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第十二章：動物細胞培養(yǎng)技術(shù),第一節(jié) 體外培養(yǎng)動物細胞的生物學特征 第二節(jié) 動物細胞體外培養(yǎng)技術(shù) 第三節(jié) 培養(yǎng)細胞常規(guī)檢查和特性鑒定 第四節(jié) 細胞同步化 第五節(jié) 器官培養(yǎng),動物細胞培養(yǎng)技術(shù),動物細胞培養(yǎng)是用無菌操作的方法將動物體內(nèi)的組織或器官取出，模擬動物體內(nèi)的生理條件，在體外進行培養(yǎng)，并觀察細胞的生長，發(fā)育及衰老等生命現(xiàn)象的技術(shù)。動物細胞培養(yǎng)有很多優(yōu)越性，但也有不足之處。 動物細胞培養(yǎng)已廣泛應用于病毒學，免疫學，遺傳學，腫瘤學，細胞生物學，毒理學和臨床醫(yī)學等各個領(lǐng)域。利用細胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)生產(chǎn)出了多種生物制品，如狂犬病疫苗，干擾素，生長調(diào)節(jié)素。,第一節(jié)體外培養(yǎng)動物細胞的生物學特征,一、體外培養(yǎng)物的細胞生物學特點 （一）生物學特征的兩重性 1、基本生物學特征與體內(nèi)細胞相似 體外培養(yǎng)的細胞不僅存在細胞和基質(zhì)的相互關(guān)系， 而且細胞和細胞之間在形態(tài)和機能上還存在著相互關(guān)系 2、差異性 細胞離體后，失去神經(jīng)和體液調(diào)節(jié)以及細胞間的相互影響，在體外培養(yǎng)條件下可能會出現(xiàn)分化現(xiàn)象減弱，形態(tài)功能單一化，生存一定時間后衰退死亡，出現(xiàn)連續(xù)生長的細胞系或惡性細胞系等。因此體外培養(yǎng)的細胞可視為一種在特定條件下的細胞群體，它們既保持著與體內(nèi)細胞相同的基本機構(gòu)和功能，也有不同于體內(nèi)細胞的性狀。,（二）培養(yǎng)細胞分化狀態(tài)的改變,1、分化 在個體發(fā)育的過程中，細胞后代的形態(tài)和功能上發(fā)生穩(wěn)定性差異過程稱為細胞分化。細胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，其原有的功能可能會迅速改變或消失，但其分化能力并未完全喪失。細胞是否分化，關(guān)鍵是在于是否存在使細胞分化的條件，把表皮細胞放在企業(yè)界面上培養(yǎng)，可分化成含大量角蛋白絲的膠質(zhì)細胞，但這種能力會隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸喪失。 2、去分化 去分化也叫脫分化是指各種分化細胞，逐漸失去各自的形態(tài)與功能個性，表現(xiàn)出某種趨同性的過程。,二、體外培養(yǎng)細胞的形態(tài),當細胞初一較好的培養(yǎng)條件時，形態(tài)上有相對的一致性。在一定程度上能反映細胞的起源以及正常和異常的區(qū)別，故可作為細胞形態(tài)學的一個指標或依據(jù)。但它可受很多因素的影響而發(fā)生改變。 （一）貼附型細胞和懸浮型細胞 1、貼附型細胞（見下圖） 1） 成纖維細胞型 2 ）上皮細胞型 3 ）游走細胞型 4 ）多形細胞型 2、懸浮性細胞,懸浮性細胞,,（二）細胞帖壁過程,對于貼壁型細胞，在液體環(huán)境中生長時，基本呈圓形，當附于支持物表面后，開始仍為圓形，但很快會發(fā)生形態(tài)上的改變，轉(zhuǎn)變?yōu)閳A餅形即放射延展細胞。在1/2至2小時后，過渡為極性細胞，可呈紡錘形，三角形或不規(guī)則多角形等各種形態(tài)。 支持物能影響貼附，底物表面不潔不利于貼附，底物表面帶有陽性電荷利于貼附，一些特殊物質(zhì)如LETS，細胞表面蛋白等也參與貼附過程。,（三）接觸抑制和密度抑制,細胞在體外培養(yǎng)過程中，細胞數(shù)量不斷增多，生長空間漸趨減少，最后細胞相互接觸匯合成片。細胞相互接觸后，如果培養(yǎng)的是正常細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制 當細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導致細胞分裂停止。,三、培養(yǎng)細胞的增殖能力,體內(nèi)細胞生長處于動態(tài)平衡環(huán)境中，而體外培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿或其他容器。生存空間和營養(yǎng)是有限的。當增殖到一定密度時，則需分離出一部分細胞并跟新營養(yǎng)液，否則將會影響細胞的繼續(xù)生存，這一過程稱傳代 （一）培養(yǎng)細胞生命期、 培養(yǎng)細胞生命期是指細胞在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)增殖和生長的時間。正常細胞在體外培養(yǎng)時，不論細胞的種類和供體的年齡如何，在細胞生存全過程中，基本經(jīng)歷以下三個階段。,,1、原代培養(yǎng)基 原代培養(yǎng)基也稱初代培養(yǎng)基，即從動物機體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)一到四周。此期的細胞移動活躍，可見細胞活躍，可見細胞分裂，但不旺盛。原代培養(yǎng)的細胞于體內(nèi)相應的細胞性狀相似，更能代表其來源組織的細胞類型及組織特異性。 2、傳代期 初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便改稱為細胞系。此期最長，細胞增殖旺盛，能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細胞稱二倍體細胞系。為保持二倍體細胞性質(zhì)應在初代培養(yǎng)期或傳代后早期冷凍。如不冷凍則要反復傳代。一般，傳代十至五十次左右，細胞增殖逐漸減慢，甚至停止，進入衰退期。 3、衰退期 衰退期的細胞雖然能存活，但增殖很慢并逐漸停止，進而發(fā)生衰退死亡,,傳代細胞由于目中因素的影響，可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化，其標志是細胞獲得永生性或惡性性。