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2019-2020年高中生物《基因工程的基本操作程序》教案1 新人教版選修3 【本節(jié)重難點(diǎn)】 重點(diǎn)：基因工程基本操作程序的四個(gè)步驟 難點(diǎn)：（1）從基因文庫(kù)中獲取目的基因 （2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 【知識(shí)精講】 教材梳理 基因工程的基本操作程序主要包括四個(gè)步驟：目的基因的獲取、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定。 知識(shí)點(diǎn)一 目的基因的獲取 1.獲取目的基因是實(shí)施基因工程的第一步。目的基因的獲取方法主要有兩種：①?gòu)淖匀唤缰幸延械奈锓N中分離出來(lái) ②用人工的方法合成。 2.基因文庫(kù)——將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，成為基因文庫(kù)。 基因文庫(kù)根據(jù)其大小可分為基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù)。 受體細(xì)胞是指接受目的基因的細(xì)胞，即表達(dá)載體導(dǎo)入的細(xì)胞。 基因工程常用的受體有細(xì)菌、真菌、動(dòng)植物細(xì)胞 3.PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 原理：DNA復(fù)制 做法：已知一段目的基因的核苷酸序列→據(jù)已知序列合成引物→DNA擴(kuò)增 結(jié)果：擴(kuò)增出許多結(jié)構(gòu)相同的目的基因。 注意：學(xué)習(xí)該部分知識(shí)時(shí)，常出現(xiàn)將目的基因的來(lái)源和目的基因的提取相混淆，致使不理解課本所講，原因是課本都用了“獲取目的基因”字樣。目的基因的來(lái)源是：①?gòu)淖匀唤缰幸延械奈锓N中分離出來(lái)。 ②用人工的方法合成。目的基因的提取是指在基因工程操作時(shí)怎樣獲得目的基因。常用方法有二：①?gòu)幕蛭膸?kù)中直接獲取 ②如果需要大量的目的基因，需要對(duì)目的基因進(jìn)行PCR技術(shù)擴(kuò)增。不管是從基因文庫(kù)中獲取的目的基因，還是需要進(jìn)行擴(kuò)增的目的基因，其來(lái)源既可能是從自然界中已有的物種中分離出來(lái)，也可能是人工合成的。 知識(shí)點(diǎn)二 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心。其中心內(nèi)容是使目的基因與運(yùn)載體結(jié)合，形成重組運(yùn)載體，最后通過(guò)重組運(yùn)載體將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。 注意：在學(xué)習(xí)時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)： 1.構(gòu)建表達(dá)載體的目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可遺傳給下一代，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。 2.基因表達(dá)載體的組成：目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因 3.所選運(yùn)載體應(yīng)具備的條件：（1） 載體DNA必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點(diǎn)所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。 （2）載體DNA必需具備自我復(fù)制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。 （3）載體DNA必需帶有標(biāo)記基因，以便重組后進(jìn)行重組子的篩選。 （4）載體DNA必需是安全的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。 （5）載體DNA分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。 實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。 知識(shí)點(diǎn)三 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 （1）轉(zhuǎn)化——目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程，稱為轉(zhuǎn)化。 說(shuō)明：此處的“轉(zhuǎn)化”與肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”的含義相同。 （2）基因工程中常用的受體細(xì)胞有：大腸桿菌、枯草桿菌、土壤膿桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞 （3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法：根據(jù)受體和運(yùn)載體的類型不同，所采用的導(dǎo)入方法也不同。目前常用的方法有：①將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞——膿桿菌轉(zhuǎn)化法，還有基因槍法和花粉管通道法。②將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞——顯微注射技術(shù)③將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞——Ca＋處理細(xì)胞法 說(shuō)明：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法有很多種，同學(xué)們可以上網(wǎng)查詢更多的方法和具體過(guò)程。 知識(shí)點(diǎn)四 目的基因的監(jiān)測(cè)與鑒定 （1）檢測(cè)對(duì)象：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因 ②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA ③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì) （2）檢測(cè)方法：分子檢測(cè)法——①和②都是DNA分子雜交技術(shù)，③抗原－抗體雜交法 形態(tài)檢測(cè)法——可根據(jù)目標(biāo)性狀的有無(wú)來(lái)判斷目的基因是否表達(dá) 說(shuō)明：基因操作過(guò)程中有多個(gè)步驟需要檢測(cè)，此處只講了目的基因的檢測(cè)，還有目的基因是否被整合到了運(yùn)載體上，運(yùn)載體是否進(jìn)入了受體細(xì)胞等都需要檢測(cè)，具體過(guò)程見(jiàn)拓展點(diǎn)2。 知識(shí)點(diǎn)五 教材深化：人工合成目的基因的過(guò)程： ①目的基因轉(zhuǎn)錄成的mRNA 單鏈DNA雙鏈DNA（目的基因） ②蛋白質(zhì)中氨基酸的序列mRNA中的堿基序列DNA堿基序列目的基因目的基因 教材拓展 拓展點(diǎn)一 標(biāo)記基因和標(biāo)記基因的作用 課本上提到運(yùn)載體要有標(biāo)記基因，其作用是供重組DNA鑒定和篩選，那么怎樣利用標(biāo)記基因進(jìn)行鑒定和篩選呢？請(qǐng)同學(xué)們閱讀下面一段文字：運(yùn)載體中所攜帶的一些抗性基因（如氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因）及發(fā)光基因等，能控制一些特殊物質(zhì)的合成，利用這些特殊物質(zhì)可以篩選運(yùn)載體或重組運(yùn)載體，這些基因就叫做標(biāo)志基因。 