歡迎進入生物課堂 微生物的培養(yǎng)與應用 微生物培養(yǎng)基的配制 微生物培養(yǎng)基的配制和滅菌 微生物培養(yǎng)基的配制和滅菌 目的要求實驗材料實驗程序 目的要求 了解培養(yǎng)基的配制原理和方法 掌握其配制過程 了解幾種滅菌方法 掌握干熱滅菌法和加壓蒸汽滅菌法的原理及其使用方法 熟悉分離 培養(yǎng)微生物前的有關準備工作及操作方法 實驗材料 藥品 牛肉膏 蛋白胨 氯化鈉 瓊脂 馬鈴薯 蔗糖 可溶性淀粉 K2HPO4 KNO3 MgSO4 7H2O FeSO4 7H2O等 高壓蒸汽滅菌器 恒溫干熱滅菌箱 細菌過濾器 紫外線殺菌燈 其它 天平 牛角匙 電爐 2MHCl 2MNaOH pH試紙 刻度搪瓷杯 量筒 漏斗 漏斗架 玻棒 帶玻璃珠的三角瓶 帶棉塞的無菌試管 無棉塞的空試管 培養(yǎng)皿 吸管 各種包裝紙 防水紙 繩索 棉花 標簽等 實驗程序 培養(yǎng)基的配制分離培養(yǎng)微生物常用器皿的準備培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法 實驗程序1 培養(yǎng)基的配制 培養(yǎng)基培養(yǎng)基的配制原則培養(yǎng)基的種類培養(yǎng)基的配制方法和步驟培養(yǎng)基的配方及配制無菌水的制備 培養(yǎng)基是人工配制的適合于不同微生物生長繁殖或積累代謝產物的營養(yǎng)基質 它是進行科學研究 發(fā)酵生產微生物制品等的基礎 培養(yǎng)基的配制原則 一 營養(yǎng)成分二 PH值三 滲透壓四 氧化還原電位 一 營養(yǎng)成分1 根據不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基 如自養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基完全可以 或應該 由簡單的無機物質組成 異養(yǎng)做生物的培養(yǎng)基至少需要含有一種有機物質 按微生物的主要類群來說 又有細菌 放線菌 酵母菌和霉菌之分 它們所需要的培養(yǎng)基成分也不同 分別稱為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 高氏1號合成培養(yǎng)基 麥芽汁培養(yǎng)基 查氏合成培養(yǎng)基 培養(yǎng)基的配制原則 碳源 carbonsource 凡是提供微生物營養(yǎng)所需的碳元素 碳架 的營養(yǎng)源 稱為碳源 碳源物質的功能 構成細胞物質 為機體提供整個生理活動所需要的能量 異養(yǎng)微生物 微生物的碳源譜無機含碳化合物 如CO2和碳酸鹽等 有機含碳化合物 糖與糖的衍生物 脂類 醇類 有機酸 烴類 芳香族化合物以及各種含氮的化合物 培養(yǎng)基的配制原則 氮源 nitrogensource 凡是提供微生物營養(yǎng)所需的氮元素的營養(yǎng)源 稱為氮源 氮源物質的主要作用是合成細胞物質中含氮物質 少數自養(yǎng)細菌能利用銨鹽 硝酸鹽作為機體生長的氮源與能源 某些厭氧細菌在厭氧與糖類物質缺乏的條件下 也可以利用氨基酸作為能源物質 實驗室常用的無機氮源有碳酸銨 硝酸鹽 硫酸銨 尿素 蛋白胨 牛肉膏 酵母膏等 生產上常用的氮源有硝酸鹽 銨鹽 尿素 氨以及蛋白含量較高的魚粉 蠶蛹粉 黃豆餅粉 花生餅份 玉米漿等 培養(yǎng)基的配制原則 能源指能為微生物的生命活動提供最初能量來源的營養(yǎng)物或輻射能 微生物的能源譜 有機物 化能異養(yǎng)微生物的能源 同碳源 化學物質能源譜 無機物 化能自養(yǎng)微生物的能源 不同于碳源 輻射能 光能自養(yǎng)和光能異養(yǎng)微生物的能源 培養(yǎng)基的配制原則 化能自養(yǎng)微生物的能源物質都是一些還原態(tài)的無機物質 例如 NH4 NO2 S H2S H2 Fe2 等 能利用這些物質作為能源的全部是細菌 如 硝酸細菌 亞硝酸菌 硫化細菌 硫細菌 鐵細菌 硫細菌 氫細菌和鐵細菌等 這些無機養(yǎng)料常常是雙功能的 如 NH4 既是硝酸細菌的能源 又是它的氮源 有機營養(yǎng)物常有雙功能或三功能作用 既是異養(yǎng)微生物的能源 又是它們的碳源或氮源 輻射能是單功能的 只為光能微生物提供能源 培養(yǎng)基的配制原則 2 注意各種營養(yǎng)物質的濃度與配比營養(yǎng)物的濃度 在一般情況下 濃度合適的營養(yǎng)物質才對微生物表現出良好作用 濃度大時對微生物生長起抑制作用 