細胞永生性也稱不死性，即細胞獲得永久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。轉(zhuǎn)化細胞除了比正常細胞能分裂更多的代數(shù)之外，還具有不受細胞密度的影響，不具有接觸抑制現(xiàn)象和細胞形狀不規(guī)則，出現(xiàn)異常染色體的特性。轉(zhuǎn)化后的細胞也可能具有惡性性質(zhì)。 （二）培養(yǎng)細胞“一代”生存期 體外培養(yǎng)的細胞當生長達到一定密度后，都需要做傳代處理。 所謂細胞“一代”是指從細胞接種到分離在培養(yǎng)時的一段時間。它與細胞世代和倍增不同，在細胞一代中，細胞能倍增三至六次。每一代的細胞群體都會經(jīng)歷以下四個階段：1、潛伏期 2、對數(shù)生長期 3、穩(wěn)定期 4、衰亡期,,1、潛伏期：細胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中懸浮狀態(tài)的懸浮期，此時細胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細胞附著或貼附于第五表面上的過程，稱為貼壁，懸浮期結(jié)束。 細胞貼附于支持物后，要經(jīng)過一個潛伏階段，才進入生長和增殖期。細胞處于潛伏期可有運動行為，基本無增殖，少見分裂相。細胞潛伏期和細胞密度、細胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代細胞培養(yǎng)細胞潛伏期長，24至96h或更長，連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅6～24h；細胞接種密度大時潛伏期短。 2、對數(shù)生長期：當細胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時，標志細胞已進入對數(shù)生長期。這是細胞增長最旺盛的階段。對數(shù)生長期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長旺盛與否的一個重要標志。一般以細胞分裂指數(shù)MI表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)。 MI=（分裂相個數(shù)/1000個細胞）×100% 3、穩(wěn)定期 細胞數(shù)量達飽和密度后，細胞逐漸停止增殖，進入停滯期。此時細胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)逐漸耗盡，代謝產(chǎn)物積累，ph降低。此時需做分離培養(yǎng)培養(yǎng)即傳代，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，甚至從底物脫落死亡，故傳代應越早越好。 4、衰亡期 一個達到穩(wěn)定生長期的細胞群體，由于生長環(huán)境的繼續(xù)惡化和營養(yǎng)物質(zhì)的短缺，群體中細胞死亡率則逐漸上升，以致細胞死亡數(shù)逐漸超過新生細胞數(shù)，群體中活細胞數(shù)下降。,,,,（二）原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng),1、原代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)即第一次培養(yǎng)，是指將培養(yǎng)物放置在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。由于原代細胞離體時間短，其原有的生物學特征仍然保持。一般在原代培養(yǎng)時期合適于作藥物測試，細胞分化等方面的研究。 （1）組織塊培養(yǎng)法 1）薄層培養(yǎng)法 2）翻轉(zhuǎn)干涸法,,1、取材修剪沖洗 2、剪切成1mm^3 小塊 3、移入培養(yǎng)瓶 4、分布組織小塊間距5mm 5翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶并加培養(yǎng)液37*c靜止1~2h 6、翻正培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng) 7、原代細胞培養(yǎng),（2）分散細胞培養(yǎng)法,1）機械分散法 采用一些纖維成分很少的組織進行培養(yǎng)時，可以直接用分散法進行分散。可將組織直接用剪刀剪切，用吸管吸打，這種對組織損傷較大，一般可用注射器針心擠壓通過不銹鋼網(wǎng)的方法。 2）消化分散法 使用生物化學的方法將剪碎的組織塊分散成細胞團或單細胞的方法。消化培養(yǎng)法可以將細胞間質(zhì)包括基質(zhì)、纖維等去除，是的細胞分散，形成懸液，適用于大量組織的分離。常用的消化液有胰蛋白酶，膠原酶。另外，鏈酶蛋白酶，黏蛋白酶，蝸牛酶等也可以用于細胞的分化。 膠原酶是從細菌中提取的酶，對膠原和細胞間質(zhì)有較強的消化作用，適用于分離纖維性組織，上皮組織和癌組織，Ga Mg 和血清成分不會影響膠原酶的消化作用，作用溫和，無須機械振動。其常用量為200iu/ml,胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。,,2、傳代培養(yǎng),當細胞持續(xù)生長增殖一段時間到達一定的細胞密度后，就應當將細胞分離到新的培養(yǎng)器皿并補充新的培養(yǎng)培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，即為細胞的傳代培養(yǎng)。在首次培養(yǎng)應注意以下幾點：1細胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不要急于傳代，2原代培養(yǎng)時細胞多為混雜生長，上皮樣細胞和成纖維樣細胞并存的情況很多見，傳代時不同的細胞有不同的傳代時間，因而要根據(jù)需要注意觀察并及時進行處理，3首次傳代時細胞接種數(shù)量要多些，使細胞盡快適應新的環(huán)境而李宇細胞生存和增殖。 貼壁細胞的傳代大都采用酶消化法來進行。部分貼壁生長的細胞可用直接吹打或離心分離后傳代。懸浮細胞可直接傳代。,（1）貼壁細胞的消化法傳代 （2）懸浮細胞的傳代,,,（三）細胞純化,1、自然純化 自然純化是利用某一細胞的增殖優(yōu)勢，而排擠其他細胞生長，最后留下生長優(yōu)勢細胞，去除其他細胞，達到細胞純化的目的。 