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血液促凝劑質(zhì)量控制方法及質(zhì)量控制體系的建立,撰稿及主講人：白杰18989871002原西安第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院檢驗(yàn)科,前言,血液促凝劑是生產(chǎn)真空采血管促凝管的核心原料，使用量大，技術(shù)要求高。對所制成的分離膠-促凝管的技術(shù)性能影響甚為關(guān)鍵，其技術(shù)水平代表了企業(yè)在真空采血管產(chǎn)品領(lǐng)域的真實(shí)技術(shù)水平。國內(nèi)采血管企業(yè)的技術(shù)競爭主要還是促凝劑的好與壞的競爭，使用了好的促凝劑，產(chǎn)品的競爭力就會(huì)顯著提高。,血液促凝劑，國內(nèi)大多采用普通硅石粉制成，促凝效率較低，一般凝血時(shí)間在15分鐘左右，凝固后還需放置20分鐘左右時(shí)間才能上機(jī)離心，離心時(shí)間也比較長，一般需要8--10分鐘，即使這樣仍然含有干擾吸樣的纖維蛋白。在計(jì)量的掌握方面要求嚴(yán)格，濃度過高易造成溶血。,目前，全國采血器的生產(chǎn)廠家所采用的促凝劑配方非?；靵y，但是歸納總結(jié)起來無外乎生物型和無機(jī)型兩種類型，或者兩種類型混合。生物型的主要成分為凝血致活酶和兔腦粉。,凝血酶的缺點(diǎn)是具有所有酶的特征，不好保存，受諸多因素影響容易失活。尤其在冬季受溫度影響很大，溫度低則活性降低，凝血時(shí)間自然也就延長。兔腦粉雖然凝血速度快，但是仍然受溫度制約，凝血酶和兔腦粉的凝血原理由于是以血漿先凝固然后帶動(dòng)血球凝固的，血塊凝集是通過纖維蛋白網(wǎng)羅血細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)的。因此血塊收縮不是十分理想，離心后血球仍然是以松散流動(dòng)的形式存在的。,無機(jī)型的主要成分是：高嶺土、石英粉、硅藻土、硅石粉、玻璃粉等。起作用的主要是所含成分二氧化硅二氧化硅的含量在不同的產(chǎn)品中是不同的，因此，凝集活性自然也有差別。無機(jī)型的缺點(diǎn)是凝血速度慢，還有纖維蛋白會(huì)二次析出的弊病。,二氧化硅的作用是激活機(jī)體的內(nèi)、外凝血系統(tǒng)，啟動(dòng)瀑布式凝血反應(yīng)。作用于血小板第Ⅺ、Ⅻ因子。但是，無機(jī)型的缺點(diǎn)是凝血時(shí)間較有機(jī)型的長，壓纖維蛋白的功能較弱。完成這個(gè)過程需要一定的時(shí)間和溫度，也不可能在短時(shí)間內(nèi)完成凝血的全過程。各個(gè)廠家的配方也參差不齊，凝血效果則有好有壞。總而言之，包括國外的知名品牌在內(nèi)，還未達(dá)到理想的狀態(tài)。,用以下技術(shù)指標(biāo)綜合評價(jià)促凝劑的優(yōu)劣：1、凝血時(shí)間長短。2、放置時(shí)間與上機(jī)離心的時(shí)間。3、有無明顯的纖維蛋白（即影響吸樣針吸樣的程度）。4、管壁清潔程度。5、分離膠的清潔程度（分離膠內(nèi)夾帶血絲少，分離膠離心后應(yīng)呈白色）。6、血清的清析度如何。7、受溫度影響的大小。8、是否達(dá)到100%的一次離心成功率。9、有無完善的質(zhì)量控制體系，特別是不須采用抽血驗(yàn)證的方法科學(xué)、客觀、準(zhǔn)確的評價(jià)促凝劑的優(yōu)劣。,本產(chǎn)品的原理如下：配方主要成分之一PHA凝集素（Lectin）是指一種從各種植物，無脊椎動(dòng)物和高等動(dòng)物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白，因其能凝集紅血球（含血型物質(zhì)），故名凝集素。,植物血凝素是一種具有膠凝性特點(diǎn)的蛋白質(zhì)，它與血液中的抗原會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)引起紅血球的聚集。本促凝劑是個(gè)綜合性的配方，PHA的提取工藝是關(guān)鍵技術(shù)，由于傳統(tǒng)的提取技術(shù)比較復(fù)雜，并且主要用于制藥工業(yè)，沒有適合促凝劑方面的專用提取技術(shù)，通過我自創(chuàng)的獨(dú)特提取工藝保證了產(chǎn)品的穩(wěn)定性和持久性，達(dá)到了采血管工藝所需要的技術(shù)指標(biāo)。