在用限制酶切割目的基因和運(yùn)載體、表達(dá)載體構(gòu)建及將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，這一系列過(guò)程都是在人為控制條件下，在有關(guān)酶的作用下自行完成的，而不是人為條件下一個(gè)一個(gè)處理的，是很多對(duì)象同時(shí)進(jìn)行的，這樣，就會(huì)出現(xiàn)有的運(yùn)載體被限制酶切割開(kāi)，有的運(yùn)載體沒(méi)有被限制酶切割開(kāi)，沒(méi)有被限制酶切割開(kāi)的運(yùn)載體，就不可能連接上目的基因，只有被限制酶切開(kāi)的運(yùn)載體才有可能拼接上目的基因。我們就必須選擇出連接上目的基因的重組運(yùn)載體（即表達(dá)載體），然后進(jìn)行擴(kuò)增，得到大量的表達(dá)載體。然后把大量的表達(dá)載體和大量的受體細(xì)胞放在一起，在一定的人為條件下，讓其自行導(dǎo)入受體細(xì)胞，這樣，在導(dǎo)入受體細(xì)胞時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)有的受體細(xì)胞被導(dǎo)入了表達(dá)載體，有的細(xì)胞沒(méi)有導(dǎo)入表達(dá)載體，我們?cè)龠x出含有表達(dá)載體的受體細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)增，培養(yǎng)。在上述過(guò)程中要進(jìn)行兩步篩選，一是篩選含有運(yùn)載體的受體細(xì)胞，其過(guò)程是在含有相應(yīng)抗菌素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有獲得運(yùn)載體的受體細(xì)胞才能繼續(xù)生長(zhǎng)，這樣便可篩選出含有運(yùn)載體的受體細(xì)胞。二是篩選含有目的基因的受體細(xì)胞，其過(guò)程是從每個(gè)菌落取一部分再接種到含另一種抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，由于目的基因插入該標(biāo)記基因中，致使該基因不能表達(dá)，因而受體細(xì)胞不能在含該抗生素的培養(yǎng)基上生存，據(jù)此可以從該菌落剩余部分的菌體中篩選出含目的基因的受體細(xì)胞。注意：在基因操作的基本步驟中要進(jìn)行多次篩選。 拓展點(diǎn)二 從基因文庫(kù)中找到所需要的基因 從基因文庫(kù)中找到目的基因是一件比較復(fù)雜的事情，要根據(jù)目的基因已有的某些信息來(lái)進(jìn)行。下面介紹一種根據(jù)基因的部分核苷酸序列找到目的基因的方法。 第一步，通過(guò)PCR方法將目的基因已知的部分核苷酸序列擴(kuò)增出來(lái)，進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記（也可以用別的標(biāo)記方法進(jìn)行，如生物素、熒光素等），即用標(biāo)記了放射性同位素的目的DNA片段作為探針，與擴(kuò)增出來(lái)的DNA雜交。 第二步，將基因文庫(kù)中的所有菌落轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上（也可以用其他類型的膜），然后，通過(guò)處理溶解消化掉細(xì)菌中的蛋白質(zhì)，并使DNA固定在膜上。 第三步，按Southern雜交的方法進(jìn)行雜交。 第四步，在X光底片上出現(xiàn)黑斑的菌落，這表明這個(gè)菌落中含有所需要的目的基因（若選用別的標(biāo)記方法，有陽(yáng)性信號(hào)的菌落則含有所需要的目的基因）。 第五步，從該菌落中再提取目的基因。 拓展點(diǎn)三 PCR的擴(kuò)增過(guò)程 PCR擴(kuò)增是獲取目的基因的一種非常有用的方法，也是進(jìn)行分子鑒定和檢測(cè)的一種很靈敏的方法。PCR的擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程包括以下幾個(gè)主要過(guò)程。 第一步：將反應(yīng)體系（包括雙鏈模板、引物、耐高溫的DNA聚合酶、四種脫氧核糖核苷酸以及酶促反應(yīng)所需的離子等）加熱至90～95 ℃，使雙鏈DNA模板兩條鏈之間的氫鍵打開(kāi)，變成單鏈DNA，作為互補(bǔ)鏈聚合反應(yīng)的模板。 第二步：將反應(yīng)體系降溫至55～60 ℃，使兩種引物分別與模板DNA鏈3′端的互補(bǔ)序列互補(bǔ)配對(duì)，這個(gè)過(guò)程稱為復(fù)性。 第三步：將反應(yīng)體系升溫至70～75 ℃，在耐高溫的DNA聚合酶催化作用下，將與模板互補(bǔ)的單個(gè)核苷酸加到引物所提供的3-OH上，使DNA鏈延伸，產(chǎn)生一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈。 上述三步反應(yīng)完成后，一個(gè)DNA分子就變成了兩個(gè)DNA分子，隨著重復(fù)次數(shù)的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反應(yīng)過(guò)程都是在PCR擴(kuò)增儀中完成的。 【典題分類精析】 考點(diǎn)一、目的基因的獲取 例1．1993年，我國(guó)科學(xué)工作者培育成的抗棉鈴蟲(chóng)的最新轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉，其抗蟲(chóng)基因來(lái)源于 A．普通棉花的基因突變 B．棉鈴蟲(chóng)變異形成的致死基因 C．在棉鈴蟲(chóng)體內(nèi)寄生的線蟲(chóng)基因 D．蘇云金芽孢桿菌體內(nèi)的抗蟲(chóng)基因 分析：1993年，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院的科學(xué)家成功地將原核生物蘇云金芽孢桿菌中的抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入棉植株，培育成了抗棉鈴蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉。 答案：D 點(diǎn)評(píng)：目的基因主要來(lái)源是原核生物。 例2．［xx高考全國(guó)］鐮刀型細(xì)胞貧血癥的病因是血紅蛋白基因的堿基序列發(fā)生了改變。檢測(cè)這種堿基序列改變必須使用的酶是 A.解旋酶 B.DNA連接酶 C.限制性內(nèi)切酶 D.RNA聚合酶 分析：本題考查的知識(shí)點(diǎn)是DNA分子雜交原理。選項(xiàng)B、 D可以直接排除。對(duì)于選A可能理解為的：既然是檢測(cè)突變的部位,那么很自然想到用該基因的探針，進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)雜交而檢測(cè)之(相關(guān)知識(shí)見(jiàn)教材鑒定人猿親緣關(guān)系和基因工程處都有所涉及)，但是分子雜交的前提必須是單鏈DNA，于是很自然想到用解旋酶處理被檢測(cè)基因。但是，解開(kāi)DNA雙鏈結(jié)構(gòu)不一定要用解旋酶，在高溫或者用強(qiáng)堿溶液處理也可以得到單鏈DNA，而且題干上也有"必須使用的酶"的敘述，所以可以排除A選項(xiàng)。 對(duì)于C選項(xiàng)的理解：限制酶只是把原DNA切成很多片段，其中某個(gè)片段可能包含突變的目的基因，然后再用化學(xué)方法處理成單鏈，最后再和探針雜交，根據(jù)放射性(或熒光)出現(xiàn)部位而檢測(cè)出突變部位，這種技術(shù)其實(shí)就是所謂的基因診斷。 如不用限制酶把DNA切割成若干片段，通過(guò)其他方法把DNA處理成單鏈，然后與DNA探針雜交，但是，已經(jīng)變性成單鏈的DNA很有可能常溫下復(fù)性，可能回折重新形成許多雙鏈區(qū)，如果恰恰突變部位及其臨近區(qū)域和該單鏈其他區(qū)域結(jié)合成雙鏈，那么必然影響探針與相應(yīng)部位的結(jié)合，也就無(wú)法準(zhǔn)確檢測(cè)到突變部位。 