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課時規(guī)范練36　基因工程 非選擇題 1.(2018全國Ⅱ理綜)某種熒光蛋白(GFP)在紫外光或藍光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光,這一特性可用于檢測細胞中目的基因的表達,某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5末端,獲得了L1-GFP融合基因(簡稱為甲),并將其插入質(zhì)粒P0,構(gòu)建了真核表達載體P1,其部分結(jié)構(gòu)和酶切位點的示意圖如下,圖中E1~E4四種限制酶產(chǎn)生的黏性末端各不相同。 回答下列問題。 (1)據(jù)圖推斷,該團隊在將甲插入質(zhì)粒P0時,使用了兩種限制酶,這兩種酶是　　　　　　,使用這兩種酶進行酶切是為了保證　　　　　　,也是為了保證　　　　　　　　　　。 (2)將P1轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的牛皮膚細胞后,若在該細胞中觀察到了綠色熒光,則說明L1基因在牛的皮膚細胞中完成了　　　　和　　　　過程。 (3)為了獲得含有甲的牛,該團隊需要做的工作包括:將能夠產(chǎn)生綠色熒光細胞的　　　　移入牛的　　　　　　　　中,體外培養(yǎng)、胚胎移植等。 (4)為了檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中,某同學(xué)用PCR方法進行鑒定,在鑒定時應(yīng)分別以該牛不同組織細胞中的　　　　(填“mRNA”“總RNA”或“核DNA”)作為PCR模板。 答案(1)E1和E4　甲的完整　甲與載體正確連接　(2)轉(zhuǎn)錄　翻譯　(3)細胞核　去核卵母細胞　(4)核DNA 解析本題考查基因工程、細胞工程和胚胎工程的相關(guān)內(nèi)容。 (1)由題意可知,E1~E4四種限制酶產(chǎn)生的黏性末端各不相同,將甲(L1-GFP)插入質(zhì)粒時,使用E1和E4兩種限制酶進行酶切,既保證了甲的完整,又防止了甲的自身環(huán)化,保證了甲與載體的正確連接。 (2)將P1轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的牛皮膚細胞后,若在該細胞中觀察到了綠色熒光,則說明該細胞中合成了熒光蛋白,即L1基因在牛皮膚細胞中完成了遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯。 (3)為了獲得含有甲的牛,可通過體細胞核移植技術(shù)、體外培養(yǎng)和胚胎移植來實現(xiàn)。 (4)克隆牛的不同組織細胞中的基因選擇性表達,轉(zhuǎn)錄出的mRNA不同,總RNA也不同,但不同組織細胞中的核DNA相同,因此檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中,用PCR方法進行鑒定時,應(yīng)以核DNA作為模板。 2.P5CS是植物合成脯氨酸的關(guān)鍵酶,脯氨酸有助于植物抵御干旱。下圖是將P5CS基因轉(zhuǎn)入煙草細胞獲得耐旱煙草植株過程的示意圖。 請回答下列問題。 (1)要將P5CS基因成功插入Ti質(zhì)粒中,Ti質(zhì)粒的　　　　　　　　　　　中應(yīng)含有HindⅢ、SalⅠ限制酶切割位點。③過程需在培養(yǎng)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)基中添加　　　　　　　　　　　才能篩選出含P5CS基因的Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌。 (2)檢測P5CS基因是否整合到煙草細胞染色體DNA上,采用　　　　　　　　　　　　　　技術(shù),判斷轉(zhuǎn)基因是否成功,可以直接在個體水平上對轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因植物的　　　　　　　　性進行比較。 (3)將轉(zhuǎn)入P5CS基因的煙草細胞培育成完整的植株需要用　　　　　　　　　　　　　　　技術(shù),愈傷組織通過　　　　　　　　　　　　　　　發(fā)育成完整植株,在此過程中,除營養(yǎng)物質(zhì)外,還必須向培養(yǎng)基中添加　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 答案(1)T-DNA　四環(huán)素　(2)DNA分子雜交　抗旱(耐旱)　(3)植物組織培養(yǎng)　再分化(細胞增殖和分化)　植物激素(生長素和細胞分裂素) 解析(1)質(zhì)粒中的T-DNA又稱為可轉(zhuǎn)移的DNA,可以將攜帶的目的基因轉(zhuǎn)移到受體植物細胞的染色體中去,所以該基因工程要成功,最好將目的基因重組到T-DNA中;因此Ti質(zhì)粒的T-DNA中應(yīng)含有HindⅢ、SalⅠ限制酶切割位點。由于重組質(zhì)粒中含有完整的抗四環(huán)素基因,因此③過程需在培養(yǎng)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)基中添加四環(huán)素才能篩選出含P5CS基因的Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌。(2)檢測目的基因(P5CS基因)是否整合到煙草細胞染色體DNA上,應(yīng)采用DNA分子雜交技術(shù);根據(jù)題意,P5CS是植物合成脯氨酸的關(guān)鍵酶,脯氨酸有助于植物抵御干旱,因此轉(zhuǎn)基因是否成功可以直接在個體水平上對轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性進行比較。(3)將轉(zhuǎn)入目的基因(P5CS基因)的煙草細胞培育成完整的植株需要用植物組織培養(yǎng)技術(shù),愈傷組織通過再分化成完整植株,此過程除營養(yǎng)物質(zhì)外還必須向培養(yǎng)基中添加生長素和細胞分裂素。 3.(2017全國Ⅱ理綜)幾丁質(zhì)是許多真菌細胞壁的重要成分,幾丁質(zhì)酶可催化幾丁質(zhì)水解。通過基因工程將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi),可增強其抗真菌病的能力。回答下列問題。 (1)在進行基因工程操作時,若要從植物體中提取幾丁質(zhì)酶的mRNA,常選用嫩葉而不選用老葉作為實驗材料,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　。提取RNA時,提取液中需添加RNA酶抑制劑,其目的是　　　　　　　　　。 (2)以mRNA為材料可以獲得cDNA,其原理是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 (3)若要使目的基因在受體細胞中表達,需要通過質(zhì)粒載體而不能直接將目的基因?qū)胧荏w細胞,原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出兩點即可)。 (4)當幾丁質(zhì)酶基因和質(zhì)粒載體連接時,DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是　　　　　　　　　。 (5)若獲得的轉(zhuǎn)基因植株(幾丁質(zhì)酶基因已經(jīng)整合到植物的基因組中)抗真菌病的能力沒有提高,根據(jù)中心法則分析,其可能的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。 答案(1)嫩葉組織細胞易破碎　防止RNA降解 (2)在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,以mRNA為模板按照堿基互補配對的原則可以合成cDNA (3)目的基因無復(fù)制原點;目的基因無表達所需啟動子 (4)磷酸二酯鍵 (5)目的基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯異常 解析(1)選取嫩葉為實驗材料提取mRNA的原因是嫩葉細胞的細胞壁易破碎。提取RNA時加入RNA酶抑制劑的目的是防止RNA降解。 (2)以mRNA為材料獲得cDNA的過程為逆轉(zhuǎn)錄,其原理是在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,以mRNA為模板按照堿基互補配對的原則可以合成cDNA。 (3)目的基因無復(fù)制原點,無表達所需的啟動子、終止子等,其不能在受體細胞內(nèi)表達,要使目的基因在受體細胞中表達,需要通過含有這些結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒載體將目的基因?qū)胧荏w細胞。 (4)當幾丁質(zhì)酶基因和質(zhì)粒載體連接時,DNA連接酶催化形成的化學(xué)鍵是磷酸二酯鍵。 (5)如果目的基因已經(jīng)整合到植物的基因組中,但植物未表現(xiàn)出相應(yīng)性狀,可能的原因是目的基因未轉(zhuǎn)錄,或是轉(zhuǎn)錄出的mRNA未翻譯出相應(yīng)的幾丁質(zhì)酶。 4.(2017全國Ⅲ理綜)編碼蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五個片段組成,編碼蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段組成,如圖1所示。 圖1 圖2 回答下列問題。 (1)現(xiàn)要通過基因工程的方法獲得蛋白乙,若在啟動子的下游直接接上編碼蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA),則所構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞后不能翻譯出蛋白乙,原因是 　。 (2)某同學(xué)在用PCR技術(shù)獲取DNA片段B或D的過程中,在PCR反應(yīng)體系中加入了DNA聚合酶、引物等,還加入了序列甲作為　　　　,加入了　　　　作為合成DNA的原料。 (3)現(xiàn)通過基因工程方法獲得了甲、乙、丙三種蛋白,要鑒定這三種蛋白是否具有刺激T淋巴細胞增殖的作用,某同學(xué)做了如下實驗:將一定量的含T淋巴細胞的培養(yǎng)液平均分成四組,其中三組分別加入等量的蛋白甲、乙、丙,另一組作為對照,培養(yǎng)并定期檢測T淋巴細胞濃度,結(jié)果如圖2。 ①由圖2 可知:當細胞濃度達到a時,添加蛋白乙的培養(yǎng)液中T淋巴細胞濃度不再增加,此時若要使T淋巴細胞繼續(xù)增殖,可采用的方法是　。 細胞培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)箱中通常要維持一定的CO2濃度,CO2的作用是　。 ②僅根據(jù)圖1、圖2可知,上述甲、乙、丙三種蛋白中,若缺少　　　(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所編碼的肽段,則會降低其刺激T淋巴細胞增殖的效果。 答案(1)編碼乙的DNA序列起始端無ATG,轉(zhuǎn)錄出的mRNA無起始密碼子 (2)模板　dNTP (3)①進行細胞傳代培養(yǎng)　維持培養(yǎng)液的pH　②C 解析(1)由基因乙的堿基序列可知,由該序列轉(zhuǎn)錄出的mRNA無起始密碼子,所以在啟動子的下游直接接上編碼蛋白乙的DNA序列后,所構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞后不能翻譯出蛋白乙。(2)PCR反應(yīng)體系中除了加入了DNA聚合酶、引物等,還應(yīng)加入序列甲作為模板,加入四種脫氧核苷酸(dNTP)作為合成DNA的原料。(3)當細胞濃度達到a時,T淋巴細胞的濃度不再增加,是因為出現(xiàn)了接觸抑制現(xiàn)象,所以可以進行細胞傳代培養(yǎng),使T淋巴細胞繼續(xù)增殖;培養(yǎng)箱中通常要維持一定的CO2濃度,CO2的作用是維持培養(yǎng)液中的pH。根據(jù)圖2可知,甲、乙兩組的T淋巴細胞數(shù)量多,丙組的T淋巴細胞數(shù)量少,根據(jù)圖1比較可知,丙組T淋巴細胞少的原因是蛋白丙缺少C片段所編碼的肽段。 5.科學(xué)家將魚抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)入番茄,使番茄的耐寒能力大大提高。圖一是轉(zhuǎn)基因抗凍番茄培育過程的示意圖,圖二為質(zhì)粒限制酶酶切圖譜。魚的抗凍蛋白基因不含圖中限制酶識別序列,Ampr為抗氨芐青霉素基因,其中①~④是轉(zhuǎn)基因抗凍番茄培育過程中的相關(guān)步驟,Ⅰ、Ⅱ表示相關(guān)結(jié)構(gòu)或細胞。請據(jù)圖作答。 