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原位雜交技術(shù) in situ hybridization,,核酸分子雜交技術(shù),在研究DNA分子復制原理的基礎上發(fā)展起來的一種技術(shù)。兩條核苷酸單鏈片段，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA雙鏈分子 按其作用方式可大致分為兩種：固相雜交和液相雜交 液相雜交是指參加反應的兩條核酸鏈都游離在溶液中。液相分子雜交技術(shù)包括吸附雜交、發(fā)光液相雜交、液相夾心雜交和復性速率液相分子雜交等,固相雜交是將參加反應的一條核酸鏈固定在固體的支持物上（常用的有硝酸纖維素濾膜，其它如尼龍膜、乳膠顆粒和微孔板等），另一條參加反應的核酸鏈游離在溶液中。固相雜交包括： 菌落原位雜交（colony in situ hybridization）、 斑點雜交（Dot blot）、 Southern印跡雜交（Southern blot） Northern印跡雜交（Northern blot） 組織原位雜交（Tissue in situ hybridization），即原位雜交組織化學技術(shù)和原位雜交免疫細胞化學技術(shù),原位雜交技術(shù)的基本原理,利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基順序，通過堿基對之間非共價鍵的形成，出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，形成雜交的雙鏈。 1.兩條核苷酸單鏈片段，在適宜的條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 雙鍵分子 2.應用帶有標記的（有放射性同位素，如3H、35S、32P，熒光素、生物素、地高辛等非放射性物質(zhì))DNA或 RNA片段作為核酸探針,與組織切片或細胞內(nèi)待測核酸(RNA或DNA）片段進行雜交 3.用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的 mRNA或DNA 的存在與定位,用原位雜交術(shù)，可在原位研究細胞合成某種多肽或蛋白質(zhì)的基因表達。 此方法有很高的敏感性和特異性，可進一步從分子水來探討細胞的功能表達及其調(diào)節(jié)機制。已成為當今細胞生物學、分子生物學研究的重要手段。,Aromase gene The rat brain section,In situ hybridization,培養(yǎng)細胞,原位雜交組織化學技術(shù)發(fā)展,1961年，Hall 液相核酸雜交技術(shù) 1969年，Gall 和Pardue 用爪蟾核糖體基因探針與其卵母細胞雜交，確定該基因定位于卵母細胞的核仁中。 1969年，Buongiorno-Nardelli和Amaldi John 利用同位素標記核酸探針進行了細胞或組織的基因定位，創(chuàng)造了原位雜交細胞或組織化學技術(shù)。 Orth（1970）應用3H標記的兔乳頭狀瘤病毒cRNA探針與兔乳頭狀瘤組織的冰凍切片進行雜交，首次用原位雜交檢測了病毒DNA在細胞中的定位，但當時的工作多采用冰凍組織切片或培養(yǎng)細胞，探針均采用同位素標記。,由于同位素標記探針具有放射性既污染環(huán)境，又對人體有害，且受半衰期限制等缺點，科學工作者們開始探索用非放射性的標記物標記核酸探針進行原位雜交。 Bauman（1981）等首先應用熒光素標記cRNA探針做原位雜交，然后用熒光顯微鏡觀察獲得成功。 Shroyer（1982）報道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）標記DNA探針，使該DNA探針具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗體來識別雜交后的探針，最后經(jīng)免疫過氧化物酶的方法來定位雜交探針。 這兩種方法至今仍有采用，但因敏感度不夠高，應用不夠普遍。,Pezzella（1987）創(chuàng)建了用磺基化DNA探針來做細胞或組織原位雜交的方法，其基本原理是使DNA探針的胞嘧啶堿基磺基化，利用單克隆抗體識別磺基化探針，再通過免疫組化方法顯示結(jié)合的單克隆抗體，從而對雜交結(jié)合的探針進行定位。 本法的優(yōu)點是磺基化DAN探針標記簡便，不需作缺口平移標記，敏感度也較高。 生物素標記探針技術(shù)是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素標記的探針在組織切片上檢測了病毒DNA，通過生物素與抗生物素結(jié)合，過氧化物酶-抗過氧化物酶顯示系統(tǒng)顯示病毒DNA在細胞中的定位。 生物素標記探針技術(shù)目前已被廣泛應用，特別是在病毒學和病理學的臨床診斷中。