濃度小時不能滿足微生物生長的需要 各營養(yǎng)物質之間的濃度比 培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物質之間的濃度比直接影響微生物的生長與繁殖和 或 代謝產物的形成與積累 尤其是碳氮比 C N 碳氮比一般指培養(yǎng)基中元素碳與元素氮的比值 有時也指培養(yǎng)基中還原糖與粗蛋白兩種成分含量之比 的影響更為明顯 培養(yǎng)基的配制原則 二 控制培養(yǎng)基的PH值各類微生物生長的最適pH各不相同 細菌與放線菌生長的pH在7 7 5之間 酵母菌與霉菌生長的pH值在4 5之間 在微生物的生長和代謝過程中 由于營養(yǎng)物質的利用和代謝產物的形成與積累 常會改變培養(yǎng)基的pH值 為了維持培養(yǎng)基pH值的相對恒定 通常采用下列兩種方式 內源調節(jié) 在培養(yǎng)基里加一些緩沖劑或不溶性的碳酸鹽 調節(jié)培養(yǎng)基的碳氮比 外源調節(jié) 按實際需要流加酸或堿液 培養(yǎng)基的配制原則 三 滲透壓 注意營養(yǎng)物質要有適合的濃度 不能太低滿足不了生長的需要 太高則滲透壓太大 也會抑制微生物的生長 培養(yǎng)基的配制原則 四 氧化還原電位 氧化還原電位越高 培養(yǎng)基的氧化活動越強 在厭氧菌培養(yǎng)中 加入還原劑 可降低自由氧的毒害 培養(yǎng)基的配制原則 培養(yǎng)基的種類 據組成成分可分為 1 合成培養(yǎng)基 由各種純化學物質按一定比例配制而成2 半合成培養(yǎng)基 有一部分純化學物質和另一部分天然物質配制而成3 天然培養(yǎng)基 利用天然來源的有機物配制而成 從培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可分為1 液體培養(yǎng)基 不加凝固劑 常用凝固劑為瓊脂 的液體狀態(tài)培養(yǎng)基2 固體培養(yǎng)基 在液體培養(yǎng)基中加入2 左右的凝固劑的固體狀態(tài)的培養(yǎng)基或農副產品培養(yǎng)基3 半固體培養(yǎng)基 在液體培養(yǎng)基中加入0 2 0 5 凝固劑而成的半固體狀培養(yǎng)基 按照培養(yǎng)基的用途 可將其分為1 加富培養(yǎng)基 加富培養(yǎng)基是指在普通培養(yǎng)基里加過血 血清 動物 或植物 組織液或其他營養(yǎng)物質 或生長因子 的一類營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基 用以培養(yǎng)某種或某類營養(yǎng)要求苛刻的異養(yǎng)微生物2 選擇培養(yǎng)基 選擇培養(yǎng)基是根據某種或某一類群微生物的特殊營養(yǎng)需要或對某種化合物的敏感性不同而設計出來的一類培養(yǎng)基 利用這種培養(yǎng)基可以將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來 3 鑒別培養(yǎng)基 普通培養(yǎng)基中加入能與某種代謝產物發(fā)生反應的指示劑或化學藥品 從而產生某種明顯的特征性變化 以區(qū)別不同的微生物 培養(yǎng)基的配制原則 培養(yǎng)基的配制方法和步驟 稱量 按照配方正確稱取各種原料放于搪瓷杯中 溶化 在搪瓷杯中加入所需水量 玻棒攪勻 加熱溶解 調pH值 用2MNaOH或2MHCl調pH 用pH試紙對照 加瓊脂溶化 加熱過程中要不斷攪拌 可適當補水 分裝 注意不要污染棉塞 包扎成捆 掛上標簽 必須用鉛筆寫 注明何種培養(yǎng)基 滅菌備用 培養(yǎng)基滅菌后必須在370C下恒溫培養(yǎng)24h 確定無菌生長 方可使用 培養(yǎng)基的配制原則 培養(yǎng)基的配制原則 培養(yǎng)基的配制原則 培養(yǎng)基的配制原則 糖發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖 乳糖 217頁 蛋白胨水培養(yǎng)基 217頁 葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基 218頁 檸檬酸鹽培養(yǎng)基 218頁 斜面 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 斜面 三角瓶 214頁 H2S培養(yǎng)基淀粉培養(yǎng)基 217頁 三角瓶 高氏培養(yǎng)基 214頁 三角瓶 