,耐高溫實(shí)驗(yàn)：將噴有促凝劑的試管放置在55℃2℃的水浴箱內(nèi)2小時(shí)，然后抽血實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證是否對凝血效果有影響。并采用96孔國際標(biāo)準(zhǔn)血凝板和顯微鏡凝集法實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證對血凝的影響。,低溫實(shí)驗(yàn)：將噴有促凝劑的試管與對照管預(yù)先放在冰箱內(nèi)30分鐘預(yù)冷。然后抽血混勻后存放在2-4℃的冰箱內(nèi)20分鐘取出，3500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，驗(yàn)證凝血效果。并采用顯微鏡凝集法實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證對血凝的影響。,糾正一個(gè)認(rèn)識誤區(qū),現(xiàn)在，無論是醫(yī)院還是采血管企業(yè)，對于促凝劑的評價(jià)都是追求凝血時(shí)間的快與慢，似乎凝血時(shí)間越快越好。實(shí)際上這是一個(gè)認(rèn)識上的誤區(qū)，必須要糾正，下面我從理論上來加以闡述：眾所周知，血液的凝固是需要13種凝血因子相繼激活，以最后纖維蛋白元轉(zhuǎn)化為纖維蛋白網(wǎng)羅血細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)血液凝固的。完成這個(gè)過程是需要花費(fèi)一定時(shí)間的，加入促凝劑僅僅是為血液凝固提供血液凝固所需要的材料，而不能提前加快凝血時(shí)間與速度。加入凝血酶或兔腦粉后血液能在短期內(nèi)凝固是一種假象，實(shí)際是血漿凝固而帶動(dòng)血球凝固了，真正意義上的血液凝集的發(fā)生應(yīng)該是血球發(fā)生充分的凝固才行。而完成這個(gè)過程需要花費(fèi)6--10分鐘的時(shí)間，在這個(gè)過程中，纖維蛋白被充分的消耗。,在工廠里，生產(chǎn)含促凝劑的采血管都要進(jìn)行試管的前期硅化與烘干處理，噴完促凝劑以后還要烘干。浪費(fèi)時(shí)間、工時(shí)、電力。為了解決以上這些問題，本促凝劑已經(jīng)成功的實(shí)現(xiàn)了試管不需事前進(jìn)行硅化與烘干處理。只需要將本促凝劑噴入試管內(nèi)就可以了，不需進(jìn)行烘干處理。使用效果與烘干處理的無差別。,現(xiàn)在，對于促凝劑促凝效果的評價(jià)都是以健康人為標(biāo)準(zhǔn)的。對于健康人來講由于不存在凝血因子的缺乏，僅僅是為了加快凝血時(shí)間而促進(jìn)血液的提前凝固。最重要的是對于缺乏凝血因子的患者要加快凝血的時(shí)間需要額外的補(bǔ)充所缺乏的凝血因子。因此，研發(fā)一種高效、快速的促凝劑顯得十分重要。為了解決這個(gè)問題，我經(jīng)過多年科研，成功的解決了這個(gè)問題。,我研制的促凝劑的原理如下：各廠家的配方雖然五花八門，所提供的凝血時(shí)間參數(shù)都是以正常人的數(shù)據(jù)為根據(jù)。然而，實(shí)際在醫(yī)院中有血液系統(tǒng)問題與血栓疾病治療、肝素化治療、透析患者的治療等病人還是很多的。在研制促凝劑時(shí)沒有充分考慮到異常情況采血不利的因素的補(bǔ)償，所以仍有部分病人在采血后凝血情況仍然不理想。拖了大多數(shù)人的后腿，延誤了上機(jī)操作的時(shí)間。,由于凝血過程是通過多種凝血因子所參與的過程，所以研制促凝劑的配方必須綜合考慮這些因子的補(bǔ)充。在配方中平衡各種因子的百分比，通過協(xié)調(diào)作用來彌補(bǔ)某些患者的不足，加速凝血過程。我研制的配方綜合考慮了凝血不良的因素，在配方中重點(diǎn)考慮了異常情況采血的代償。,本產(chǎn)品的原理如下：配方主要成分之一PHA凝集素（Lectin）是指一種從各種植物，無脊椎動(dòng)物和高等動(dòng)物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白，因其能凝集紅血球（含血型物質(zhì)），故名凝集素。