 14925-2010 實驗動物 環(huán)境及設(shè)施、江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)DB32/T 2129-2012 實驗動物 墊料、北京市地方標(biāo)準(zhǔn)DB11/T 1126-2014實驗動物 墊料。根據(jù)文獻報道尚未發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古自治區(qū)內(nèi)有相關(guān)單位從事這項研究。10、 標(biāo)準(zhǔn)草稿征求意見情況匯總表序號意見提出單位/專家采納不采納（說明原因）1建議在標(biāo)準(zhǔn)適當(dāng)位置增加“E.coli O157：H7/NM檢測流程圖”。二連海關(guān)技術(shù)中心/王伊琴采納2建議將新型“飛行時間質(zhì)譜法”加入到標(biāo)準(zhǔn)。赤峰海關(guān)技術(shù)中心/趙敏采納3無修改建議。蘭州海關(guān)技術(shù)中心/張宇霞4無修改建議。包頭海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心/張鵬翔參考文獻：1 GB/T 1.1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則.2 GB/T 20001.4-2015標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則 第4部分：試驗方法標(biāo)準(zhǔn).3 GB 14925-2010實驗動物環(huán)境及設(shè)施.4 GB 4789.36-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢驗.5 GB/T 22429-2008食品中沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157及單核細(xì)胞增生李斯特菌的快速篩選檢驗 酶聯(lián)免疫法.6 GB 4789.6-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗.7 DB32/T 2599-2013畜禽腸出血性大腸桿菌O157:H7 的檢測.8 SNT 0973-2010進出口肉、肉制品及其他食品中腸出血性大腸桿菌O157:H7檢測方法.9 DB32/T 2129-2012實驗動物 墊料.10 DB11/T 1126-2014實驗動物 墊料.11 王燕，謝貴林，杜琳. 大腸桿菌O157:H7感染流行概況J. 微生物學(xué)免疫學(xué)進展, 2008, 36(1):51-58.12 周雯，陳雨欣，蘇粉良,等. 大腸埃希氏茵O157H7三種標(biāo)準(zhǔn)中的檢測方法比較J. 農(nóng)產(chǎn)品加工月刊，2016(11).13 ISO 16654:2017Microbiology Of Food And Animal Feeding Stuffs - Horizontal Method For The Detection Of Escherichia Coli O 157.14 AOAC Official Method 996.10 Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157：H7.15 美國FDA細(xì)菌學(xué)分析手冊第八版（BAM） Escherichia Coli O 157.