,上述生物素標記技術(shù)又叫酶促生物素標記技術(shù)。另一種叫光促生物素標記核酸技術(shù)（1985） ，該技術(shù)是用光敏生物素（Photobiotin）標記核酸。目前應用的光敏生物素有乙酸鹽和補骨脂素生物素，它們都是由三個部分組成：光敏基團、連結(jié)臂和生物素。在強光下，不需酶反應，光敏生物素的光敏基團即可與核酸中的堿基相結(jié)合。 光敏生物素標記核酸，方法簡單，靈敏度也不低，但標記效率不高，每100～150個堿基才能標記一個生物素，對于短的基因探針特別是寡核苷酸探針不宜使用，以免因標記數(shù)過少而影響靈敏度。,近年來，地高辛（Digoxigonin）標記技術(shù)引起科技工作者的極大興趣。Boeringer Mannhem Bio－chemisca于1987年將地高辛標記的有關(guān)試劑及藥盒投放市場。 和其它非放射性標記物一樣，地高辛較放射性標記系統(tǒng)安全，方便、省時間。同時在敏感性和質(zhì)量控制方面比生物素標記技術(shù)要優(yōu)越，可以檢測出人基因組DNA中的單拷貝基因。地高辛標記法顯示的顏色為紫藍色（標記堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶顯色系統(tǒng)），有較好的反差背景。,核酸探針的分類,核酸探針根據(jù)標記方法的不同可粗略分為放射性探針和非放射性探針兩類。 根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同可分為DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針和寡核苷酸探針等。 DNA探針還有單鏈DNA（Single stranded, ssDNA）和雙鏈DNA（Double stranded, dsDNA）之分。,早期應用的主要是DNA探針 Temin在70年代研究致癌RNA病毒時制備了cDNA探針（complementary DNA），其基本原理是以RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）又稱為RNA指導的DNA聚合酶催化產(chǎn)生的。該酶以RNA為模板，按照RNA的核苷酸順序合成DNA，這一途徑與一般遺傳信息流的方向相反，故稱逆轉(zhuǎn)錄。cDNA是指互補于mRNA的DNA分子。,RNA探針是將特異性的cDNA片段插入含有RNA聚合酶啟動子的轉(zhuǎn)錄性載體。 這類載體包括pSP64和pSP65，它們具有不同的啟動子在多克隆位點的各側(cè)。Psp64和pSP65在sP6啟動子的多克隆位點的方向是不同的。通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的轉(zhuǎn)錄方向，即以哪條DNA鏈為模反轉(zhuǎn)錄RNA。從而可以得到與mRNA同序列的同義RNA探針（Sense probe）和與mRNA互補的反義RNA探針（antisense probe），又稱互補RNA探針（complementary RNA probe , cRNA）。 通常用同義RNA探針做為反義RNA探針的陰性對照。 由于RNA探針是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應極高。有報告認為其雜交率高于DNA探針的8倍。,DNA合成儀的誕生使制造寡核苷酸探針成為可能，與上述探針不同的是寡核苷酸探針不是克隆性DNA探針，它是由DNA合成儀依照所需雜交的靶核苷酸序列合成的。具有制造方便，價格低廉的優(yōu)點，也可進行放射性與非放射性標記，但其特異性不如克隆性探針強，亦不如其雜交信號高。,原位雜交組織化學技術(shù) 的基本步驟,大致可分為： ①雜交前準備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強核酸探針的穿透性、減低背景染色等； ②雜交； ③雜交后處理； ④顯示（visualization）：包括放射性自顯影和非放射性標記的顯色。,（一）固定 兼顧三個方面： 保持細胞結(jié)構(gòu)， 最大限度地保持細胞內(nèi)DNA或RNA的水平； 使探針易于進入細胞或組織。 DNA是比較穩(wěn)定的，mRNA卻絕然不同，非常容易被降解。因此，對于DNA的定位來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解減少到最低限度，那么，不僅固定劑的種類濃度和固定的時間十分重要，而且取材后應盡快予以冷凍或固定。在解釋ISHH的結(jié)果時應考慮到取材至進入固定劑或冰凍這段時間對RNA保存所帶來的影響，因組織中mRNA的降解是很快的。,在固定劑中，最常用的是多聚甲醛。 對于mRNA的定位，我們常采用的方法是將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中1～2h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機或振蕩切片機切片。 