常用的為植物凝集素（Phytoagglutin，PHA），通常以其被提取的植物命名如刀豆素A（Conconvalina，ConA等，凝集素是它們的總稱。植物血凝素是一種具有膠凝性特點(diǎn)的蛋白質(zhì)，它與血液中的抗原會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)引起紅血球的聚集。在組分中PHA起著至關(guān)重要的作用。本促凝劑已經(jīng)申報(bào)了發(fā)明專利。,保證了產(chǎn)品的穩(wěn)定性和持久性，達(dá)到了采血管工藝所需要的技術(shù)指標(biāo)。,主要技術(shù)參數(shù)：1、血液離體后5-8分鐘凝集，健康人15-20分鐘上機(jī)離心。離心時(shí)間5分鐘，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為3500轉(zhuǎn)/分。2、無纖維蛋白：血清內(nèi)無肉眼可見明顯的纖維蛋白殘留。3、100%離心成功率。4、溫度在2-38℃血凝效果一樣。5、儲(chǔ)存：放置4℃以下避光保存。6、外觀：混勻后呈白色均勻的混懸液，靜置后下層為白色，上層為淡黃色半透明。,7、氣味：聞起來有豆子的特殊氣味。8、、加入真空管量：3--5毫升采血量加20-30微升。8--10毫升采血量加25-30微升12-16毫升采血量加35微升9、、包裝量：塑料試劑瓶包裝，1000ml/瓶。,優(yōu)點(diǎn)：1、血清清晰度高。血塊收縮緊密，倒置過來血塊呈果凍狀形成一個(gè)整體。2、管壁清潔程度好，管壁上和膠塞上無血球等物質(zhì)附著。3、與血清分離膠不發(fā)生反應(yīng)，血清分離膠離心后呈原色或僅有少量細(xì)微血點(diǎn)，外觀清潔程度好。4、采血后放置15分鐘后離心。,5、對檢驗(yàn)結(jié)果無干擾或影響。6、無須烘干，不含有無水乙醇或乙醚。7、促凝劑不用烘干，減少了加工環(huán)節(jié)，節(jié)約了時(shí)間與加工成本，使離心后的試管外觀美觀清潔。8、試管采用普通PET試管，不須事先做硅化處理，促凝劑內(nèi)已包含脫壁劑。玻璃試管必須做硅化處理。,使用前應(yīng)將本品顛倒混勻多次，直至底部看不見沉淀為止。把本品倒入噴霧機(jī)的加液瓶內(nèi)噴入硅化或未硅化過的試管內(nèi)壁。不需烘干處理，然后抽真空壓塞。,注意事項(xiàng)：在噴促凝劑之前一定叮囑工人用生理鹽水充分清洗掉殘留在噴頭與管路里面的物質(zhì)。尤其是噴過抗凝劑以后如果未清洗，很可能會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，造成促凝劑的失效。如果用去離子水清洗，殘留水過多會(huì)引起滲透壓的改變導(dǎo)致溶血。,抽血驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),1、試管制備：將塑料PET試管不用經(jīng)過硅化處理，在噴霧劑上直接噴入20-30微升左右的促凝劑。不用烘干，然后抽真空、壓塞。2、分別準(zhǔn)備對照管與待驗(yàn)證管各若干支。3、準(zhǔn)備好消毒與采血所需物品。4、常規(guī)消毒，然后用采血針刺入靜脈把血液抽入試管內(nèi)。5、從采第一支試管完畢開始計(jì)時(shí)計(jì)算凝血時(shí)間，以后的試管依次按照實(shí)際完畢時(shí)間計(jì)時(shí)。6、采血5分鐘后開始緩慢傾斜試管觀察凝血情況，如果初凝出現(xiàn)立即計(jì)時(shí)計(jì)算凝血時(shí)間。7、從5分鐘后每隔2分鐘觀察一下凝血情況，完全凝固以把試管倒置或傾斜后血液完全不流動(dòng)為標(biāo)準(zhǔn)。8、從采血完畢后放置20分鐘開始上機(jī)離心，3500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。,9、結(jié)果判斷：以離心后血清清晰無纖維蛋白，無掛壁、無溶血的血清為合格品。10、統(tǒng)計(jì)：計(jì)算對照管和實(shí)驗(yàn)管的離心成功率與失敗率，求出百分比。11、溫度：以室溫15---35℃為測試溫度。,促凝劑的質(zhì)量控制,關(guān)于血液促凝劑的凝血效果檢測問題，現(xiàn)在各公司均采用抽血試驗(yàn)的方法。