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第2講 微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用 課時跟蹤練 1．(2014全國卷Ⅱ)為了調(diào)查某河流的水質(zhì)狀況，某研究小組測定了該河流水樣中的細菌含量，并進行了細菌分離等工作?；卮鹣铝袉栴}： (1)該小組采用稀釋涂布平板法檢測水樣中的細菌含量。在涂布接種前，隨機取若干滅菌后的空白平板先行培養(yǎng)了一段時間，這樣做的目的是______________________________________________； 然后，將1 mL水樣稀釋100倍，在3個平板上用涂布法分別接入0.1 mL稀釋液；經(jīng)適當(dāng)培養(yǎng)后，3個平板上的菌落數(shù)分別為39、38和37。據(jù)此可得出每升水樣中的活菌數(shù)為________。 (2)該小組采用平板劃線法分離水樣中的細菌，操作時，接種環(huán)通過____________滅菌。在第二次及以后的劃線時，總是從上一次劃線的末端開始劃線。這樣做的目的是___________________。 (3)示意圖A和B中，________表示的是用稀釋涂布平板法接種培養(yǎng)后得到的結(jié)果。 (4)該小組將得到的菌株接種到液體培養(yǎng)基中并混勻，一部分進行靜置培養(yǎng)，另一部分進行振蕩培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：振蕩培養(yǎng)的細菌比靜置培養(yǎng)的細菌生長速度快。分析其原因是振蕩培養(yǎng)能提高培養(yǎng)液中________的含量，同時可使菌體與培養(yǎng)液充分接觸，提高________的利用率。 解析：(1)為了檢測培養(yǎng)基平板滅菌是否合格，可在涂布接種前，隨機取滅菌后的空白平板先行培養(yǎng)一段時間，觀察空白平板上是否出現(xiàn)菌落。0.1 mL稀釋液中平均有(39＋38＋37)/3＝38個活菌，則每毫升稀釋液中活菌的數(shù)目為38/0.1＝380個，則稀釋前每毫升水樣中活菌數(shù)目為380100＝3.8104個，則每升水樣中活菌數(shù)目為3.81041 000＝3.8107個。(2)接種環(huán)、接種針等金屬用具可直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒，以達到迅速徹底滅菌的目的。在第二次及以后的劃線時，總是從上一次劃線的末端開始劃線，其目的是將聚集的菌體逐步稀釋以便獲得單個菌落。(3)比較圖A和圖B可以看出：A培養(yǎng)基中細菌的分布呈線性，是用平板劃線法接種培養(yǎng)后得到的結(jié)果；B培養(yǎng)基中細菌均勻分布，是用稀釋涂布平板法接種培養(yǎng)后得到的結(jié)果。(4)振蕩培養(yǎng)可以提高培養(yǎng)液中溶解氧的含量，還可以使菌體與培養(yǎng)液充分接觸，提高了營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，因此振蕩培養(yǎng)的細菌比靜置培養(yǎng)的細菌生長速度快。 答案：(1)檢測培養(yǎng)基平板滅菌是否合格　3.8107個　 (2)灼燒　將聚集的菌體逐步稀釋以便獲得單個菌落　 (3)B　(4)溶解氧　營養(yǎng)物質(zhì) 2．(2013全國卷Ⅱ)臨床使用抗生素前，有時需要做細菌耐藥實驗。實驗時，首先要從病人身上獲取少量樣本，然后按照一定的實驗步驟操作，以確定某致病菌對不同抗生素的敏感性。 回答下列問題： (1)為了從樣本中獲取致病菌單菌落，可用________法或________法將樣本接種于固體培養(yǎng)基表面，經(jīng)過選擇培養(yǎng)、鑒別等步驟獲得。 (2)取該單菌落適當(dāng)稀釋，用________法接種于固體培養(yǎng)基表面，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使其均勻生長，布滿平板。 (3)為了檢測該致病菌對于抗生素的敏感性，將分別含有A、B、C、D四種抗生素的濾紙片均勻置于該平板上的不同位置培養(yǎng)一段時間后，含A的濾紙片周圍出現(xiàn)透明圈，說明該致病菌對抗生素A________；含B的濾紙片周圍沒有出現(xiàn)透明圈，說明該致病菌對抗生素B________；含C的濾紙片周圍的透明圈比含A的小，說明__________________________；含D的濾紙片周圍的透明圈也比含A的小，且透明圈中出現(xiàn)了一個菌落，在排除雜菌污染的情況下，此菌落很可能是抗生素D的________。 (4)根據(jù)上述實驗結(jié)果，為達到抗菌目的，最好應(yīng)選用抗生素________。 解析：(1)實驗室中對微生物純化培養(yǎng)時，常用的接種方法有劃線法和稀釋涂布法。(2)若讓已經(jīng)獲得的單個菌落在固體培養(yǎng)基上大量且均勻繁殖，常用涂布器把稀釋的菌液均勻涂滿整個平板。(3)對某種抗生素越敏感的致病菌，在該抗生素存在的范圍內(nèi)，越不易生存，形成的透明圈就越大。但是，如果在透明圈中還有菌落生存，則說明這個菌落的細菌耐藥性很強。(4)通過(3)可知，在應(yīng)用時，要想殺死某致病菌，就得選擇能使該致病菌大量死亡，即產(chǎn)生的透明圈大的那種抗生素。 答案：(1)平板劃線　稀釋涂布(或涂布) (2)涂布　(3)敏感　不敏感　該致病菌對C的敏感性比對A的弱　耐藥菌　(4)A 3．為了調(diào)查成都自來水的水質(zhì)情況，某研究小組對自來水水樣中的細菌含量進行了測定，請回答下列問題： (1)在微生物的培養(yǎng)過程中，實驗室對培養(yǎng)基滅菌常用的方法是____________。為防止冷凝水影響細菌的生長，需將培養(yǎng)皿________培養(yǎng)。 (2)若小組采用平板劃線法分離水樣中的細菌，劃線時落在培養(yǎng)基上共畫了5個區(qū)域，則共需要________次灼燒接種環(huán)。該培養(yǎng)基從物理狀態(tài)上看，屬于________培養(yǎng)基。 (3)檢測自來水中大腸桿菌的數(shù)量，可選用伊紅美藍培養(yǎng)基，伊紅美藍培養(yǎng)基除了為大腸桿菌的生長繁殖提供水和碳源外，還可以提供______________等基本營養(yǎng)成分。該研究小組在統(tǒng)計菌落數(shù)目時，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，這樣可以防止因____________而遺漏菌落的數(shù)目，如果接種后一個平板經(jīng)培養(yǎng)后的菌落分布如下圖所示，推測接種時可能的操作失誤是____________。 解析：(1)微生物的培養(yǎng)基常用高壓蒸氣滅菌法進行滅菌。為防止冷凝水影響細菌的生長，需將培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)。 (2)因為每次劃線前后都需要滅菌，所以畫了5個區(qū)域需要6次灼燒接種環(huán)。平板劃線法用的是固體培養(yǎng)基。 (3)微生物的培養(yǎng)基的基本成分一般包括水、無機鹽、碳源、氮源。在統(tǒng)計菌落數(shù)目時，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，這樣可以防止因培養(yǎng)時間不足而遺漏菌落的數(shù)目，如果接種后一個平板經(jīng)培養(yǎng)后的菌落分布如題圖所示，推測接種時可能的操作失誤是涂布不均勻。 答案：(1)高壓蒸氣滅菌　倒置　(2)6　固體　(3)氮源和無機鹽(答不全不得分)　培養(yǎng)時間不足　涂布不均勻 4．(2017贛州模擬)如圖是分離、純化及保存枯草芽孢桿菌菌株的過程示意圖：將土壤表層土稀釋液煮沸十五分鐘(枯草芽孢桿菌的芽孢不會失去活性)靜置5分鐘后獲得樣品，進行如下操作： 請回答下列問題： (1)由題意可知，除用選擇培養(yǎng)基外，還有__________操作起到篩選作用。 (2)上圖的劃線操作中，培養(yǎng)基從物質(zhì)狀態(tài)分類上屬于______________，接種環(huán)用________法進行滅菌，劃線過程中第一區(qū)和最后一區(qū)的劃線________(能/不能)相連。 (3)用稀釋涂布平板法在5個培養(yǎng)基平板上，均接種稀釋倍數(shù)為104的樣品液0.1 mL，培養(yǎng)一段時間后，平板長出來的菌落數(shù)分別為13，160，532，175和187。每毫升樣品中的細菌數(shù)量為________個。 (4)用上述方法統(tǒng)計出的菌落數(shù)往往比樣品中活菌的實際數(shù)目________，原因是___________________________________________ ______________________________________________________。 解析：(1)根據(jù)題干信息“將土壤表層土稀釋液煮沸十五分鐘(枯草芽孢桿菌的芽孢不會失去活性)”可知，除用選擇培養(yǎng)基外，還有煮沸操作起到篩選作用。 (2)上圖的劃線操作中，培養(yǎng)基從物質(zhì)狀態(tài)分類上屬于固體培養(yǎng)基；接種環(huán)用灼燒滅菌(灼燒) 法進行滅菌；劃線過程中第一區(qū)和最后一區(qū)的劃線不能相連。 (3)用稀釋涂布平板法在5個培養(yǎng)基平板上，均接種稀釋倍數(shù)為104的樣品液0.1 mL，培養(yǎng)一段時間后，平板長出來的菌落數(shù)分別為13，160，532，175和187。為了保證結(jié)果準確，一般選擇菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)，因此每毫升樣品中的細菌數(shù)量為＝104＝1.74107個。 (4)由于兩個或者多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，因此用上述方法統(tǒng)計出的菌落數(shù)往往比樣品中活菌的實際數(shù)目少。 答案：(1)煮沸　(2)固體培養(yǎng)基　灼燒滅菌(灼燒)　不能　(3)1.74107　(4)少　兩個或者多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落 5．(2017銀川模擬)金黃色葡萄球菌具有高度耐鹽性，在血平板(培養(yǎng)基中添加適量血液)上生長時，可破壞菌落周圍的紅細胞，使其褪色。下面是某研究小組測定自來水中金黃色葡萄球菌濃度的實驗操作。請回答下列問題： (1)金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基為7.5%NaCl牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，根據(jù)實驗?zāi)康膽?yīng)選擇________(填“固體”“液體”)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入7.5%NaCl的作用是_________________________________。 (2)在制作血平板時需等平板冷卻后，方可加入血液，以防止______________。血平板在使用前，需置于恒溫培養(yǎng)箱中適宜溫度下培養(yǎng)一段時間的目的是____________________________________。 (3)取10mL自來水樣，加入____________稀釋成10－1的自來水樣，依次操作，制作稀釋10－2、10－3、10－4的自來水樣。 (4)將0.1 mL 10－1～10－4的四個稀釋樣液，分別接種到4組(每組3個)血平板上的方法是__________________。在血平板上，金黃色葡萄球菌菌落的周圍會出現(xiàn)____________________。若在10－3組的3個血平板上，金黃色葡萄球菌菌落數(shù)分別為42、38和37，則每升自來水中的活菌數(shù)約為______________個。 