培養(yǎng)基的配方 培養(yǎng)基的配制原則 H2S培養(yǎng)基 蛋白胨 10g胱氨酸 0 1gNa2SO4 0 1g水 1000mlPH 7 2濾紙條若干 浸于8 醋酸鉛液 取出吹干 分裝入試管 滅菌 注意事項 培養(yǎng)基配方在附錄 按照每組的安排來配制 每人配的不一定都相同按照書上的比例 但總量有變 所有配方均為1000ml量 同學們需要根據不同要求換算 配溶液調PH值加瓊脂粉滅菌 在老師監(jiān)督下進行 普通微生物培養(yǎng)基配制可以使用自來水 在細胞培養(yǎng)以及分子試驗中需要區(qū)別對待 實驗程序2 分離培養(yǎng)微生物常用器皿的準備 清洗一些玻璃儀器 如三角燒瓶 試管 培養(yǎng)皿 吸管等 棉塞的制作包裝培養(yǎng)皿和吸管等 實驗程序3 培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法 干熱滅菌法 電熱烘箱作為干熱滅菌器加壓蒸汽滅菌法其步驟如下 1 滅菌器內加入一定量的水 將用防水紙包扎好的物品放入其中 2 接通電源 進行加熱 3 排除高壓鍋內的冷空氣 可將排氣閥打開 待排出大氣后關閉排氣閥 或關閉排氣閥 待壓力上升到0 5kg cm2時再打開排氣閥 待壓力回復到0時再關閉排氣閥 4 當壓力達15bl in2 即1 05kg cm2 時 此時滅菌器內的溫度為1210C 維持30min 對熱不穩(wěn)定的培養(yǎng)基如含有葡萄糖 氨基酸等物時 應適當降低壓力 延長時間 5 滅菌時間一到 切斷電源 待壓力降至零時 才能打開排氣閥 然后打開滅菌器蓋 取出物品 培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法 濕熱滅菌法菌體吸收水分蛋白質較易凝固濕熱的穿透力比干熱大 水的傳熱能力比許多非導體的固體強濕熱的蒸汽有潛熱存在 1g水在100 由液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)可放出2 26kJ 可增強滅菌效果 培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法 培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法 培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法 培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法 間歇滅菌法 待滅菌的物品放在滅菌器或蒸籠里 每天蒸煮1次 每次煮沸1h 連續(xù)3d重復進行 在每兩次蒸煮之間 將物品 指培養(yǎng)基 放在370C恒溫條件下培養(yǎng)過夜 這樣可以使每次蒸煮后未殺死殘留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體 以便下次蒸煮時殺滅 培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法 過濾除菌法 不能用加熱滅菌的液體物質 如維生素 血清 一般可用細菌過濾器進行除菌 培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法 紫外線滅菌法 一般30W燈管 9m3空間 距地面2m每次打開紫外線照射0 5h 就使室內空氣滅菌 若照射紫外線時先噴灑石炭酸等化學消毒劑 可增強滅菌效果 紫外線雖有較強的殺菌力 但穿透力弱 即使一薄層玻璃或水層就能將大部分紫外線濾除 因此只適用于空氣及表面殺菌 培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法 化學藥劑消毒滅菌 微生物實驗室中常用的化學殺菌劑有升汞 甲醛 高錳酸鉀 酒精 碘酒 龍膽紫 石炭酸 漂白粉 新潔爾滅 煤酚皂溶液 它們有的是殺菌劑 有的是抑菌劑 培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法 試驗報告要求 寫出培養(yǎng)基配制的原則配制培養(yǎng)基的配方 及方法培養(yǎng)基蒸汽滅菌原理 方法 思考題 培養(yǎng)基中加瓊脂的作用是什么 干熱滅菌 高壓蒸汽滅菌和間歇滅菌的場合有何不同 如何檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底 同學們 來學校和回家的路上要注意安全 同學們 來學校和回家的路上要注意安全