答案：C 點(diǎn)評(píng)：本題易錯(cuò)選A，用探針檢測(cè)DNA，DNA必須解旋，但解旋不一定要用解旋酶，這一點(diǎn)可聯(lián)系肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，高溫使DNA解旋。 考點(diǎn)二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 例3．［xx高考江蘇］基因工程又叫基因拼接技術(shù)。 （1）在該技術(shù)中，用人工合成方法獲得目的基因的途徑之一是：以目的基因轉(zhuǎn)錄的___________為模板，__________成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成__________。 （2）基因工程中常用的受體細(xì)胞有細(xì)菌、真菌、____________。若將真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)，對(duì)該目的基因的基本要求是_________。 （3）假設(shè)以大腸桿菌質(zhì)粒作為運(yùn)載體，并以同一種限制性內(nèi)切酶切割運(yùn)載體與目的基因，將切割后的運(yùn)載體與目的基因片段混合，并加入DNA連接酶。連接產(chǎn)物至少有_________種環(huán)狀DNA分子，它們分別是_______________。 分析：本題考查的是基因工程的相關(guān)知識(shí)。熟練掌握基因工程的四個(gè)步驟是解答本題的關(guān)鍵。基因工程很容易與其他知識(shí)相聯(lián)系命制綜合題，如基因操作基本步驟中目的基因的獲取常與“中心法則”、“堿基互補(bǔ)配對(duì)原則”相結(jié)合，還可與基因的結(jié)構(gòu)、發(fā)酵工程、基因的遺傳定律相結(jié)合進(jìn)行綜合考查，是學(xué)習(xí)和重點(diǎn)之一。完全按照人的意愿，由重新組裝基因到新生物產(chǎn)生的生物科學(xué)技術(shù)，就稱為“基因工程”，或者說(shuō)是“遺傳工程”。在基因工程中，人工合成目的基因的途徑有兩條，其中之一就是以信使RNA這模板經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成目的基因；基因工程常用的受體有細(xì)菌、真菌、動(dòng)植物細(xì)胞；原核生物的基因中無(wú)內(nèi)含子，若將真核生物的基因轉(zhuǎn)入原核生物，需除去內(nèi)含子部分；在本題操作過(guò)程中，若在含有同一種限制酶切割的運(yùn)載體和目的基因混合物中，加入DNA連接酶將會(huì)形成3種環(huán)狀DNA分子，運(yùn)載體自連而成的環(huán)狀DNA分子，目的基因自連而成的環(huán)狀DNA分子，運(yùn)載體與目的基因片段相連的環(huán)狀DNA分子。 答案：(1)信使RNA(mRNA) 逆轉(zhuǎn)錄(反轉(zhuǎn)錄) 雙鏈DNA(目的基因) (2)動(dòng)植物細(xì)胞　除去內(nèi)含子　(3)3 運(yùn)載體自連的、目的基因自連的、運(yùn)載體與目的基因片段相連的環(huán)狀DNA分子 點(diǎn)評(píng)：解答該類題目的方法是熟練掌握課本知識(shí)，并對(duì)課本知識(shí)進(jìn)行深化、拔高。 考點(diǎn)三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 例4．基因工程中科學(xué)家常采用細(xì)菌、酵母菌等微生物作為受體細(xì)胞，原因是( ) A．結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便 B．繁殖速度快 C．遺傳物質(zhì)含量少、簡(jiǎn)單 D．性狀穩(wěn)定,變異少 分析：本題考查基因工程的受體細(xì)胞。目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，隨著受體細(xì)胞的繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌等微生物繁殖速度非?？臁Ｔ诤芏痰臅r(shí)間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。 答案：B 點(diǎn)評(píng)：基因工程常用的受體有細(xì)菌、真菌、動(dòng)植物細(xì)胞。解答這類題目的方法應(yīng)結(jié)合受體細(xì)胞的特點(diǎn)回答。 考點(diǎn)四、目的基因的監(jiān)測(cè)與鑒定 例5.目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過(guò)鑒定和檢測(cè)才能知道。下列屬于目的基因檢測(cè)和鑒定的是 ①檢測(cè)受體細(xì)胞是否有目的基因 ②檢測(cè)受體細(xì)胞是否有致病基因 ③檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄信使RNA ④檢測(cè)目的基因是否翻譯蛋白質(zhì) A.①②③ B.②③④ C.①③④ D.①②④ 分析：本題考查目的基因的檢測(cè)的相關(guān)知識(shí)。目的基因的檢測(cè)包括：檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因，方法是用DNA探針，使DNA探針與基因組DNA雜交。檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了信使RNA，方法是用基因探針與信使RNA雜交。最后檢測(cè)目的基因是否翻譯了蛋白質(zhì)，方法是進(jìn)行抗原－抗體雜交。 答案：C 點(diǎn)評(píng)：基因工程中需要進(jìn)行監(jiān)測(cè)的步驟較多，請(qǐng)同學(xué)們利用比較對(duì)比的方法進(jìn)行記憶和運(yùn)用。 形態(tài)檢測(cè)法——可根據(jù)目標(biāo)性狀的有無(wú)來(lái)判斷目的基因是否表達(dá) 考點(diǎn)五、人工合成目的基因的過(guò)程 例6．科學(xué)家已經(jīng)能夠通過(guò)基因工程的方法，能使番茄果肉細(xì)胞中含有人奶蛋白。以下有關(guān)該基因工程的敘述錯(cuò)誤的是（ ?。? A．采用反轉(zhuǎn)錄的方法得到的目的基因有啟動(dòng)子、終止子 B．用同種限制酶處理質(zhì)粒和含目的基因的DNA，可產(chǎn)生相同的黏性末端而形成重組DNA分子 C．番茄的葉肉細(xì)胞可作為受體細(xì)胞 D．啟動(dòng)子對(duì)于目的基因在番茄的葉肉細(xì)胞中的表達(dá)是不可缺少的 分析：本題主要考查了基因工程的有關(guān)知識(shí)。反轉(zhuǎn)錄法獲取目的基因時(shí)，由于是根據(jù)氨基酸的序列推測(cè)基因中的堿基序列，因此，合成的基因中并不含有啟動(dòng)子、終止子。在基因工程中，必須用相同的限制酶處理質(zhì)粒和目的基因的DNA，這樣可產(chǎn)生相同的黏性末端以便能而形成重組DNA分子。基因工程中，常用的受體細(xì)胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等，因此番茄的葉肉細(xì)胞可作為受體細(xì)胞。在基因表達(dá)的過(guò)程中，啟動(dòng)子對(duì)于目的基因在番茄的葉肉細(xì)胞中的表達(dá)也能起一定的作用，是不可缺少的，它位于基因的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出信使RNA，最終獲得所需的蛋白質(zhì)，因此，只有A答案錯(cuò)誤。 答案：A 點(diǎn)評(píng)：?jiǎn)?dòng)子、終止子不屬于結(jié)構(gòu)基因，不能翻譯出蛋白質(zhì)，因此，采用反轉(zhuǎn)錄的方法不能得到。但啟動(dòng)子、終止子是基因表達(dá)不可缺少的。 考點(diǎn)六、標(biāo)記基因和標(biāo)記基因的作用 例7.根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理和材料用具，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)確定細(xì)菌質(zhì)粒的抗菌素基因所控制的抗菌素的類別。 