解析：(1)金黃色葡萄球菌在血平板(培養(yǎng)基中添加適量血液)上生長時，可破壞菌落周圍的紅細胞，使其褪色，據(jù)此原理可對金黃色葡萄球菌進行篩選，因此應(yīng)選擇固體培養(yǎng)基。金黃色葡萄球菌具有高度耐鹽性，用7.5% NaCl牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)金黃色葡萄球菌時，培養(yǎng)基中加入的7.5% NaCl，不影響金黃色葡萄球菌的生長，但同時可抑制其他菌的生長，因此利于金黃色葡萄球菌的篩選。 (2)高溫會破壞血細胞，因此為了防止高溫破壞血細胞，在制作血平板時需等平板冷卻后，方可加入血液。血平板在使用前，需置于恒溫培養(yǎng)箱中適宜溫度下培養(yǎng)一段時間的目的是：檢測血平板是否符合無菌要求。 (3)取10 mL自來水樣，加入90 mL無菌水稀釋成10－1的自來水樣，依次操作，制作稀釋10－2、10－3、10－4的自來水樣。 (4)將稀釋的樣液接種到血平板上進行微生物純化培養(yǎng)，所采用的接種方法是稀釋涂布平板法。金黃色葡萄球菌可破壞菌落周圍的紅細胞，使其褪色，因此在血平板上，金黃色葡萄球菌菌落的周圍會出現(xiàn)透明圈(溶血圈)。依題意：血平板上生長的平均菌落數(shù)＝(42＋38＋37)3＝39個，則1 mL自來水中的活菌數(shù)約＝(390.1)1 000＝3.9105個，每升自來水中的活菌數(shù)為＝3.9105103＝3.9108個。 答案：(1)固體　利于金黃色葡萄球菌的篩選　(2)高溫破壞血細胞　檢測血平板是否符合無菌要求　(3)90 mL無菌水　(4)稀釋涂布平板法　透明圈(溶血圈)　3.9108 6．淀粉酶是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑之一，廣泛用于印染、釀造和醫(yī)藥行業(yè)。請回答： (1)配制篩選能分泌淀粉酶的微生物的培養(yǎng)基時，應(yīng)以______ 為唯一碳源。獲得的菌種長期保存的方法是____________。 (2)從面粉加工廠附近的土壤中，取5g土壤倒入裝有45 mL蒸餾水并帶有玻璃珠的錐形瓶中振蕩，制成土壤懸液。將土壤懸液稀釋104倍后，用____________法分別將0.1 mL的菌液接種到3個平板上，培養(yǎng)一段時間，3個平板中的菌落數(shù)分別為53個、60個、73個，則土壤懸液中分泌淀粉酶的微生物有________個/mL。將接種后的平板置于恒溫培養(yǎng)箱中____________(填“正置”或“倒置”)培養(yǎng)。 (3)在培養(yǎng)基中加入碘化鉀后，出現(xiàn)透明圈的菌落能分泌淀粉酶，原理是____________________________。一般情況下，透明圈直徑(D)和菌落直徑(d)的比值(D/d)反映了淀粉酶的活性，它們的關(guān)系是______________。 (4)篩選獲得的微生物，經(jīng)鑒定是芽孢桿菌，芽孢桿菌除產(chǎn)生活性較強的淀粉酶外，還產(chǎn)生活性較強的蛋白酶和脂肪酶，因此，在動物飼料中添加芽孢桿菌或其代謝產(chǎn)物可提高動物________________的效率。 解析：(1)根據(jù)選擇培養(yǎng)基的配置原則，配制篩選能分泌淀粉酶的微生物的培養(yǎng)基時，應(yīng)以淀粉為唯一碳源。獲得的菌種長期保存的方法是甘油管藏。 (2)對微生物計數(shù)一般采用稀釋涂布平板法；根據(jù)題干中所給數(shù)據(jù)，土壤懸液中分泌淀粉酶的微生物有(53＋60＋73)30.1104＝6.2106 個/mL；為了防止培養(yǎng)基中的冷凝水污染培養(yǎng)基，需要將接種后的平板置于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。 (3)淀粉遇碘化鉀變藍，淀粉酶分解淀粉后出現(xiàn)透明圈，因此在培養(yǎng)基中加入碘化鉀后，出現(xiàn)透明圈的菌落能分泌淀粉酶。