2、人工純化 （1）酶消化法： 1）先用0，5%胰蛋白酶和0，02%EDTA（1：1）混合液漂洗培養(yǎng)細胞，然后再換新的混合液繼續(xù)消化，之后在導致的顯微鏡下觀察并不時搖動培養(yǎng)瓶，等到半數(shù)細胞脫落下來后，便立即停止消化。 2）吧消化液吸入離心管中，離心去上清，然后移入另一培養(yǎng)瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)，再向原瓶中也不加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)過幾次反復處理，可把成纖維細胞除凈。 （2）機械刮除法 1)標記 鏡下觀察，在培養(yǎng)皿背面圈下上皮細胞生長部位 2)刮除 棄培養(yǎng)基，把無菌刀深入瓶中，肉眼或顯微鏡下刮除無標記空間 3)沖洗 用hank‘s液沖洗1或2次，洗出被掛掉的細胞 4）培養(yǎng) 然后注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細胞存留，可重刮除 （3）反復貼壁法 操作方法與貼壁細胞傳代基本相同 （4）克隆法 （5）流式細胞儀技術(shù) （6）其他純化方法,（四）細胞的凍存復蘇及運輸,1、細胞冷凍保存 （1）細胞超低溫保存的原理 細胞在-70*c以下時，細胞內(nèi)的酶活性降低，代謝處于完全停止狀態(tài)，故可以長期保存。細胞低溫保存的關(guān)鍵在于通過-20~0*c階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi)，易造成細胞的嚴重損傷。如果不加保護直接冷凍，細胞內(nèi)水分結(jié)晶，導致胞內(nèi)電解質(zhì)濃度增高，ph改變，部分蛋白質(zhì)變性，溶酶體膜受損而導致溶解酶釋放破壞細胞結(jié)構(gòu)，從而造成細胞死亡。因此，為了減少細胞內(nèi)的冰晶形成，一般在培養(yǎng)液中加入保護劑以減少冰晶形成和細胞死亡。 根據(jù)冷凍保護劑是否透過細胞膜可將其分為：1滲透性保護劑2非滲透性保護劑 最常用的保護劑為dmso本身對細菌有毒性作用，可自身滅菌。 （2）細胞冷凍過程 將對數(shù)期細胞以等體積20%DMSO培養(yǎng)液重懸，并分裝于冷凍管或安培平中，封口，然后降溫至4*c30min，冰盒10min，液氮罐氣相2h，最后投入液氮中保存。 2、凍存細胞的復蘇 （1）離心法 1）取出冷凍管，迅速投入37~40*c水浴中，振蕩，使之融化。 2）吸入到10ml的培養(yǎng)液中，混懸，離心洗滌1或2次 3）取上清加培養(yǎng)液，調(diào)濃度為1*10^5~2*10^5個/ml （2）直接鋪板法 取貯存細胞，37*c水浴中快速融化，移入完全生長培養(yǎng)集中，進行活細胞計數(shù)，密度3*10^5個/ml 培養(yǎng)12~24小時，更換新鮮的完全生長培養(yǎng)基，以去除冷凍劑。,3.細胞運輸 1冷凍儲存運輸2充液法 1）選生長良好的細胞，待接近或剛連接成片時去掉培養(yǎng)液，充新培養(yǎng)液，液量達到瓶頸部，擰緊螺帽，保留微量空氣； 2）妥善包轉(zhuǎn)運送，瓶口用膠帶密封，并用棉花等做防震防壓處理。 3）到目的地后，倒出大部分培養(yǎng)液，僅保留維持細胞生長所需液量，置于37*c培養(yǎng)，次日傳代,,,二、動物細胞培養(yǎng)的基本方法,（一）懸滴培養(yǎng)法 （二）培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法 （三）培養(yǎng)板培養(yǎng)法 （四）旋轉(zhuǎn)管 培養(yǎng)法 （五）灌注小室培養(yǎng)法 （六）克隆培養(yǎng)法,,,六、單細胞分離培養(yǎng)技術(shù)主要分為三種，即多孔塑料板克隆細胞法、瓊脂培養(yǎng)法和飼養(yǎng)細胞層克隆法,1、多孔塑料板克隆細胞法 首先將細胞懸液混合均勻，在每孔內(nèi)加入，0，1ml的細胞懸液。加完后迅速蓋好蓋板，鏡檢，記錄含有單個細胞的孔。觀察時要特別注意孔底邊緣，凡不能確認者不要計算在內(nèi)，用筆標記。然后于co2培養(yǎng)箱進行原代和傳代培養(yǎng)。等到培養(yǎng)板孔內(nèi)細胞增至500~600個時，可以進行分離培養(yǎng)。 2、瓊脂培養(yǎng) 當瓊脂凝固時，可以把細胞接種在瓊脂表面，生長成克隆后，容易分離，適于做單細胞克隆。此外，也可以用營養(yǎng)液配成軟瓊脂，在溶解狀態(tài)下把細胞與之混合起來，細胞在松軟的瓊脂中攝取營養(yǎng)和生長，軟瓊脂培養(yǎng)是測定克隆形成率及測試轉(zhuǎn)化細胞形狀的重要手段。 3、飼養(yǎng)細胞層克隆法 此法是將飼養(yǎng)細胞接種在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)兩天后，即可接種準備克隆的細胞。飼養(yǎng)細胞也稱為滋養(yǎng)細胞，是一層經(jīng)過特殊處理的用做克隆底物的細胞層,,,,三、動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是指在人工條件下，在細胞生物反應器中高密度大量培養(yǎng)動物細胞的方法。 （一）動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)方法 動物細胞與微生物細胞相比有顯著差別：1）動物細胞比微生物細胞大的多，無細胞壁，耐機械強度低，對剪切力敏感，適應環(huán)境能力差2）倍增時間長，生長緩慢，易受微生物感染，培養(yǎng)時需要抗生素3）培養(yǎng)過程需氧量少4）培養(yǎng)過程中細胞相互粘連以集群形式存在5）原代培養(yǎng)細胞一般繁殖50代即退化死亡 6）代謝產(chǎn)物具有生物活性， 生產(chǎn)成本高，但附加值也高 1、轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng) 2、反應器貼壁培養(yǎng) 3、懸浮培養(yǎng) 4、固定化培養(yǎng) 是將動物細胞與非水溶性載體結(jié)合起來，在生物反應器中進行大規(guī)模培養(yǎng)的方法。