實(shí)驗(yàn)原理：作為運(yùn)載體的質(zhì)粒，需要有標(biāo)記基因，這一標(biāo)記基因是抗菌素抗性基因。有抗性基因的質(zhì)?？捎米鬟\(yùn)載體。 材料用具：青霉素、四環(huán)素各10萬(wàn)單位溶液，菌種試管，滅菌的含細(xì)菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，酒精燈，接種環(huán)，一次性注射器，無(wú)菌水，恒溫箱 方法步驟： 第一步：取3個(gè)含培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，分別編號(hào)為1、2、3號(hào)，用三支注射器分別向3個(gè)培養(yǎng)基中注入1ml無(wú)菌水，、青霉素液、四環(huán)素液，并使之均勻分布之整個(gè)培養(yǎng)基表面。 第二步： 。 第三步： 。 結(jié)果預(yù)期： 。 分析：運(yùn)載體中所攜帶的一些抗性基因（如氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因）及發(fā)光基因等，能控制一些特殊物質(zhì)的合成，利用這些特殊物質(zhì)可以篩選運(yùn)載體或重組運(yùn)載體，這些基因就叫做標(biāo)志基因。目的基因中的標(biāo)志基因最少要有2個(gè)，1個(gè)是用來(lái)檢測(cè)運(yùn)載體是否進(jìn)入了受體細(xì)胞，另一個(gè)是用來(lái)檢測(cè)目的基因是否被拼接到運(yùn)載體上；第一個(gè)標(biāo)志基因要保證其完整性，能夠進(jìn)行表達(dá)，若受體細(xì)胞表現(xiàn)出該基因所控制的性狀，說(shuō)明運(yùn)載體已進(jìn)入受體細(xì)胞；第二個(gè)標(biāo)志基因是插入目的基因的部位，由于目的基因的插入破壞了起結(jié)構(gòu)，不能表達(dá)其所控制的性狀，若受體細(xì)胞沒(méi)有表達(dá)出第二個(gè)基因所控制的性狀，說(shuō)明目的基因已進(jìn)入受體細(xì)胞。 答案：第二步：將接種環(huán)在酒精燈上灼燒，在酒精燈旁用接種環(huán)挑取等量菌種，分別培養(yǎng)在三個(gè)不同的培養(yǎng)基上，置于恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)一段時(shí)間。 第三步：將接種后的培養(yǎng)基放在37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)。 預(yù)期結(jié)果：①1號(hào)培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌正常生長(zhǎng)，2、3號(hào)內(nèi)的細(xì)菌死亡，說(shuō)明細(xì)菌無(wú)抗青霉素基因，無(wú)抗四環(huán)素基因；②1、2號(hào)培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌正常生長(zhǎng)，3號(hào)培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌死亡，說(shuō)明細(xì)菌有抗青霉素基因，無(wú)抗四環(huán)素基因；③1、3號(hào)培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌正常生長(zhǎng)，2號(hào)培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌死亡，說(shuō)明細(xì)菌質(zhì)粒無(wú)抗青霉素基因，有抗四環(huán)素基因；④1、2、3號(hào)培養(yǎng)基內(nèi)細(xì)菌都正常生長(zhǎng)，說(shuō)明細(xì)菌質(zhì)粒既有抗青霉素基因，又有抗四環(huán)素基因。 點(diǎn)評(píng)：本題較難理解，原因是對(duì)基因工程中的檢測(cè)了解不深、不全造成的。兩個(gè)基因的作用不同是導(dǎo)致做錯(cuò)該題的原因。 考點(diǎn)七、從基因文庫(kù)中找到所需要的基因 例8．有關(guān)基因工程的敘述正確的是( ) A．限制酶只在獲取目的基因時(shí)才用 B．重組質(zhì)粒的形成是在細(xì)胞內(nèi)完成的 C．質(zhì)粒都可以作為運(yùn)載體 D．蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序可以為合成目的基因提供線索 分析：在基因工程中，不僅要用限制酶切割目的基因，還要用同一種限制酶在質(zhì)粒上切割出一個(gè)切口，使目的基因與質(zhì)粒切口的黏性末端能進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，所以A錯(cuò)；重組質(zhì)粒是在細(xì)胞外進(jìn)行的，所以B錯(cuò)；并不是所有的質(zhì)粒都可作運(yùn)載體，在科學(xué)研究中，人們通常只是用大腸桿菌的質(zhì)粒(其上有抗藥基因)作運(yùn)載體，所以C錯(cuò)；在人工合成目的基因的方法中，有一種方法是根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測(cè)出相應(yīng)的mRNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測(cè)出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，最后通過(guò)化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。所以D項(xiàng)正確。 答案：D 點(diǎn)評(píng)：基因文庫(kù)中的基因的來(lái)源，有的是從自然界獲取的，有的是人工合成的。 考點(diǎn)八、PCR的擴(kuò)增過(guò)程 例9．多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。PCR過(guò)程一般經(jīng)歷下述三十多次循環(huán)：95℃下使模板DNA變性、解鏈→55℃下復(fù)性（引物與DNA模板鏈結(jié)合）→72℃下引物鏈延伸（形成新的脫氧核苷酸鏈）。下列有關(guān)PCR過(guò)程的敘述中不正確的是 A．變性過(guò)程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對(duì)之間的氫鍵，也可利用解旋酶實(shí)現(xiàn) B．復(fù)性過(guò)程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補(bǔ)配對(duì)原則完成 C．延伸過(guò)程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸 D．PCR與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比所需要酶的最適溫度較高 分析：本題考查PCR擴(kuò)增過(guò)程。解題的關(guān)鍵是要全面理解PCR擴(kuò)增過(guò)程。DNA分子被破壞是指DNA分子被解旋成兩條長(zhǎng)鏈，破壞的部位是連接兩條長(zhǎng)鏈之間的氫鍵，方法有多種，用解旋酶、高溫等都可使DNA解旋，A項(xiàng)正確。B中引物有引物兩種，分別與模板DNA鏈3′端的互補(bǔ)序列互補(bǔ)配對(duì)。C中的原料不正確，合成DNA的原料是四種脫氧核苷酸。PCR技術(shù)中DNA合成過(guò)程中的溫度在70～75 ℃，所以，D選項(xiàng)正確。 點(diǎn)評(píng)：要正確理解PCR擴(kuò)增過(guò)程，才能做好本題。易錯(cuò)點(diǎn)：①合成DNA的原料是四種脫氧核苷酸 ②使DNA解旋的方法。 【針對(duì)性練習(xí)】 1.基因工程是DNA分子水平的操作，下列有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是( ) A.限制酶只用于切割獲取目的基因 B.