組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣干燥后保存在-70℃。如冰箱溫度恒定，在-70℃可保存數(shù)月之久不會影響雜交結(jié)果。 在病理學活檢取材多用福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標本對檢測DNA和mRNA有時也可獲得雜交信號，但石蠟包埋切片由于與蛋白質(zhì)交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號常低于冰凍切片。同時，在包埋的過程中可減低mRNA的含量。,（二）玻片和組織切片的處理 1．玻片的處理玻片包括蓋片和載片 應用熱肥皂刷洗，自來水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24h，清水洗凈烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在150℃或以上過夜以去除任何RNA酶。蓋玻片在有條件時最好用硅化處理，錫箔紙包裹無塵存放。 由于ISHH的實驗周期長，實驗程序繁雜，因此，要應用粘附劑預先涂抹在玻片上，干燥后待切片時應用，以保證在整個實驗過程中切片不致脫落。,常用的粘附劑有鉻礬-明膠液，其優(yōu)點是價廉易得，但在長周期實驗過程中，粘附效果不夠理想。 多聚賴氨酸液具有較好的粘附效果，但價格昂貴，需進口。 近年Vector Lab (U.S.A.)推出一種新的粘附劑叫Vectorband Reagent,每一單位包裝可制備500～700張載玻片，粘附效果極佳，價格較多聚賴氨酸便宜，制片后可長期保存應用。,2．增強組織的通透性和核酸探針的穿透性 此步驟根據(jù)應用固定劑的種類、組織的種類、切片的厚度和核酸探針的長度而定。 增強組織通透性常用的方法如應用稀釋的酸洗滌、去垢劑（detergent）或稱清洗劑Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。 這種廣泛的去蛋白作用無疑可增強組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號，但同時也會減低RNA的保存和影響組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)，因此，在用量及孵育時間上應慎為掌握。,蛋白酶K（Proteinase K）:1μg/ml(于0.1mol/l Tris/50mmol/L EDTA, pH8.0緩沖液中),37℃孵育15～20min，以達到充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態(tài)為目的。 蛋白酶K還具有消化包圍著靶DNA的蛋白質(zhì)的作用，從而提高雜交信號。 在蛋白酶K消化后，應用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以終止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制劑。為保持組織結(jié)構(gòu)，通常用4%多聚甲醛再固定。 Burns等（1987）報告應用胃蛋白酶（Pepsin）20～100μg/ml（用0.1n HCl 配）37℃、30min進行消化，所獲實驗結(jié)果優(yōu)于蛋白酶K。,多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐（acetic anhydride）和三乙醇胺（tri－ethanolamine）中以減低靜電效應，減少探針對組織的非特異性背景染色。 有的作者除在室溫下浸于上述溶液10min外，還在預熱37℃的50%甲酰胺/2SSC液中預雜交15min，然后用2SSC，0.30mol/l NaAc/0.030mol/L枸櫞酸鈉液中浸15min。 但也有報道乙酸酐和三乙醇胺液的處理并不能起到減低背景的目的，不能改善ISHH的信/噪比例。,3．減低背景染色 雜交后（Posthybridization）的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。 預雜交（Prehybridization）是減低背景染色的一種有效手段。預雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）。將組織切片浸入預雜交液中可達到封閉非特異性雜交點的目的，從而減低背景染色。,4．防止RNA酶的污染 由于在手指皮膚及實驗用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實驗結(jié)果，在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套。