,,固定化培養(yǎng) （1）微載體系統(tǒng) 1)微載體法 2）多空載體或大孔微載體法 其優(yōu)點：1比表面積大，是實心微載體的幾 倍甚至幾十倍2細胞在孔內(nèi)生長，受到保護， 剪切損傷少3細胞三維生長，細胞密度是實 心微載體的十倍以上，有的可達10^8個/ml 4適用于長期維持培養(yǎng)5實心載體在培養(yǎng) 液中濃度怎大到一定時，細胞密度反而下降， 大孔微載體在濃度較高時，表面碰撞增加， 能促使細胞在孔內(nèi)生長6最適合與蛋白質(zhì)生產(chǎn)， 因此有人預言，大孔微載體技術(shù)將成為動物細 胞大規(guī)模培養(yǎng)的一種常用方式。 （2）中空纖維培養(yǎng)技術(shù) (3)微囊培養(yǎng)系統(tǒng),,（二）動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應器種類,1、攪拌式生物反應器 1）供養(yǎng)方式 一般情況下，攪拌式反應器常伴有鼓泡，為細胞生長提供所需養(yǎng)分。因動物細胞對鼓泡敏感，所以對供養(yǎng)方式進行改進，生產(chǎn)了籠式供養(yǎng)方式的動物細胞反應器。特點是既能保證混合效果又有竟可能小的剪切力，以滿足細胞生長的要求。 2）攪拌器 改進中，再攪拌器較薄而面積較大，或攪拌角較大而攪拌速度較低的情況下，可顯著降低剪切力。 2、氣升式生物反應器 其是以氣體為動力，靠導流裝置引導，形成氣液混合式的總體有序循環(huán)。 3、填充床反應器 填充床反應器中，細胞可以位于支持物表面，也可以包埋于支持物之中，培養(yǎng)物流經(jīng)支持物顆粒。細胞被固定于支持物之中時，填充床反應器每單位體積能容納大量細胞。但是，填充床式固定化細胞反應器存在許多缺點。由于其混合效果低，對必要的氧傳遞,ph,溫度控制和氣體產(chǎn)物的排除造成了困難。 4、流化床反應器 其是通過流體的上升運動使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)即流化狀態(tài)進行反應的裝置。有魚固體顆粒和流體充分地進行混合，因而流化床反應器具有傳熱傳質(zhì)性能好，可使用較小顆粒催化劑，床層壓力小等特點。但同時也帶來固體催化劑磨損較大的不足。,（三）大規(guī)模培養(yǎng)操作方式,可分為分批式，流加式，半連續(xù)式，連續(xù)式和灌流式。其中，分批式，半連續(xù)式，連續(xù)式和植物細胞培養(yǎng)基本相同。 1、分批式培養(yǎng) 分批式培養(yǎng)是將細胞和培養(yǎng)基一次性裝入反應器內(nèi)進行培養(yǎng)。反應器系統(tǒng)屬于封閉式，培養(yǎng)過程中和外界沒有物料交換。其體積不變，到細胞增長和產(chǎn)物形成積累到一定時間，一次性收獲細胞和產(chǎn)物。周期一般在三到五天，收獲產(chǎn)物一般是在細胞快要死亡或已經(jīng)死亡后進行。 2、流加式培養(yǎng) 是指先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應器，在適宜環(huán)境下接種細胞，進行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，根據(jù)細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和需求，流加濃縮的營養(yǎng)物或培養(yǎng)基，流加速度和消耗的速率相同按底物濃度控制相應的流加過程，從而使細胞持續(xù)生長至較高的濃度，目標產(chǎn)物達到較高的水平。通常流加多在指數(shù)生長后期，細胞在進入衰退期之前，添加高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)。在細胞衰亡后終止整個體系，進行分離細胞和細胞碎片，濃縮，純化產(chǎn)物。其特點是能調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境中營養(yǎng)物的濃度。一，可以避免因某種營養(yǎng)成分初始濃度太高而產(chǎn)生抑制現(xiàn)象。二，能防止某些限制性成分在培養(yǎng)過程中被耗盡而影響而影響細胞的生長和產(chǎn)物的生成，這是流加式操作和分批式操作的明顯不同。此外，由于新鮮營養(yǎng)液的加入，整個過程中反應體積變化，這也是其重要特征。,,3、半連續(xù)式培養(yǎng)、 其特點是培養(yǎng)過程中培養(yǎng)物的體積逐漸增加，反應器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變；細胞可持續(xù)指數(shù)生長，并可保持產(chǎn)物和細胞在一較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)到很長時間；可進行多次回收。 4、連續(xù)式培養(yǎng) 是一種常見的懸浮培養(yǎng)模式，采用機械攪拌式生物反應器系統(tǒng)。該模式事將細胞接種于一定體積的培養(yǎng)基后，為了防止衰退期的出現(xiàn)，在細胞達到最大密度之前，以一定速度向生物反應器連續(xù)田間新鮮培養(yǎng)基。同時，含有細胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定。理論上講，該過程可以無限連續(xù)下去。其優(yōu)點是反應器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達到恒定，細胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長。細胞濃度以及細胞的生長速率可維持不變。 5、灌流式培養(yǎng) 是把細胞和培養(yǎng)基一起加入反應器后，在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷將部分條件培養(yǎng)基取出，同時又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。它與半連續(xù)式培養(yǎng)的不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時，絕大部分細胞均保留在反應器內(nèi)，而半連續(xù)培養(yǎng)在取培養(yǎng)物的同時也取出了部分細胞。灌流式培養(yǎng)的優(yōu)點：細胞截流系統(tǒng)可使細胞保留在反應器內(nèi)，維持較高的細胞密度，一般可達10^7~10^9個/mL，從而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量。