載體與目的基因必須用同一種限制酶處理 C.基因工程所用的工具酶是限制酶，DNA連接酶 D.帶有目的基因的載體是否進(jìn)入受體細(xì)胞需檢測(cè) 2.運(yùn)用現(xiàn)代生物技術(shù)，將蘇云金芽孢桿菌的抗蟲(chóng)基因整合到棉花細(xì)胞中，為檢測(cè)實(shí)驗(yàn)是否成功，最方便的方法是檢測(cè)棉花植株是否有( ) A.抗蟲(chóng)基因 B.抗蟲(chóng)基因產(chǎn)物 C.新的細(xì)胞核 D.相應(yīng)性狀 3.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因時(shí)的受體細(xì)胞是( ) A.受精卵 B.精細(xì)胞 C.卵細(xì)胞 D.體細(xì)胞 4.在基因工程操作中，運(yùn)載體的本質(zhì)是雙鏈DNA分子，下列功能不能由運(yùn)載體完成的是 A.目的基因的轉(zhuǎn)運(yùn) B.目的基因的擴(kuò)增 C.目的基因的表達(dá) D.目的基因的定位 5．下列關(guān)于基因工程的說(shuō)法中，正確的是 A．基因工程的設(shè)計(jì)和施工都是在細(xì)胞水平上進(jìn)行的 B．目前基因工程所有的目的基因都是從供體細(xì)胞中直接分離得到的 C．只要檢測(cè)出受體細(xì)胞中含有目的基因，那么目的基因一定能成功進(jìn)行表達(dá) D．基因工程能使科學(xué)家打破物種界限，定向改造生物性狀 6. 在基因工程中，把選出的目的基因（共1000個(gè)脫氧核苷酸對(duì)，其中腺嘌呤脫氧核苷酸460 個(gè)），放入DNA擴(kuò)增儀中擴(kuò)增4代，那么，在擴(kuò)增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個(gè)數(shù)是 A．540 個(gè) B．7560個(gè) C．8100 個(gè) D．17280 個(gè) 7．利用基因工程生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物的方法之一是將人的基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)，再飼養(yǎng)這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，從動(dòng)物乳汁或尿液中提取藥物。這一過(guò)程不涉及 （ ） A．DNA按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則自我復(fù)制 B．DNA以其一條鏈為模板合成RNA C．RNA以自身為模板自我復(fù)制 D．按照RNA密碼子的排列順序合成蛋白質(zhì) 8.1975年，科學(xué)家用基因工程的方法創(chuàng)造出了一種能分解石油的“超級(jí)細(xì)菌”，下列關(guān)于此種細(xì)菌的說(shuō)法正確的是 A．與一般細(xì)菌相比它體積特別巨大 B．它是現(xiàn)在唯一能分解石油的細(xì)菌 C．它同時(shí)能分解石油中的四種烴類 D．與一般細(xì)菌相比，它繁殖速度極快 9.下列與基因工程無(wú)關(guān)的是( ) A.培養(yǎng)利用“工程菌”生產(chǎn)胰島素 B.基因治療 C.蛋白質(zhì)工程 D.雜交育種 10.在基因工程技術(shù)中，下列方法與目的基因獲得無(wú)關(guān)的是 A.輻射誘變法 B.從基因文庫(kù)中獲取 C.反轉(zhuǎn)錄法 D.人工合成法 11．“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”是指 ( ) A．含有可利用基因的動(dòng)物 B．基因組中插入外源基因的動(dòng)物 C．本身具有抗體蛋白類的動(dòng)物 D．能表達(dá)基因信息的動(dòng)物 12．下列有關(guān)“基因探針”的敘述，不正確的是 A．基因探針的工作原理是堿基互補(bǔ)配對(duì) B．待測(cè)的DNA分子首先要解旋變?yōu)閱捂湥趴捎没蛱结槣y(cè)序 C．待測(cè)的DNA分子可以直接用基因探針測(cè)序 　 D．基因探針技術(shù)可用于疾病診斷和環(huán)境監(jiān)測(cè) 13．細(xì)菌抗藥性基因存在于 A．核區(qū)的DNA B． RNA C．質(zhì)粒 D．小的直線型DNA 14．堿基互補(bǔ)配對(duì)發(fā)生在下列哪些生理過(guò)程或生物技術(shù)中： ①種子的萌發(fā) ②病毒的增殖過(guò)程 ③細(xì)菌的二分裂過(guò)程 ④目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合 ⑤DNA探針的使用 ⑥分泌蛋白的加工和運(yùn)輸 A．①②③④⑤　　B．①②③④⑤⑥ C．②④⑤ D．②③⑤⑥ 15.研究發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞能產(chǎn)生一種酶叫端粒酶，它能修復(fù)細(xì)胞分裂時(shí)產(chǎn)生在染色體端的DNA的損傷，使損傷部位得以愈合，避免了老化趨勢(shì)，因此癌細(xì)胞能無(wú)限增值。而正常細(xì)胞沒(méi)有這種端粒酶，所以通常分裂50次左右就會(huì)由于DNA的損傷而衰老死亡。就以上材料分析，以下說(shuō)法錯(cuò)誤的是 A.正常細(xì)胞內(nèi)也應(yīng)該有控制這種端粒酶合成的基因的存在 B.端粒酶的功能類似于基因工程中DNA連接酶 C.研究端粒酶基因的作用機(jī)理有助于揭開(kāi)細(xì)胞衰老之謎 D.克隆動(dòng)物若通過(guò)基因工程獲得端粒酶基因可使其壽命達(dá)到正常甚至更長(zhǎng) 16.美國(guó)科學(xué)家在研究生長(zhǎng)在墨西哥某地的野玉米后發(fā)現(xiàn)，這種玉米含有包括蘇云金芽孢桿菌基因內(nèi)的轉(zhuǎn)基因作物的基因，由此可見(jiàn) ①轉(zhuǎn)基因作物的基因可傳播到野生植物中 ②轉(zhuǎn)基因作用可對(duì)天然植物的遺傳多樣性構(gòu)成威脅 ③為防止基因污染，應(yīng)當(dāng)禁止轉(zhuǎn)基因作物的研究 ④自然雜交過(guò)程實(shí)質(zhì)是一個(gè)長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)基因過(guò)程，兩者沒(méi)有任何區(qū)別。其中正確的說(shuō)法是 A.①②③④ B.③ C.①② D.① 17.豇豆對(duì)多種害蟲(chóng)具有抗蟲(chóng)能力，根本原因是豇豆體內(nèi)具有胰蛋白酶抑制劑基因（CpTI基因）。科學(xué)家將其轉(zhuǎn)移到水稻體內(nèi)后，卻發(fā)現(xiàn)效果不理想，主要原因是CpTI蛋白質(zhì)的積累量不足。經(jīng)過(guò)在體外對(duì)CpTI基因進(jìn)行了修飾后，CpTI蛋白質(zhì)在水稻中的積累量就得到了提高。修飾和表達(dá)過(guò)程如下圖所示： 請(qǐng)根據(jù)以上材料，回答下列問(wèn)題： ⑴CpTI基因是基因工程中的 基因，“信號(hào)肽”序列及“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)”序列的基本組成單位是 ，在①過(guò)程中，首先要用 酶切開(kāi)，暴露出 ，再用 酶連接。 ⑵在轉(zhuǎn)基因過(guò)程中，供體細(xì)胞是 ，受體細(xì)胞是 。 ⑶②過(guò)程稱為 。 ⑷檢測(cè)修飾后的CpTI基因是否表達(dá)的最好方法是 。 18．糖尿病是一種常見(jiàn)病，且發(fā)病率有逐年增加的趨勢(shì)，以致西方發(fā)達(dá)國(guó)家把它列為第三號(hào)“殺手”。 （1）目前對(duì)糖尿?、裥偷闹委煟蠖嗖捎眉に丿煼?，這種激素是 A．甲狀腺激素 B．胰島素 C．胰高血糖素 D．性激素 （2）在人體的胰腺內(nèi)，產(chǎn)生這種激素的細(xì)胞群，稱為_(kāi)_________________。 （3）這種治療用的激素過(guò)去主要從動(dòng)物（如豬、牛）中得到。