所有實驗用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一日置高溫（240℃）烘烤以達到消除RNA酶的目的。 要破壞RNA酶，其最低溫度必須在150℃左右。雜交前及雜交時所應用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理。,（三）雜交（Hybridisation） 雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。加蓋片的目的是防止孵育過程中的高溫（50℃左右）導致雜交液的蒸發(fā)。硅化的蓋玻片的優(yōu)點是清潔無雜質(zhì)，光滑不會產(chǎn)生氣泡和影響組織切片與雜交液的接觸，蓋玻片自身有一定重量能與有限的雜交液吸附達到覆蓋和防止蒸發(fā)的作用。為保證雜交所需的濕潤環(huán)境，放在濕盒中進行孵育。,注意事項 1．探針的濃度很難事先確定，但要掌握一個原則，即探針濃度必須給予該實驗最大的信/噪比值。 非放射性標記（生物素或地高辛）探針濃度為0.5～5.0μg/ml（即0.5～5.0ng/μl）。放射性標記的dsDNA或cRNA探針濃度在2～5ng/μl。 必須強調(diào)的是，加雜交液的量要適當，以10～20μl/每張切片為宜。雜交液過多不僅造成浪費，而且液量過多常易致蓋玻片滑動脫落，影響雜交效果，過量的雜交液含核酸探針濃度過高，反易導致高背景染色等不良后果。,2．探針的長度 一般應用于ISHH探針的最佳長度應在50～100個堿基之間。探針短易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。,3．雜交的溫度和時間 原位雜交中，多數(shù)DNA探針需要的Tm是90℃，而RNA則需要95℃。 在雜交的程序中常規(guī)的加入30%～50%甲酰胺（for－mamide）于雜交液中。反應液中每增加1%的甲酰胺濃度，Tm值可降低0.72℃。 可用調(diào)節(jié)鹽濃度的辦法來調(diào)節(jié)Tm。 由于鹽和甲酰胺濃度的調(diào)節(jié)等因素，實際采用的原位雜交的溫度在Tm-25℃左右，即比Tm減低25℃，大約在30～60℃之間 根據(jù)探針的種類不同，溫度略有差異，RNA和cRNA探針一般在37～42℃左右，而DNA探針或細胞內(nèi)靶核苷酸為DNA的，則必須在80～95℃加熱使其變性，時間5～15min，然后在冰上擱置1min，使之迅速冷卻，以防復性，再置入盛有2SSC的溫盒內(nèi)，在37～42℃孵育雜交過夜。,從理論上講，核苷酸雜交的有效反應時間在3h左右。但為穩(wěn)妥起見，一般將雜交反應時間定為16～20h。當然，雜交反應的時間與核酸探針長度與組織通透性有關(guān)。 有作者主張雜交反應的孵育應在黑暗環(huán)境中進行，因為光線會促進甲酰胺的電離作用。,4．雜交嚴格度（Hybridization stringency） 雜交條件的嚴格度（stringency）表示通過雜交及沖洗條件的選擇對完全配對及不完全配對雜交體的鑒別程度。錯配對(mismatch）雜交的穩(wěn)定性較完全配對雜交體差，因此，通過控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。 雜交的條件愈高，特異性愈強，但敏感性降低。一般來說，低嚴格度（low stringency）雜交及沖洗條件在Tm -35℃至Tm –40℃之間，高鹽或低甲酰胺濃度。在這種條件下，大約有70%～90%的同源性核苷酸序列被結(jié)合，其結(jié)果是導致非特異性雜交信號的產(chǎn)生。中嚴格度，Tm -20℃至Tm-30℃的范圍。高嚴格度（high stringency）為Tm-10℃至Tm-15℃，低鹽和高甲酰胺濃度。在這種條件下，只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成穩(wěn)定的結(jié)合。,由于原位雜交技術(shù)多數(shù)是在Tm-25℃進行的，不屬于高嚴格范圍，無疑會產(chǎn)生非特異性結(jié)合導致信/噪比減低。在這種情況下，可用加強雜交后處理洗滌的嚴格度使非特異性的雜交體減少。由于RNA雜交的穩(wěn)定性，應用cRNA探針進行細胞或組織的原位雜交時的雜交溫度比其它核酸探針要高10～15℃。實驗證明，cRNA產(chǎn)生的信號比雙鏈cDNA要強。單鏈的RNA探針其雜交信號大于雙鏈的cDNA的約8倍。,5．硫酸葡聚糖（Dextran sulphate）和甲酰胺（formamide） 硫酸葡聚糖是核酸雜交液中僅次于甲酰胺的一種組成成份。在雜交液中，甲酰胺占50%左右，而硫酸葡聚糖占10%左右。它具有極強的水合（hydrate）作用，能大大增加雜交液的粘稠度。硫酸葡聚糖的主要作用是促進雜交率，特別是對雙鏈核酸探針。這是應用硫酸葡聚糖于雜交液中的主要目的。 