連續(xù)灌流系統(tǒng)，使細胞穩(wěn)定的處在較好的營養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低；反應速率容易控制，培養(yǎng)周期較長，可提高生產(chǎn)率，目標產(chǎn)品回收率高；產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間短，可及時回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。這種方法最大困難是污染概率較高，且存在長期培養(yǎng)中保持細胞分泌產(chǎn)品的穩(wěn)定性以及規(guī)模放大過程中的工程問題。,（四）動物細胞工程表達產(chǎn)品應用,20世紀60年代初，英國AVRI研究所在貼壁細胞系BHK21中將口蹄疫病毒培養(yǎng)成功后，動物培養(yǎng)技術(shù)在規(guī)模和可靠性方面都不斷發(fā)展，生產(chǎn)各種蛋白質(zhì)藥物和疫苗越來越受人們的重視并在疾病防御方面也得到了應用。 1、疫苗 是用大規(guī)模細胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)的主要產(chǎn)品之一。美國公司應用SV40作為載體，將乙型肝炎表面抗原基因插入哺乳動物細胞內(nèi)，已獲得高效表達，并制成乙型肝炎疫苗。目前，已實現(xiàn)商業(yè)化產(chǎn)品有：口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰疹病毒疫苗和巨細胞病毒疫苗等。這些疫苗已被大規(guī)模應用。 2、單克隆抗體 應用大規(guī)模細胞培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)各種不同的單克隆抗體是經(jīng)濟可靠地方法。英國的Celltech公司采用100L和1000L自動氣升式培養(yǎng)系統(tǒng)，培養(yǎng)各種生產(chǎn)單克隆抗體的小鼠、大鼠和人的細胞株，生產(chǎn)各種單克隆抗體的產(chǎn)品，已應用于疾病診斷、治療和免疫學研究。,,3、基因重組產(chǎn)品 動物細胞能精確地轉(zhuǎn)譯和加工較大或更復雜的蛋白質(zhì)。此外動物細胞還可以把人們所需的蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)液內(nèi)，而從培養(yǎng)液分離蛋白質(zhì)要比細胞勻漿更容易。因此，利用動物細胞培養(yǎng)方式可大量生產(chǎn)基因重組產(chǎn)品。如美國的En -dotronic公司用Acusyst-P型中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)出了免疫球蛋白G、A和M，尿激酶，人生長激素，乙型肝炎表面抗原等產(chǎn)品。 目前，國內(nèi)外采用動物細胞生產(chǎn)的藥物主要有重組人粒細胞集落刺激因子、a-2a干擾素、a-2b干擾素、y-干擾素、人白細胞介素-2、重組人紅細胞生成素、表皮生長因子和重組牛堿性成纖維細胞生長因子等。,第三節(jié)培養(yǎng)細胞常規(guī)檢查和特性鑒定,一、培養(yǎng)細胞的生物學鑒定和細胞系（株）的建立 由于體內(nèi)和體外環(huán)境不同，培養(yǎng)細胞的生物學特性與體內(nèi)細胞有所不同。在培養(yǎng)細胞期間，要對細胞進行常規(guī)性檢測，包括細胞形態(tài)、細胞生長狀況、營養(yǎng)液和微生物污染等方面。一旦細胞生長成形態(tài)上單一的細胞群或細系后，還要做一系列的細胞生物學方面的檢測。 （一）、細胞形態(tài)觀察 細胞形態(tài)的觀察內(nèi)容主要包括細胞的形態(tài)、核質(zhì)比例、染色質(zhì)、核仁大小和多少以及微絲微管的排列狀態(tài)等。一般生長狀態(tài)良好的細胞，在相差顯微鏡下觀察，輪廓清晰，如細胞生長條件改變或細胞功能不良時，胞質(zhì)中常出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物，細胞之間空隙加大，細胞形態(tài)可以變得不規(guī)則，如上皮細胞變成纖維類細胞。 （二）、細胞生長情況 1、細胞生長曲線的測定 細胞生長曲線是觀察細胞生長規(guī)律的重要方法。因而，在細胞的生長特性觀察中，生長曲線的測定是最為基本的指標。標準的細胞生長曲線近似“S”形。一般在傳代后第一天細胞數(shù)有所減少，在經(jīng)過幾天的潛伏適應期，進入對數(shù)生長期，達到平臺期后生長穩(wěn)定，最后衰老。 在生長曲線上細胞數(shù)量增加一倍的時間，稱為細胞倍增時間，可以從曲線上換算出。細胞倍增的時間區(qū)間即細胞對數(shù)生長期。細胞傳代、實驗等都應在此區(qū)間進行。細胞群體倍增時間的計算方法有兩種，一為通過作圖方法在細胞生長曲線的對數(shù)生長期找出細胞增長一倍所需的時間，即倍增時間；二為通過公式按細胞倍增時間計算細胞群體倍增時間。常用細胞生長曲線的測定方法有：,,（1）細胞計數(shù)法 1） 將細胞利用一般傳代方法進行消化，制成細胞懸液。經(jīng)計數(shù)后，精確地將細胞分別接種于21~30個大小一致的培養(yǎng)瓶中。每瓶細胞總數(shù)要求一致，加入培養(yǎng)液的量也要一致。細胞接種數(shù)不能過多，也不能太少，太少細胞適應期太長；數(shù)量太多細胞將很快進入增殖穩(wěn)定期，需要在短期內(nèi)進行傳代，生長曲線不能確切反應細胞生長情況。一般接種數(shù)量以7~10天能長滿而不發(fā)生生長抑制為度。同種細胞的生長曲線先后測定要采用同一接種密度，這樣才能做縱向比較。不同細胞也要接種細胞數(shù)相同，才能進行比較。 2)每天或隔天取出3瓶細胞進行計數(shù)，計算均值。一般每隔24h取1瓶，連續(xù)觀察一至二周或到細胞總數(shù)有 明顯減少為止。培養(yǎng)三到五天后常要給未計數(shù)的細胞換液。 3）以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數(shù)為縱軸，連接成曲線后即成該細胞的生長曲線。 （2）四唑鹽比色實驗 四唑鹽是一種能接受氫原子的燃料，簡稱MTT?