自70年代遺傳工程（又稱基因工程）發(fā)展起來(lái)以后，人們開(kāi)始采用這種高新技術(shù)生產(chǎn)，其操作的基本過(guò)程如下圖所示： ①圖中的質(zhì)粒存在于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，從其分子結(jié)構(gòu)看，可確定它是一種 。根據(jù)堿基配對(duì)的規(guī)律，在連接酶的作用下，把圖中甲與乙拼接起來(lái)（即重組），若a段與d段的堿基序列分別是AATTC和CTTAA，則b段與c段分別是 。 ②細(xì)菌進(jìn)行分裂后，其中被拼接的質(zhì)粒也由一個(gè)變成二個(gè)，二個(gè)變成四個(gè)……，質(zhì)粒的這種增加方式在遺傳學(xué)上稱為 　　 。目的是基因通過(guò)活動(dòng)（即表達(dá)）后，能使細(xì)菌產(chǎn)生治療糖尿病的激素。這是因?yàn)榛蚓哂? 　　　　　　　 合成的功能。它的過(guò)程包括____________ 和 　　　 兩個(gè)階段。 19．人類牙病的一種性狀表現(xiàn)是由于牙本質(zhì)發(fā)育不良，導(dǎo)致牙釉質(zhì)易破碎，使兒童 時(shí)期牙齒就易受損傷，該病稱為乳光牙。我國(guó)科學(xué)家在研究中發(fā)現(xiàn)，控制該遺傳病的基因 是DSPP基因。該基因的第3外顯子的一段堿基序列由原來(lái)決定谷氨酰胺(一種氨基酸)密碼 子的序列變成決定終止的密碼子的序列。請(qǐng)回答： （1） 乳光牙致病基因是 形成的。 （2）已知谷氨酰胺密碼子分別是CAA和CAG，那么DSPP基因第3外顯子與上述密碼子相對(duì)應(yīng)的堿基序列是_ ；由于第3外顯子堿基序列的變化，導(dǎo)致所決定的肽鏈結(jié)構(gòu)的顯著改變是 ，因此使牙齒發(fā)育異常。 （3）科學(xué)家對(duì)乳光牙致病基因進(jìn)行檢測(cè)是用被標(biāo)記的DNA分子做探針，鑒定基因的堿基序列，這種方法遵循的原則是 ；如果科學(xué)家要對(duì)該病進(jìn)行基因治療，應(yīng)采取的方法是 。 20.酵母菌的維生素、蛋白質(zhì)含量高，可作食用、藥用等，是提取核苷酸、三磷酸腺苷等多種生化產(chǎn)品的原料，還可用于生產(chǎn)維生素、氨基酸等?？茖W(xué)家將使啤酒產(chǎn)生豐富泡沫的LTPl基因植入啤酒酵母菌中，使其產(chǎn)生LTPl蛋白，釀出泡沫豐富的啤酒，具體的操作過(guò)程如下： 請(qǐng)據(jù)圖回答問(wèn)題： （1）若圖中LTPl基因與B結(jié)合產(chǎn)生的C是_____________，通常在體外完成，此過(guò)程必需有DNA限制性核酸內(nèi)切酶和_____________酶。 （2）標(biāo)記基因的作用是 。 （3）檢測(cè)LTPl基因在啤酒酵母菌中是否表達(dá)可以通__________________________。 【課后答案點(diǎn)撥】 思考與探究（P15） 1.答：不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是： （1） 生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動(dòng)子才能比較有利于基因的表達(dá)； （2） 通過(guò)cDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒(méi)有啟動(dòng)子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無(wú)法轉(zhuǎn)錄； （3） 目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記； （4） 為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等； （5） 有時(shí)需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識(shí)存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識(shí)基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。 2.解析：農(nóng)桿菌可分為根瘤農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌，在植物基因工程中以根瘤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化最多。根瘤農(nóng)桿菌廣泛存在于雙子葉植物中。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，約有93屬643種雙子葉植物對(duì)根瘤農(nóng)桿菌敏感。裸子植物對(duì)該菌也敏感。當(dāng)這些植物被該菌侵染后會(huì)誘發(fā)腫瘤。近年來(lái)，也有報(bào)道該菌對(duì)單子葉植物也有侵染能力。 根瘤農(nóng)桿菌侵染植物是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程。根瘤農(nóng)桿菌具有趨化性，即植物的受傷組織會(huì)產(chǎn)生一些糖類和酚類物質(zhì)吸引根瘤農(nóng)桿菌向受傷組織集中。研究證明，主要酚類誘導(dǎo)物為乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，這些物質(zhì)主要在雙子葉植物細(xì)胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中，這也是單子葉植物不易被根瘤農(nóng)桿菌侵染的原因。近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)一些中性糖，如L-阿拉伯糖、D-木糖等也有誘導(dǎo)作用。酚類物質(zhì)和糖類物質(zhì)既可以作為根瘤農(nóng)桿菌的趨化物，又可以作為農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上Vir區(qū)（毒性區(qū)）基因的誘導(dǎo)物，使Vir區(qū)基因活化，導(dǎo)致T-DNA的加工和轉(zhuǎn)移，從而侵染植物細(xì)胞。 需要注意的是農(nóng)桿菌中不同的菌株，侵染能力有差別，在基因工程中需要加以選擇使用。利用農(nóng)桿菌侵染單子葉植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，是需要加上述酚類物質(zhì)的，同時(shí)單子葉植物種類不同，農(nóng)桿菌侵染進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的效果也有很大差異。 如果想將一個(gè)抗病毒基因轉(zhuǎn)入小麥，也可以用農(nóng)桿菌，但要注意兩點(diǎn)：①要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因?yàn)椴皇撬械霓r(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；②要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì)，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū)（誘導(dǎo)）的基因，使T-DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上。 3.解析：有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體存在于真核細(xì)胞中，大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器，因此，在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。 4.解析：基本操作如下： （1）從小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列（cDNA）。 （2）將cDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動(dòng)子，另外加上抗四環(huán)素的基因，構(gòu)建成一個(gè)表達(dá)載體。 （3）將表達(dá)載體導(dǎo)入無(wú)四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達(dá)載體未進(jìn)入大腸桿菌中，大腸桿菌會(huì)因不含有抗四環(huán)素基因而死掉；如果培養(yǎng)基上長(zhǎng)出大腸桿菌菌落，則表明β-珠蛋白基因已進(jìn)入其中。 （4）培養(yǎng)進(jìn)入了β-珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎后從中提取β-珠蛋白。 求異思維（P8） 解析：1970年，特明（H.M. Temin）和巴爾的摩（D. Baltimore）證實(shí)了RNA病毒中含有一種能將RNA轉(zhuǎn)錄成DNA的酶，這種酶被稱為依賴RNA的DNA聚合酶，由于與中心法則中的從DNA到RNA的轉(zhuǎn)錄是反向的，所以稱為反轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）。 反轉(zhuǎn)錄酶既可以利用DNA又可以利用RNA作為模板合成與之互補(bǔ)的DNA鏈。像其他DNA聚合酶一樣，反轉(zhuǎn)錄酶也以5′→3′方向合成DNA（圖1-3）。 cDNA合成過(guò)程是：第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。 尋根問(wèn)底 1（P9）.解析：構(gòu)建基因文庫(kù)是獲取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過(guò)PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過(guò)反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫(kù)。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個(gè)體發(fā)育的不同階段表達(dá)的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫(kù)。 2（P11）.解析：有人采用總DNA注射法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個(gè)生物中的總DNA提取出來(lái)，通過(guò)注射或花粉管通道法導(dǎo)入受體植物，沒(méi)有進(jìn)行表達(dá)載體的構(gòu)建，這種方法針對(duì)性差，完全靠運(yùn)氣，也無(wú)法確定什么基因?qū)肓耸荏w植物。此法目前爭(zhēng)議頗多，嚴(yán)格來(lái)講不算基因工程。 【拓展閱讀】 1. 基因工程載體的構(gòu)建需要考慮哪些方面的因素？道理何在？ 主要考慮以下幾方面的因素。 （1）基因的特點(diǎn)：如果一個(gè)來(lái)自動(dòng)物的目的基因含有內(nèi)含子，就不能用于轉(zhuǎn)基因植物，因?yàn)閯?dòng)物中內(nèi)含子的剪接系統(tǒng)與植物的不同，植物不能將動(dòng)物基因的內(nèi)含子剪切掉，只能用該基因的cDNA?；虻漠a(chǎn)物如果是一個(gè)糖蛋白，那么該基因在原核生物細(xì)菌中表達(dá)出來(lái)的蛋白就可能不具備天然狀態(tài)下的活性，因?yàn)樘堑鞍咨系奶擎準(zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加上的，而細(xì)菌無(wú)這些細(xì)胞器。 （2）要選擇強(qiáng)啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子。啟動(dòng)子有強(qiáng)有弱，選擇強(qiáng)啟動(dòng)子可以增加轉(zhuǎn)錄活性，使基因產(chǎn)物量增多。如果希望基因在生物的某個(gè)組織表達(dá)，如只在植物種子中表達(dá)，就要選擇種子中特異表達(dá)的啟動(dòng)子。 （3）要有選擇標(biāo)記基因，如抗生素基因，以便選擇出真正的轉(zhuǎn)基因生物。 2. 什么是分子雜交技術(shù)的顯示帶？ 分子雜交技術(shù)是基因工程中使用頻率很高的一項(xiàng)技術(shù)，主要用于檢測(cè)和鑒定，可以分為核酸分子之間的雜交和蛋白質(zhì)分子之間的雜交。常用的技術(shù)有： Southern雜交──DNA和DNA分子之間的雜交。目的基因是否整合到受體生物的染色體DNA中，這在真核生物中是目的基因可否穩(wěn)定存在和遺傳的關(guān)鍵。如何證明這一點(diǎn)，就需要通過(guò)Southern雜交技術(shù)?；咀龇ㄊ牵旱谝徊剑瑢⑹荏w生物DNA提取出來(lái)，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)拿盖泻螅攮傊悄z電泳，將不同大小的片段分開(kāi)；第二步，將凝膠上的DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；第三步，用標(biāo)記了放射性同位素（或生物素）的目的DNA片段作為探針與硝酸纖維素膜上的DNA進(jìn)行雜交；第四步，將X光底片壓在硝酸纖維素膜上，在暗處使底片感光；第五步，將X光底片沖洗，如果在底片上出現(xiàn)黑色條帶，則表明受體植物染色體DNA上有目的基因。 Northern雜交──DNA和RNA分子之間的雜交。它是檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA的方法，具體做法與Southern雜交相同，只是第一步從受體植物中提取的是mRNA而不是DNA，雜交帶的顯現(xiàn)也與Southern雜交相同。 Western雜交──蛋白質(zhì)分子（抗原—抗體）之間的雜交。它是檢測(cè)目的基因是否表達(dá)出蛋白質(zhì)的一種方法。具體做法是：第一步，將目的基因在大腸桿菌中表達(dá)出蛋白質(zhì)；第二步，將表達(dá)出的蛋白質(zhì)注射動(dòng)物進(jìn)行免疫，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并提取出抗體（一抗）；第三步，從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，走凝膠電泳；第四步，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；第五步，將抗體（一抗）與硝酸纖維素膜上的蛋白雜交，這時(shí)抗體（一抗）與目的基因表達(dá)的蛋白（抗原）會(huì)特異結(jié)合。由于這種抗原—抗體的結(jié)合顯示不出條帶，所以加入一種稱為二抗的抗體，它可以與一抗結(jié)合，二抗抗體上帶有特殊的標(biāo)記。如果目的基因表達(dá)出了蛋白質(zhì)，則結(jié)果為陽(yáng)性。 【五年高考回放】 1.［xx四川高考］基因工程技術(shù)可使大甩手桿菌合成人的蛋白質(zhì)。下列敘述不正確的是 A.常用相同的限制性內(nèi)切酶處理目的基因和質(zhì)粒 B.DNA連接酶和RNA聚合酶是構(gòu)建重組質(zhì)粒必需的工具酶 C.可用含抗生素的培養(yǎng)基檢測(cè)大腸桿菌中是否導(dǎo)入了重組質(zhì)粒 D.導(dǎo)入大腸桿菌的目的基因不一定能成功表達(dá) 答案：B 解析：在基因過(guò)程中，如果以質(zhì)粒作為載體，首先要用一定的限制酶切割質(zhì)粒，使質(zhì)粒出現(xiàn)一個(gè)切口，露出黏性末端。然后用同一切割酶切斷目的基因，使其產(chǎn)生相同的黏性末端。將切下的目的基因片段插入到質(zhì)粒的切口處，再加入適量的DNA連接酶，質(zhì)粒的黏性末端與目的基因DNA片段的黏性末端就會(huì)通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)而結(jié)合，形成一個(gè)重組DNA分子。在全部的受體細(xì)胞中，真正能夠攝入DNA分子的受體細(xì)胞是很少的，必須通過(guò)一定的手段對(duì)受體細(xì)胞中是否導(dǎo)入了目的基因進(jìn)行檢測(cè)。