甲酰胺的主要作用在調(diào)節(jié)雜交反應溫度方面，從而有助于保持組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。甲酰胺還可防止在低溫時非同源性片段的結(jié)合，但甲酰胺具有破壞氫鍵的作用從而具有一種不穩(wěn)定的作用。,（四）雜交后處理（post hybridisation treatment） 雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。 通過雜交后的洗滌有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。 在雜交后漂洗中的RNA酶液洗滌能將組織切片中非堿基配對RNA除去。 洗滌的條件如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時間因核酸探針的類型和標記的種類不同而略有差異，一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高。 必須注意的是在漂洗的過程中，切勿使切片干燥。,（五）顯示（Visualization） 顯示又可稱為檢測系統(tǒng)（Detection system）。根據(jù)核酸探針標記物的種類分別進行放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進行不同顯色處理。 細胞或組織的原位雜交切片在顯示后均可進行半定量的測定，如放射自顯影可利用人工或計算機輔助的圖象分析檢測儀（computer – assisted image analysis）檢測銀粒的數(shù)量和分布的差異。非放射性核酸探針雜交的細胞或組織可利用酶檢測系統(tǒng)顯色，然后利用顯微分光光度計或圖像分析儀對不同類型和數(shù)量的核酸的顯色強度進行檢測。,（六）對照實驗和ISHH結(jié)果的判斷 和其它實驗方法一樣，并非ISHH的任何陽性信號都是特異性的，故必須同時有對照試驗以證明其特異性。對照試驗的設置須根據(jù)核酸探針和靶核苷酸的種類和現(xiàn)有的可能條件去選定，常用的對照試驗有下列幾種,ISHH對照試驗一覽表 核乳膠或非放射性檢測系統(tǒng)對照試驗 Northern 或Southern印跡雜交法 ISHH與免疫細胞化學結(jié)合 應用多種不同的核苷酸探針與同一靶核酸進行雜交 將cDNA或cRNA探針進行預雜交（吸收試驗） 與非特異性（載體）序列和不相關(guān)探針雜交（置換試驗） 將切片應用RNA酶或DNA酶進行預處理后雜交 應用同義RNA探針（Sense probe）進行雜交 以不加核酸探針雜交液進行雜交（空白試驗） 組織對照用已知確定為陽性或陰性組織進行ISHH對照 應用未標記探針做ISHH，進行對照,從理論上講，對照試驗設置愈多其靶核苷酸特異性確定愈可靠，但現(xiàn)實是不可能的。因此，在上述對照試驗中應任選設至少3～4種用以證實ISHH結(jié)果的可靠性。 比較可靠的對照試驗: Northern 和Southern印跡雜交法。 用結(jié)合的免疫組織化學和ISHH法從蛋白質(zhì)（或多肽）水平和轉(zhuǎn)錄水平在相鄰切片或同一切片中證明同一種多肽和相應mRNA共存于同一細胞中。 預先將切片用DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技術(shù)證明丟失的是DNA或RNA。 如同免疫組化的吸收試驗一樣，事先與特異性的cRNA或cDNA進行雜交。再進行ISHH，其結(jié)果應為陰性。 由于同義RNA探針和組織內(nèi)mRNA序列順序是相同的，應用其進行ISHH，結(jié)果應為陰性。 檢測系統(tǒng)的對照如乳膠或酶顯色系統(tǒng)也應在無標記探針的情況下進行。,ISHH的最大優(yōu)點是它的高度特異性，它可測定組織、培養(yǎng)的單個細胞或細胞提取物中的核苷酸含量。 應用高敏感度的放射性標記cRNA探針在理想的ISHH的實驗條件下檢測mRNA，其敏感度可達到20個mRNA拷貝/每個細胞。 由于雙鏈DNA的穩(wěn)定性，在用ISHH定位DNA時很少發(fā)生丟失，降解。在靶核苷酸序列比較伸展的情況如染色體鋪片，長于2kb的探針可以應用。因此，其敏感性高到能夠出在染色體鋪片上，有時甚至在組織切片上的單個基因拷貝。 正因為如此，對ISHH結(jié)果的解釋應持慎重態(tài)度，特別是前人未報告過的新發(fā)現(xiàn)。 因為如前所述，影響ISHH實驗結(jié)果的因素太多，比如在外科或?qū)嶒炄〔暮笪醇皶r的固定或冷凍可由于組織中mRNA的降解而導致假陰性結(jié)果。 另外，在各種類型核酸探針進入細胞、組織和各種器官的能力，又叫可接近性（acessiblity）各異。這些諸多因素都將影響ISHH的實驗結(jié)果。