；驹硎腔罴毎€粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結(jié)晶物并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反應其細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)量范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量和細胞數(shù)成正比。它的特點是靈敏度高，重復性好，操作簡便，無放射性污染。 （3）CCK-8試劑盒檢測法 其基本原理是，該試劑中含有WST-8，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲贊產(chǎn)物。生成的數(shù)量和活細胞的數(shù)量成正比，細胞增殖越多，則顏色越深。 CCK-8與MTT的不同之處在于CCK-8法生成的formazan是水溶性的，不需要再吸出培養(yǎng)液加入有機溶劑溶解這一步，因此可以減少誤差。優(yōu)點是重復性和靈敏度優(yōu)于MTT，對細胞毒性小。,2、細胞分裂指數(shù),分裂指數(shù)是指細胞群體中分裂細胞所占的百分比，即細胞群的分裂相數(shù)/1000個細胞。獲得細胞相數(shù)值后，可以繪制成細胞分裂指數(shù)曲線。一般細胞分裂指數(shù)曲線與生長曲線趨勢一致，但細胞增長進入停滯期后，細胞數(shù)值增大，而分裂相完全消失。,3、細胞接種存活率 細胞接種存活率=（貼壁存活細胞數(shù)/接種細胞數(shù)）x100% 4、細胞周期 （1）放射性核素標記自顯影法 在細胞進入增殖期后，可以用川標記的胸腺嘧啶核苷處理30min后，每隔30min取材，直到48h為止。觀察和計算細胞分裂相出現(xiàn)的時間、高峰和消失分裂相數(shù)，繪制成圖進行分析。 （2）流式細胞儀測定法 選擇對數(shù)生長期細胞，用消化法制成細胞懸液，使細胞成為單個細胞，不能成團。然后根據(jù)流式細胞儀的檢測步驟進行操作。最后通過計算機分析結(jié)果計算出細胞周期。,,,5、細胞活力的檢測 細胞損傷或死亡時，某些燃料可穿透變性的細胞膜，與解體的DNA結(jié)合而著色。而活細胞能阻止這類染料進入細胞內(nèi)。借此可以鑒別死細胞與活細胞。 1）臺盼藍排斥實驗 死細胞被染成淡藍色，而活細胞據(jù)染，從而達到區(qū)別培養(yǎng)細胞活力的目的。 2）伊紅Y排斥實驗 本法與臺盼藍排斥實驗類似，但用伊紅Y染色后，活細胞與死細胞的對比度不如臺盼藍排斥實驗。 3）苯胺黑排斥實驗 死細胞被染成黑色，活細胞不被染色。,,（三）培養(yǎng)細胞種屬鑒定的方法 1、熒光抗體染色鑒別細胞的種屬 利用間接熒光抗體染色技術(shù)對細胞系的種系進行鑒定。步驟是用兔身上產(chǎn)生的特異性抗血清標記待檢測陽性對照細胞和陰性對照細胞，然后加標記有熒光染料異硫氰酸熒光素的山羊抗兔免疫球蛋白抗體，加上的熒光抗體將結(jié)合到已標記有兔抗體的靶細胞上，借助熒光即可看到抗原-抗體復合物。 2同工酶譜系鑒別細胞種屬 通過確定6-磷酸葡萄糖脫氫酸，乳酸脫氫酶和核苷酸酸化酶的淀粉膠電泳的遷移率，鑒定細胞系的種屬。該法有高度的可靠性，G6PD、LDH、NP的電泳遷移率差異不僅可用來鑒別細胞系種屬，還可查出種內(nèi)細胞的交叉污染。根據(jù)同種異體同工酶的表型和正常人群體的表型頻率資料，可以估計出一特定細胞系遺傳特征出現(xiàn)的頻率。 3、染色體分析 用顯微鏡觀察細胞核型特點，進行染色體核型分析。包括檢測染色體數(shù)量，標記染色體的有無，帶型等。親緣關(guān)系近的靈長類細胞系之間和人癌細胞之間的比較可用Giemsa現(xiàn)代分析 4、人主要組織相容性抗原 人主要組織相容性抗原又稱人類白細胞抗原，存在于大多數(shù)有核細胞膜上，常用的抗原檢測是用補體依賴細胞毒實驗，用拒染來鑒定細胞活性。個別情況需要改動，主要的變化原因是HLA血清中的非特異性抗體的出現(xiàn)。細胞系上存在特定的HLA同種異體抗原，細胞吸收抗血清中已知特性的HLA同種異體抗體，由吸收后細胞毒效應減少量而得知細胞表面HLA抗原的情況。 5、核酸技術(shù) 用重組DNA技術(shù)或DNA探針技術(shù)鑒定和定量培養(yǎng)細胞中等位基因的多效性。,四、細胞系（株）的建立,1、建立細胞系的要求 1）組織來源 應說明細胞供體所屬物種是來自人體，動物或其他；供體的年齡，性別，取材的器官或組織。 2）細胞生物學檢測 應了解細的一般和特殊的生物學特性，特異性；看其是否有特殊產(chǎn)物包括分泌蛋白或激素等。 3）培養(yǎng)條件和方法 各種細胞都有自己比較適應的生存環(huán)境。因此，應指明使用的培養(yǎng)基，血清種類，用量以及細胞生存的適宜ph等。 2、培養(yǎng)細胞的命名 HeLa：為供體患者的姓名(來源于宮頸癌) CHO:中國地鼠卵巢細胞(chinese hamster ovary) 宮-743：宮頸癌上皮細胞，1974年3月建立 NIH3T3:美國國立衛(wèi)生研究所建立每3天傳代，每次接種3x10^5個/ml 3、已建立細胞系的鑒定、管理和使用 按國際慣例，當一個細胞系或細胞株建立后，研究者需要認真負責地把有關(guān)資料在雜志或期刊上報道，詳細介紹上述個項目即可。建立細胞系后，還要對細胞系進行維持：記錄好細胞系檔案；注意保持其規(guī)律性；細胞系傳代要防止交叉污染；每一種細胞系有凍存儲備。,二、培養(yǎng)細胞的常規(guī)檢查,（一）培養(yǎng)液和ph檢查 培養(yǎng)液一般情況下是呈桃紅色，但隨著時間的延長，由于CO2積累過多，培養(yǎng)液會發(fā)生酸化變黃，如果不及時調(diào)整ph，會對細胞發(fā)生不利的影響，嚴重時細胞脫落發(fā)生死亡。 （二）細胞生長情況分析 在很多情況，最先從組織又走出的為游走細胞，他們單獨活動，形態(tài)不規(guī)則，用縮時逐格顯微電泳法可以揭示出它們活躍的變形，游走和吞噬活動。游走細胞之后，接著出現(xiàn)的是成纖維細胞或上皮細胞，此時的細胞很少分裂。只有當細胞分裂出現(xiàn)以后，細胞數(shù)量逐漸增多，形成較大的生長暈或連接成片時，進入生長狀態(tài)。上皮細胞在生長過程中還常產(chǎn)生溶解酶，使得細胞發(fā)生液化，導致細胞相互分離，形成所謂的拉網(wǎng)現(xiàn)象，可能導致細胞脫落。