此方法應(yīng)盡量避免采用，因?yàn)楦鞴緦τ诮?jīng)常采用從員工中動(dòng)員獻(xiàn)血的方法，員工都對獻(xiàn)血十分反感，另外，由于個(gè)體差異問題以及各批次與存放時(shí)間的不統(tǒng)一，都會(huì)給抽血實(shí)驗(yàn)造成差異，從而無法真實(shí)判斷優(yōu)劣。目前全國真空采血器企業(yè)尚無公認(rèn)的統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)方法。本促凝劑解決了這個(gè)難題，采用96孔國際標(biāo)準(zhǔn)血凝板檢測與顯微鏡鏡檢相結(jié)合的方法，其它促凝劑由于與本促凝劑配方原理不同，所以不能用本方法檢測或檢測不出來。,血凝試驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作與結(jié)果判斷,[材料與試劑],1.96孔“U”形或“V”形微量反應(yīng)板，定量移液器，滴頭，微型振蕩器。2.0.9%生理鹽水。3.待測液體未稀釋的促凝劑。,[實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及操作方法],（一）血球凝集(HA)試驗(yàn)1.在96孔微量反應(yīng)板上進(jìn)行，自左至右各孔加0,2mL生理鹽水。2.于左側(cè)第1孔加0,2mL促凝劑，混合均勻后，吸0,2mL至第2孔，依次倍比稀釋至第11孔，吸棄0,2mL；第12孔為紅細(xì)胞對照。3.自右至左依次向各孔加入2%人0型血紅細(xì)胞懸液0.2mL，在振蕩器上振蕩，室溫下靜置2小時(shí)后觀察結(jié)果。,結(jié)果判定,從靜置2小時(shí)后待對照孔紅細(xì)胞已沉淀即可進(jìn)行結(jié)果觀察。紅細(xì)胞全部凝集，沉于孔底，平鋪呈網(wǎng)狀，即為100%凝集（++++），不凝集者（-）紅細(xì)胞沉于孔底呈紅色點(diǎn)狀。以100%凝集的最大稀釋度為該血凝效價(jià)，如血凝價(jià)為1:256.位于第8孔。,2%紅細(xì)胞制備方法,先用真空采血器（含3.8%枸櫞酸鈉），采血至需要血量，加滅菌生理鹽水為抗凝血的5倍，以2000r/min離心10min，棄上清液，再加生理鹽水懸浮血球，同上法離心沉淀，如此將紅細(xì)胞洗滌三次，最后根據(jù)所需用量，用滅菌生理鹽水配成2%人0型紅細(xì)胞懸液。,血凝試驗(yàn)(hemagglutinintest,HA),原理血凝素PHA與人0型紅細(xì)胞表面糖蛋白受體發(fā)生結(jié)合而發(fā)生凝集檢測血凝素的存在，滴定血凝效價(jià)，大致估計(jì)血凝效果。,結(jié)果觀察以發(fā)生50%凝集者(++)為該血凝效價(jià)，其稀釋度即為一個(gè)血凝單位。,,,顯微鏡鏡檢法,1、取空白PET塑料試管一支，加入0.9%生理鹽水5毫升。2、向上述試管內(nèi)加入促凝劑原液25微升，然后蓋上試管塞，顛倒混勻5次。3、取載玻片一枚，用蠟筆在中間劃一道直線。4、用加液槍吸取稀釋后的20微升，分別加入玻片的兩側(cè)。以左側(cè)端為檢測區(qū)，以右側(cè)端為對照區(qū)。然后在兩端加入2%人O型血生理鹽水混懸液各20微升。5、把玻片旋轉(zhuǎn)混勻一分鐘，出現(xiàn)肉眼可見的凝集。6、10分鐘后將載玻片放在普通顯微鏡下，用低倍鏡觀察凝血情況。7、結(jié)果判斷：合格--血球凝集成小團(tuán)塊狀，少量的游離紅血球。完全不凝集-------血球呈均勻的顆粒狀，無凝集現(xiàn)象。,出廠后的成品質(zhì)量檢驗(yàn)方法,1、批量抽檢將出廠后待發(fā)貨之前的樣品按照每箱1支的標(biāo)準(zhǔn)分別留取樣品，將試管打開分別加入0.9%生理鹽水0.5毫升，然后蓋上試管塞，顛倒混勻數(shù)次，取出0.25毫升加入96孔血凝板內(nèi)，余下的加入0.9%生理鹽水3毫升混勻后做鏡檢。2、保存期檢驗(yàn)分別留取不同階段的保存期的試管按照上述方法做檢驗(yàn)。3、處理客戶投訴的檢驗(yàn)方法對客戶投訴的有爭議的樣品按照上述方法檢測觀察結(jié)果。,結(jié)束語,血液促凝劑的評價(jià)指數(shù)較多，好的促凝劑將會(huì)滿足各項(xiàng)指標(biāo)。然而，達(dá)到這一點(diǎn)并不是所有的促凝劑都能達(dá)到的，因此，需要通過實(shí)驗(yàn)來加以甄別。,謝謝觀看！,