,1、使用地高辛標記的核酸探針進行石蠟切片的RNA原位雜交第一天 1） 二甲苯于37℃脫蠟2次，每次15分鐘； 2） 無水乙醇浸泡2次，每次3分鐘； 3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分鐘； 4） PBS清洗3分鐘； 5） 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘； 6） PBS清洗10分鐘； 7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分鐘； 8） PBS清洗2次，每次3分鐘； 9） 0.2N的HCl孵育30分鐘； 10）PBS清洗2次，每次3分鐘； 11）0.25%無水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分鐘； 12）PBS清洗2次，每次5分鐘； 13）預雜交緩沖液孵育30分鐘； 14）準備核酸探針混合物：使用預雜交緩沖液稀釋探針，85℃加熱5分鐘，置于冰塊中10分鐘；,原位雜交操作流程,15）雜交；第二天 16）將玻片置于SSC中2次，每次5分鐘以去除封片； 17）PBS清洗3分鐘； 18）RNA酶溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分鐘； 19）PBS清洗5分鐘； 20）室溫，2SSC清洗10分鐘； 21）37℃，1SSC清洗10分鐘； 22）37℃，0.5SSC清洗10分鐘； 23）緩沖液孵育10分鐘； 24）緩沖液（1%正常綿羊血清和0.03%Triton X-100）孵育30分鐘； 25）加入抗地高辛抗體，37℃孵育3 小時； 26）緩沖液清洗2次，每次10分鐘； 27）緩沖液清洗2次，每次5分鐘； 28）制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘，顯微鏡下進行觀察，如果背景尚佳，顯色時間可延長到16小時； 29）停止緩沖液的反應，用水進行簡單的清洗； 30）固紅，脫水以及封片進行核的復染。,2、使用地高辛標記的寡核苷酸探針進行石蠟切片的原位DNA雜交第一天 1） 二甲苯于37℃脫蠟2次，每次15分鐘； 2） 無水乙醇浸泡2次，每次5分鐘； 3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分鐘； 4） PBS清洗5分鐘； 5） 2%焦碳酸二乙酯室溫下浸泡10分鐘； 6） PBS清洗5分鐘； 7） 加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分鐘； 8） PBS清洗2次，每次5分鐘； 9） 0.2N的HCl孵育30分鐘； 10）PBS清洗2次，每次5分鐘； 11）0.25%無水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分鐘； 12）PBS清洗5分鐘； 13）預雜交緩沖液孵育30分鐘； 14）準備寡核苷酸探針混合物：使用預雜交緩沖液稀釋探針；,15）雜交；第二天 16）將玻片置于SSC中以去除封片； 17）室溫，2SSC清洗10分鐘； 18）37℃，1SSC清洗10分鐘； 19）37℃，0.5SSC清洗10分鐘； 20）緩沖液孵育10分鐘； 21）緩沖液孵育30分鐘； 22）加入抗地高辛抗體37℃孵育3小時； 23）緩沖液清洗2次，每次5分鐘； 24）緩沖液清洗2次，每次5分鐘； 25）制成NBT/BCIP暗處保存30-60分鐘，顯微鏡下進行觀察，如果背景尚佳，顯色時間可長到16小時； 26）停止緩沖液的反應，用水進行簡單的清洗； 27）固紅，脫水以及封片進行核的復染。,,,成年大鼠海馬、齒狀回DAT1mRNA陽性神經(jīng)元,大鼠杏仁外側(cè)核DAT1 mRNA陽性神經(jīng)元,,A 大鼠舌下神經(jīng)核(12)DAT1 mRNA 陽性神經(jīng)元 100 B 大鼠延髓中央網(wǎng)狀核DAT1 mRNA 陽性神經(jīng)元 200,FISH – Fluorescent In Situ Hybridization 熒光原位雜交,,,,探針DNA,加入熒光標記,解螺旋，雜交,FISH,例如左圖: 通過使用painting 探針（針對16號染色體)，可以確認16號染色體的一段易位到了9號染色體。,,使用Vysis AneuVysion探針組對13, 18, 21, X, Y 染色體進行雜交,普通圖像 分類色圖像,5號染色體上雜交了7種探針，這些探針在位置上分別有部分重疊。,18 條帶,7 條帶,原始圖像,DAPI圖像,實例: X / Y 著絲點探針,單個或多個全染色體（WCP) 探針,雜交到有爪蟾蜍染色體上的衛(wèi)星探針(SAT1),Multi- color ISH,TMB - chr. 1 DAB - chr. 15 NF - chr. 7,Courtesy of T. Ried, M. Macville (NIH, NHGRI),多色原位雜交,人類頻譜染色體組型分析,頻譜 FISH,多色原位雜交,實習課,實習時間： 共聚焦：1月12日2：30 共聚焦實習地點：科研樓10樓，,Thanks,