,（三）培養(yǎng)細胞的污染檢測和排除,1、污染途徑 1)空氣 空氣是微生物及塵埃顆粒傳播的主要途徑。應將培養(yǎng)設施設在避風場所，做到無菌操作。 2）器材 各種培養(yǎng)器皿、器械消毒不徹底和洗刷不干凈可導致污染，另外co2培養(yǎng)箱等如果不定期消毒，可能引起污染。 3）操作 實驗無菌操作意識不強，技術(shù)不熟練，使用污染的器皿或封瓶不嚴等，都可造成污染。培養(yǎng)兩種以上細胞是，操作不規(guī)范，交叉使用吸管和培養(yǎng)液，培養(yǎng)瓶等有可能導致細胞交叉污染。 4）血清 有些血清在生產(chǎn)時就已經(jīng)被支原體或病毒等污染，變成了污染源。 5）組織樣本 原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本，取材時碘酒消毒后脫碘不徹底，可造成碘混入組織，細胞或培養(yǎng)液中，影響細胞生長。,,2、污染對培養(yǎng)細胞的影響及污染的檢測 1）細菌污染 常見的細菌污染有大腸桿菌，假單胞菌和葡萄球菌。細菌污染初期由于培養(yǎng)體系的抗生素作用，其繁殖處于抑制狀態(tài)，細胞生長不受明顯限制，污染情況用倒置顯微鏡觀察不易判斷。懷疑培養(yǎng)細胞有污染時，取10ml細胞懸液，100r/min離心5min，沉淀中加入無抗生素培養(yǎng)液2ml，將細胞放培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24小時內(nèi)可以獲得陽性結(jié)果。當污染的細菌量比較大或細菌增殖到一定基數(shù)，增殖的細菌就可以導致培養(yǎng)液外觀渾濁。肉眼就可以判斷。 2)真菌污染 一般真菌污染易發(fā)現(xiàn)，有白色或黃色污染物。在倒置顯微鏡下可以看見在細胞之間有縱橫交錯穿行的絲狀，管狀或樹枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中。念珠菌或酵母菌形態(tài)成卵形，散在細胞周邊和細胞之間生長。有時通過顯微鏡觀察可能發(fā)現(xiàn)瓶底外面生長的菌絲，不要錯當是培養(yǎng)瓶內(nèi)的污染。瓶外的污染物應及時用酒精棉球擦洗。 3）支原體污染 支原體是一種簡單的細胞。細胞被支原體污染后，支原體可與細胞長期共存，一般不會死亡，培養(yǎng)基一般不會發(fā)生渾濁。多數(shù)情況下，細微變化可以經(jīng)過傳代換液而緩解，外觀給人以正常感覺，實則細胞受到多方面潛在影響。個別嚴重者，可以導致細胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)瓶脫落。 可以利用相差油鏡觀察有無支原體污染。支原體呈暗色微小顆粒位于細胞表面和細胞之間。利用熒光染色法可使得支原體內(nèi)含有的dna著色進行觀察，也可利用掃描電鏡和透射電鏡觀察支原體。目前，有專門做支原體檢測的試劑盒，可以幫助盡快發(fā)現(xiàn)支原體的污染。另外，市場上有新一代支原體抗生素M-Plasmocin，能有效地殺滅支原體，又不影響細胞本身代謝。,,3、污染的預防 1）器皿嚴格消毒 2）操作間的消毒 定期清洗或更換超凈臺的空氣濾網(wǎng)，請專職人員進行定期檢查超凈臺的空氣凈化標準。檢查培養(yǎng)皿有無消毒標志。新配制的培養(yǎng)基應確定無菌的情況下方可使用，操作之前先用紫外燈滅菌半小時。 3）操作過程中預防 操作應戴口罩，雙手消毒。操作過程中應避免手碰到無菌部位。在開培養(yǎng)瓶蓋時妖精酒精燈燒灼。用培養(yǎng)液時要用專門的吸管。使用培養(yǎng)液時不宜過早開口。開瓶后的培養(yǎng)瓶應保持斜位，避免直立。不用了的培養(yǎng)液應立即封口。培養(yǎng)細胞處理前不要過早暴露。操作時避免交談，打噴嚏和咳嗽。操作完畢及時打掃超凈臺。 4）其他 應及早凍存培養(yǎng)物。重要的細胞株應有兩個人獨立完成。購入的未滅活血清應采取56*c水浴滅活30min，使血清的補體和支原體滅活。為了避免誘導抗藥細菌，應定期更換培養(yǎng)系統(tǒng)的抗生素，或盡可能不用抗生素。對新購入的細胞株應加強觀察，防止外來的污染源；定期消毒培養(yǎng)箱。,,4、污染的排除 通常用高壓滅菌法處理被污染的細胞，然后丟掉。如果有價值的細胞被污染，并且污染程度較輕，可以通過及時排除污染物，挽救細胞恢復正常。常用排除微生物污染的方法有以下幾種： 1)抗生素培養(yǎng)法 各種抗生素性質(zhì)不同，對微生物作用也不同，聯(lián)合應用比單用效果好，預防性運用比污染后運用效果好。有的抗生素對細菌僅有抑制作用，無殺滅效應。反復使用抗生素還能使微生物產(chǎn)生耐藥性，而且對細胞本身也有一定的影響。一些有價值的細胞被污染后，加入高濃度抗生素作用24至48H，再換入常規(guī)的培養(yǎng)液。 2）加溫除菌 根據(jù)支原體對熱敏度的特點，將受支原體污染的細胞加溫處理（41*C，5~10h）可以殺滅支原體。 3）動物體內(nèi)接種 將受微生物污染的腫瘤細胞接種到同種動物皮下或腹腔，借動物體內(nèi)免疫系統(tǒng)消滅微生物，待腫瘤細胞在體內(nèi)生長一定時間后。從體內(nèi)取出再進行體外培養(yǎng)。 4）與巨噬細胞共培養(yǎng) 巨噬細胞在體外條件下仍然能吞噬微生物并將其消化。 另外，巨噬細胞可分泌一些細胞因子支持其他細胞的克隆生長。因此，采用96孔板將極少培養(yǎng)細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)，可以在高度稀釋培養(yǎng)細胞，極大地降低微生物污染程度的同時，更有效的發(fā)揮巨噬細胞清除污染的效能。,第四節(jié)、細胞同步化,細胞同步化是指為研究細胞周期的不同階段的生化特征，必須獲得與細胞周期一致性的細胞。細胞同步化分自然同步化和人工同步化。 一、選擇同步化 （一）有絲分裂選擇法 這種方法主要是根據(jù)細胞周期的不同階段的生理變化設計的。是單層培養(yǎng)的細胞處于對數(shù)增殖期，此時細胞分裂活躍，分裂指數(shù)高，有絲分裂的細胞變圓隆起，與培養(yǎng)皿的附著性低。此時輕輕震蕩，M期細胞脫離器壁，懸浮于培養(yǎng)液中，手機培養(yǎng)液，再加入新鮮培養(yǎng)液，依此法繼續(xù)收集，則可以獲得一定數(shù)量的中期細胞。此法不足之處是只能在鐵臂細胞中用。 （二）細胞沉降分離法 此法主要用于懸浮細胞。不同時期的細胞體積不同，而細胞在給定離心場中沉降的速度與其半徑的平方成正比。