RNA聚合酶主要用于RNA的錄制過(guò)程，在基因工程中并非必須使用。 2．［xx 全國(guó)高考］采用基因工程技術(shù)將人凝血因子基因?qū)肷窖蚴芫眩嘤鲛D(zhuǎn)基因羊。但是，人凝血因子只存在于該轉(zhuǎn)基因羊的乳汁中。以下有關(guān)敘述，正確的是（ ） A．人體細(xì)胞中凝血因子基因編碼區(qū)的堿基對(duì)數(shù)目，等于凝血因子氨基酸數(shù)目的3倍 B．可用顯微注射技術(shù)將含有人凝血因子基因的重組DNA分子導(dǎo)入羊的受精卵 C．在該轉(zhuǎn)基因羊中，人凝血因子基因存在于乳腺細(xì)胞，而不存在于其他體細(xì)胞中 D．人凝血因子基因開(kāi)始轉(zhuǎn)錄后，DNA連接酶以DNA分子的一條鏈為模板合成mRNA 答案：B 解析：人體細(xì)胞是真核細(xì)胞,其基因中含有內(nèi)含子,其堿基對(duì)數(shù)大于氨基酸數(shù)的三倍;山羊的受精卵中導(dǎo)入人凝血因子基因,長(zhǎng)成的山羊每個(gè)體細(xì)胞中都含有這種基因;DNA連接酶是把兩條DNA鏈末端之間的縫隙"建合"起來(lái),而不是參與轉(zhuǎn)錄。基因工程外源基因的導(dǎo)入多采用人工的方法,使體外重組的DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞,在本題中可采用顯微注射法。 3．［xx上海高考］農(nóng)業(yè)科技工作者在煙草中找到了一抗病基因，現(xiàn)擬采用基因工程技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)入棉花，培育抗病棉花品系。請(qǐng)回答下列問(wèn)題。 （1）要獲得該抗病基因，可采用______________________、______________________等方法。為了能把該抗病基因轉(zhuǎn)入到棉花細(xì)胞中，常用的載體是______________________。 （2）要使載體與該抗病基因連接，首先應(yīng)使用__________________進(jìn)行切割。假如載體被切割后，得到的分子末端序列為，則能與該載體連接的抗病基因分子末端是____________ (3)切割完成后，采用_________酶將載體與該抗病基因連接，連接后得到的DNA分子稱為_(kāi)____________。 (4)再將連接得到的DNA分子導(dǎo)入農(nóng)桿菌，然后用該桿菌去__________棉花細(xì)胞，利用植物細(xì)胞具有的_______________性進(jìn)行組織培養(yǎng)，從培養(yǎng)出的植株中_________出抗病的棉花。 （5）該抗病基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)的產(chǎn)物是　　　　?。ā　。? A．淀粉　　　B．脂類　　　C．蛋白質(zhì)　　　D．核酸 （6）轉(zhuǎn)基因棉花獲得的______________________是由該表達(dá)產(chǎn)物來(lái)體現(xiàn)的。 答案：(1)從細(xì)胞中分離　化學(xué)方法人工合成　Ti質(zhì)?！?2)限制性內(nèi)切酶(限制酶) A　(3)DNA連接酶　重組DNA　(4)感染 全能 篩選(選擇)(5)C　(6)抗病性狀 解析：基因工程有四步曲，解答本題時(shí)應(yīng)緊扣這四步曲。獲得抗病基因常用的方法是從細(xì)胞中直接分離目的基因或根據(jù)mRNA堿基順序和蛋白質(zhì)的氨基酸序列人工合成目的基因；在基因工程中,常用的載體是質(zhì)?？梢韵扔孟拗菩詢?nèi)切酶把目的基因和運(yùn)載體切出相同的棋性末端；再用 DNA 連接酶將運(yùn)載體和目的基因連接起來(lái),構(gòu)成重組DNA分子；用導(dǎo)入重組DNA分子的農(nóng)桿菌感染棉花細(xì)胞,并用組織培養(yǎng)的方法把這樣的棉花細(xì)胞培育出個(gè)體,從中篩選出有抗病性狀的棉花；最后進(jìn)行鑒定,可把普通棉和抗蟲(chóng)棉在同等條件下讓害蟲(chóng)吞食, 觀察其效果 即可。 4.［xx全國(guó)高考］科學(xué)家通過(guò)基因工程的方法，能使馬鈴薯塊莖含有人奶主要蛋白。以下有關(guān)該基因工程的敘述，錯(cuò)誤的是（ ） A.采用反轉(zhuǎn)錄的方法得到的目的基因有內(nèi)含子 B.基因非編碼區(qū)對(duì)于目的基因在塊莖中的表達(dá)是不可缺少的 C.馬鈴薯的葉肉細(xì)胞可作為受體細(xì)胞 D.用同一種限制酶，分別處理質(zhì)粒和含目的基因的DNA，可產(chǎn)生黏性末端而形成重組DNA分子 答案：A 解析：制取目的基因的方法有多種，其中反轉(zhuǎn)錄法是人工合成目的基因的方法之一，它是以成熟的RNA作為模板通過(guò)反轉(zhuǎn)錄來(lái)合成目的基因，不含有基因的內(nèi)含子，因而選A。其他三個(gè)選項(xiàng)都是關(guān)于基因工程操作的正確論述。 5．[xx江蘇高考]能夠使植物體表達(dá)動(dòng)物蛋白的育種方法是（ ） A．單倍體育種 B．雜交育種 C．基因工程育種 D．多倍體育種 答案：B 解析：通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以把動(dòng)物體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移到植物體內(nèi)，可以讓植物表達(dá)動(dòng)物蛋白，這屬于基因工程育種。 6．[xx天津高考]下列技術(shù)依據(jù)DNA分子雜交原理的是（ ） ① 用DNA分子探針診斷疾病 ② B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的雜交 ③ 快速靈敏地檢測(cè)飲用水中病毒的含量 ④ 目的基因與運(yùn)載體結(jié)合形成重組DNA分子 A．②③ B．①③ C．③④ D． ①④ 答案：B 解析：該題用到生物工程方面的知識(shí)，尤其是基因工程方面，DNA探針的應(yīng)用是利用了DNA分子雜交的原理。 7.［xx全國(guó)高考］采用基因工程的方法培育抗蟲(chóng)棉，下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的是 ①將毒素蛋白注射到棉受精卵中 ②將編碼毒素蛋白的DNA序列，注射到棉的受精卵中 ③將編碼毒素蛋白的DNA序列，導(dǎo)入細(xì)菌用該細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，在進(jìn)行組織培養(yǎng) ④將編碼毒素蛋白的DNA序列，與細(xì)菌質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進(jìn)入受精卵（ ） A.①② B. ②③ C. ③④ D. ④① 答案：C 解析：在將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的過(guò)程中，需要借助于運(yùn)載體，具體操作是把目的基因與運(yùn)載體相結(jié)合，形成重組基因后才能實(shí)現(xiàn)目的基因的導(dǎo)入。因此正確的答案是③④。 8.［xx廣東、河南高考］（多選）科學(xué)家將含人的α－抗胰蛋白酶基因的DNA片段，注射到羊的受精卵中，該受精卵發(fā)育的羊能分泌含α－抗胰蛋白酶的奶。這一過(guò)程涉及 A.DNA按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則自我復(fù)制 B.DNA以其一條鏈為模板合成RNA C.RNA以自身為模板自我復(fù)制 D.按照RNA密碼子的排列順序合成蛋白質(zhì) 答案：ABD 解析：由受精卵發(fā)育成性成熟個(gè)體的過(guò)程中，DNA按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行自我復(fù)制。α－抗胰蛋白酶基因隨著受體DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，并最終表達(dá)出含α－抗胰蛋白酶的奶。而RNA以自身為模板的自我復(fù)制過(guò)程，只出現(xiàn)在極少數(shù)RNA病毒中。