一般情況下，透明圈直徑(D)和菌落直徑(d)的比值(D/d)反映了淀粉酶的活性，D/d值越大，淀粉酶活性越高。 (4)分析題意可知，芽孢桿菌除產(chǎn)生活性較強的淀粉酶外，還產(chǎn)生活性較強的蛋白酶和脂肪酶，因此在動物飼料中添加芽孢桿菌或其代謝產(chǎn)物可提高動物對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的效率。 答案：(1)淀粉　甘油管藏　(2)稀釋涂布平板　6.2106　倒置　(3)淀粉遇碘化鉀變藍，淀粉酶分解淀粉后出現(xiàn)透明圈　D/d值越大，淀粉酶活性越高　(4)對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收 7．乙草胺是除草劑中常見的化學(xué)成分，在土壤和水體中存在時間長，難以降解。請回答下列問題： (1)實驗小組欲從土壤中獲取乙草胺降解菌，需將土壤樣品置于以__________為唯一碳源的培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)。 (2)該實驗小組選取乙草胺濃度為800 mg/L的富集液進行系列稀釋，分別取103、104和105稀釋倍數(shù)的稀釋液0.1 mL涂布于培養(yǎng)基上，每個稀釋倍數(shù)涂布三個平板，結(jié)果各平板的菌落數(shù)分別為(286、298、297)，(35、32、31)，(36、7、2)。 ①不適合用于計數(shù)的為__________倍數(shù)的稀釋液，另外兩組稀釋倍數(shù)得到的細菌數(shù)不一致的原因可能是________________________ _____________________________________________________。 ②某同學(xué)認為，要防止雜菌的污染，可在培養(yǎng)基中加入青霉素，你覺得該同學(xué)的說法是否正確？_______，理由是_______________。 (3)實驗小組從土壤中篩選出兩株乙草胺降解菌D1和D2，溫度對兩株降解菌的生長的影響如下圖所示。對溫度適應(yīng)范圍更廣的是菌株__________，溫度會影響菌株的生長狀況的原因是_______________。 解析：(1)欲從土壤中獲取乙草胺降解菌，需將土壤樣品置于以乙草胺為唯一碳源的培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)，在該培養(yǎng)基上，只有乙草胺降解菌能夠生長。 (2)①不適合用于計數(shù)的為105倍數(shù)的稀釋液，因為該稀釋倍數(shù)下三個培養(yǎng)基中菌落數(shù)差別較大。用另外兩組稀釋倍數(shù)進行計數(shù)得到的細菌數(shù)不一致的原因可能是稀釋倍數(shù)為103時，更多的菌落連在一起最終形成單菌落，導(dǎo)致結(jié)果小于稀釋倍數(shù)為 104 組。 ②加入青霉素，不僅會抑制雜菌繁殖，也會抑制目的菌的繁殖。 (3)D1菌株在不同溫度下相對生長速率變化不大，對溫度適應(yīng)范圍更廣，溫度會影響菌株的生長狀況的原因是溫度會影響與菌株生長代謝有關(guān)酶的活性。 答案：(1)乙草胺　(2)105　稀釋倍數(shù)為103時，更多的菌落連在一起最終形成單菌落，導(dǎo)致結(jié)果小于稀釋倍數(shù)為 104 組　不正確　青霉素抑制雜菌繁殖的同時，也會抑制目的菌的繁殖　(3)D1　溫度會影響與菌株生長代謝有關(guān)酶的活性 8．苯酚及其衍生物廣泛存在于工業(yè)廢水中，對環(huán)境有嚴重危害。小明同學(xué)準備依據(jù)如圖操作步驟，從處理廢水的活性污泥中分離篩選酚降解高效菌株。請回答下列問題： (1)酚降解菌富集培養(yǎng)基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作為碳源的有_______________________________。 (2)將采集到的樣品接種培養(yǎng)，苯酚用量應(yīng)隨轉(zhuǎn)接次數(shù)增加而逐漸________，以達到富集酚降解菌的目的。若上圖平板中菌落過于密集，應(yīng)進一步________，以便于菌落計數(shù)與分離。制備平板培養(yǎng)基時除了需要水、營養(yǎng)物質(zhì)外，還必須添加________。 (3)如下圖為連續(xù)劃線法示意圖，在圖中________(填圖中序號)區(qū)域更易獲得單菌落。 (4)采用比色測定法(使用苯酚顯色劑)檢測降解后的廢水中苯酚殘留量。先制作系列濃度梯度并進行顯色反應(yīng)，下表中1～5號比色管的苯酚濃度應(yīng)分別為______________。 管號 1 2 3 4 5 6 苯酚濃度/(mg/L) 1 如果廢水為50 mg/L苯酚溶液，降解后約有21%的苯酚殘留，則需將殘留液稀釋________(填序號：①5　②10?、?0)倍后，再進行比色。 解析：(1)酚降解菌培養(yǎng)基中的蛋白胨和苯酚為酚降解菌生長提供碳源。(2)轉(zhuǎn)接的目的之一是富集降解苯酚能力強的酚降解菌，隨轉(zhuǎn)接次數(shù)增多，培養(yǎng)基中的苯酚含量應(yīng)逐漸增加。若平板中菌落過于密集，則需進一步稀釋，降低菌體密度后再涂布培養(yǎng)，以便于菌落分離與計數(shù)。制備平板培養(yǎng)基時，需添加瓊脂等凝固劑。(3)連續(xù)劃線時，在劃線的末端菌體密度最低，即在劃線的末端最易獲得單菌落。(4)1號比色管應(yīng)為空白對照組，由6號比色管中苯酚濃度知，1～5號比色管苯酚濃度應(yīng)為0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L。廢水為50 mg/L苯酚溶液，降解后殘留的苯酚濃度約為5021%＝10.5(mg/L)，則需對殘留液進行20倍稀釋后[10.520＝0.525(mg/L)]，才可以進行比色。 答案：(1)蛋白胨、苯酚　(2)增加　稀釋涂布　凝固劑　(3)③　(4)0、0.2、0.4、0.6、0.8?、? 9．某研究小組研究了不同濃度的抗生素A對大腸桿菌生長的影響，實驗結(jié)果見下圖1?；卮鹣铝邢嚓P(guān)問題： 　　　　　　　　　 圖1　　　　圖2 (1)該培養(yǎng)基為大腸桿菌提供的主要營養(yǎng)物質(zhì)有碳源、水、無機鹽、________四類，而配置該培養(yǎng)基時，通常加入________作為凝固劑。 (2)為了確保利用____________法接種大腸桿菌時，形成一層菌膜，則對菌種的稀釋倍數(shù)________。另外，在培養(yǎng)和接種大腸桿菌時要特別注意進行________操作。根據(jù)實驗結(jié)果，選出對大腸桿菌抑制作用最明顯的抗生素A濃度的依據(jù)是_________________________。 (3)為減少實驗誤差，每一濃度的抗生素A還要制備________________。 (4)該研究小組運用上述實驗方法還研究了相同濃度的a、b、c三種不同抗生素對大腸桿菌生長的影響。請在圖2中用圖表示這一處理方案(可模仿圖1加以必要的注解)。 解析：(1)微生物生長繁殖所需要的四類主要營養(yǎng)物質(zhì)是水、無機鹽、碳源和氮源。該實驗所用的培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基，常用的凝固劑是瓊脂。 (2)圖中接種大腸桿菌時所使用的接種方法是稀釋涂布平板法，為了得到菌膜，稀釋倍數(shù)不能太大。接種和培養(yǎng)大腸桿菌的關(guān)鍵是無菌操作。據(jù)圖1分析，⑤號圓紙片的抑菌圈最大，說明該濃度的抗生素A對大腸桿菌抑制作用最明顯。 (3)為減少實驗誤差，每一濃度的抗生素A還要制備多個圓紙片進行重復(fù)實驗。 (4)該方案的自變量為相同濃度的a、b、c三種不同抗生素，還應(yīng)有空白對照，注意在圖中要標記清楚，具體圖解見答案。 答案：(1)氮源　瓊脂　(2)稀釋涂布平板　不能太大　無菌　透明圈越大，抑制效果越明顯　(3)多個圓紙片　(4)圖示見下圖所示