因此，可用離心的方法分離細胞。,二、誘導同步化,（一）DNA合成阻斷法 選用 DNA合成的抑制劑，可逆的抑制DNA合成，將細胞群阻斷在S期或G/S交界處。胸腺嘧啶核苷雙阻斷法：該法利用過量的TdR能阻礙DNA合成的原理而設計，為了加強細胞同步化效果，常采用兩次TdR阻斷法，即雙阻斷法。第一次阻斷時間相當于G2 ，M和G1的總和或稍長。釋放時間不短于S其時間，而小于G2+M+G1期時間，這樣才能是所有位于G1/S期的細胞通過S期，而又不使沿周期前進最快的細胞進入下一個S期。第二次阻斷時間同第一次，再釋放。 （二）中期阻斷法 秋水仙素結(jié)合的微管蛋白可加合到微管上，但阻止其他微管蛋白單體繼續(xù)添加，從而破壞紡錘體結(jié)構(gòu)，導致染色體不能分開，將細胞阻斷在中期。常用的藥物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性較小。秋水仙酰胺阻抑法操作如下： 1）將細胞傳代培養(yǎng)至指數(shù)生長期 2）加入秋水仙酰胺，是最終濃度為0.05~0.1ug/ml培養(yǎng)基，作用6~7h。如使用秋水仙素，使用濃度應加大5 ~10倍 3）震蕩收集細胞，8004r/min離心5~10min，棄上清，收集的沉淀細胞即為M期細胞。加入一定量培養(yǎng)基將細胞接種到培養(yǎng)瓶中。 由于秋水仙素和秋水仙酰胺都對細胞有一定毒性，用量較小或作用時間較短細胞活性尚可恢復，而用量過大或時間過長則細胞不能存活。因此，使用時應嚴格控制其劑量和作用時間。,,三、各期細胞的獲得 （一）G2期細胞的獲得 根據(jù)細胞周期測定的數(shù)值，采用TdR雙阻斷法使細胞同步在G1/S期交界處后，洗去TdR使細胞釋放后繼續(xù)培養(yǎng)。其培養(yǎng)時間應大于S期時間而小于S+G2期時間。然后先用振蕩法使已進入M期的細胞脫落，棄去上清培養(yǎng)基；再用胰蛋白酶消化，加入新鮮培養(yǎng)基制成細胞懸液，離心收集細胞即為G2期細胞。 （二）G1期細胞的獲得 1）將用M期阻斷法獲得的細胞加入一定量的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1至10h即可獲得各階段的G1期細胞。 2）用缺乏異亮氨酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)時間超過一個細胞周期，即可獲得G1期細胞 (三）G0期細胞的獲得 可采用血清饑餓法得到G0期細胞 1）取處于對數(shù)生長期的細胞 2）用含0.5%~1%小牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞48~72h，或用無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h 3）用0.1~0.25%胰蛋白酶消化細胞可收獲G0期細胞，可用3H-TdR摻入驚醒測量鑒定。 四、同步化細胞的檢測 對各個時期的同步化細胞可通過流式細胞儀來鑒定其細胞周期，通過比較各時相細胞的百分比，看是否達到預期的目的。S期細胞可通過放射性自顯影來鑒定結(jié)果，M期細胞可涂片，染色，在顯微鏡下觀察染色體，統(tǒng)計有絲分裂指數(shù)來鑒定。,第五節(jié)、器官培養(yǎng),一、器官培養(yǎng)的概念 器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或器官組織塊后，不進行組織分離而直接在體外培養(yǎng)，保持其原有器官細胞的結(jié)構(gòu)和聯(lián)系。器官培養(yǎng)主要強調(diào)器官組織的相對完整性，重點觀察細胞正常聯(lián)系和排列情況，它們之間的相互影響和局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。這樣，就為實驗生物學提供了既處于一定的組織結(jié)構(gòu)之中又脫離于體內(nèi)種種復雜因素的細胞群體?，F(xiàn)代器官培養(yǎng)法采用把組織放置在細胞難以粘附的表面上，減少支持物與組織的接觸面積，以及把組織包埋于瓊脂中等方法，大大減少了細胞遷移現(xiàn)象，達到限制生長，是器官專一細胞同它們的基質(zhì)細胞維持相對正常的結(jié)構(gòu)關(guān)系的目的。離體器官需要特殊的培養(yǎng)條件。因此，器官培養(yǎng)的直徑與厚度均以不超過1~2nm為宜，以使營養(yǎng)物，氧氣和代謝廢物易于進入或排出。為了，使得內(nèi)部細胞有足夠的氧氣進入，一是將器官組織塊放置在培養(yǎng)基氣液面上，或者提高培養(yǎng)環(huán)境的氧分壓，一般要加注純氧。另外，還需要添加一些生長因子，激素等。 器官培養(yǎng)方法很多，但均只能進行原代培養(yǎng)，不能連續(xù)培養(yǎng)。,二、器官培養(yǎng)方法,（一）表玻璃器官培養(yǎng)法 即在一塊表玻璃內(nèi)加上雞胚提取液和雞血漿，凝固后將所培養(yǎng)的器官移植到上面，然后一起置于一培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)。 （二）瓊脂凝膠培養(yǎng)法 其是一種在合成培養(yǎng)基的混合溶液中，添加少量的瓊脂使其固化成固體培養(yǎng)基后，用來培養(yǎng)器官的方法。與血凝塊比較，瓊脂固體培養(yǎng)基的優(yōu)點在于基質(zhì)不液化，細胞在瓊脂上的遷移受到抑制。,（三）擦鏡紙培養(yǎng)法 擦鏡紙具有疏水性，可以漂浮在培養(yǎng)液表面作為培養(yǎng)器官的支持物，同時，培養(yǎng)液可以透過擦鏡紙而進入培養(yǎng)器官的內(nèi)部。需要注意的是，在將植塊放于擦鏡紙上面時，要盡量小心，以免下沉。 （四）金屬格柵器官培養(yǎng)法 （五）瓊脂小島器官培養(yǎng)法 用瓊脂制成小島狀的支持物，放在液體培養(yǎng)基中，然后將要培養(yǎng)的器官置于瓊脂上面進行培養(yǎng)。瓊脂不但具有支持的作用，而且還可以防止培養(yǎng)器官的細胞發(fā)生遷移。這種方法可以在培養(yǎng)過程中直接觀察植塊的生長狀況，換液也簡便。此外，固相培養(yǎng)基和液相培養(yǎng)基共存，從而可在同一培養(yǎng)體系中加入不同的營養(yǎng)成分，使在同一培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)不同的器官成為可能。,,