圖一 圖二 (1)獲取魚的抗凍蛋白基因的途徑主要有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。為了在番茄中獲得抗凍蛋白必須將抗凍蛋白基因連接在質(zhì)粒中的　　　　　　　之后。圖中③④依次表示組織培養(yǎng)過程中番茄組織細胞的　　　　　　　　　　　　　　　　過程。 (2)在構(gòu)建基因表達載體時,可用一種或者多種限制酶進行切割。該酶的特點是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。在此實例中,應(yīng)該選用限制酶　　　　　　　　 　　　　　切割。 (3)要利用培養(yǎng)基篩選出已導(dǎo)入含魚的抗凍蛋白基因的番茄細胞,應(yīng)使基因表達載體Ⅰ中含有　　　　　　　　　　　　　　　　　作為標記基因。 (4)研究人員通常采用　　　　　　　　　　法將魚抗凍蛋白基因?qū)敕鸭毎麅?nèi)。通常采用　　　　　　　　　　　　技術(shù),在分子水平檢測目的基因是否翻譯形成了相應(yīng)的蛋白質(zhì)。 答案(1)從體細胞中分離和化學(xué)方法人工合成　啟動子　脫分化、再分化 (2)識別特定的DNA序列并在特定位點切割　Nde Ⅰ、BamH Ⅰ (3)抗氨芐青霉素基因(Ampr) (4)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化(或基因槍法等)　抗原—抗體雜交 解析(1)獲取目的基因的主要途徑有從體細胞中分離和化學(xué)方法人工合成;構(gòu)建基因表達載體時,必須將目的基因插入啟動子之后;分析題圖可知,圖中③為脫分化過程,形成愈傷組織,④為再分化過程,形成胚狀體。 (2)限制酶的作用特點是能識別特定的DNA序列并在特定位點切割DNA分子;分析題圖可知,啟動子和終止子之間有三個限制酶位點:NdeⅠ、XbaⅠ、BamHⅠ,其中質(zhì)粒中的XbaⅠ酶切位點有兩個,會把終止子切掉,因此不能用XbaⅠ進行切割,而NdeⅠ、BamHⅠ的位點都只有一個,因此最好用NdeⅠ、BamHⅠ兩種限制酶進行切割,可以防止目的基因插入時出現(xiàn)反向連接。 (3)分析題圖,Ampr為抗氨芐青霉素基因,為標記基因,可以用于目的基因的檢測與鑒定。 (4)把目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ㄗ畛Ｒ姷氖寝r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法;檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)的方法是抗原—抗體雜交技術(shù)。 6.(2018天津理綜)甲型流感病毒為RNA病毒,易引起流感大規(guī)模流行。我國科學(xué)家在2017年發(fā)明了一種制備該病毒活疫苗的新方法,主要環(huán)節(jié)如下。 (1)改造病毒的部分基因,使其失去在正常宿主細胞內(nèi)的增殖能力。以病毒RNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄成對應(yīng)DNA后,利用　　　技術(shù)擴增,并將其中某些基因(不包括表面抗原基因)內(nèi)個別編碼氨基酸的序列替換成編碼終止密碼子的序列。與改造前的基因相比,改造后的基因表達時不能合成完整長度的　　　　,因此不能產(chǎn)生子代病毒。將該改造基因、表面抗原等其他基因分別構(gòu)建重組質(zhì)粒,并保存。 (2)構(gòu)建適合改造病毒增殖的轉(zhuǎn)基因宿主細胞。設(shè)計合成一種特殊tRNA的基因,其產(chǎn)物的反密碼子能與(1)中的終止密碼子配對結(jié)合,并可攜帶一個非天然氨基酸(Uaa)。將該基因與　　　　　　連接后導(dǎo)入宿主細胞。提取宿主細胞的　　　　　　　進行分子雜交鑒定,篩選獲得成功表達上述tRNA的轉(zhuǎn)基因宿主細胞。 (3)利用轉(zhuǎn)基因宿主細胞制備疫苗。將(1)中的重組質(zhì)粒導(dǎo)入(2)中的轉(zhuǎn)基因宿主細胞,并在補加　　　　　　　　　　　　　　的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),則該宿主細胞能利用上述特殊tRNA,翻譯出改造病毒基因的完整蛋白,產(chǎn)生大量子代病毒,用于制備疫苗。 特殊tRNA基因轉(zhuǎn)錄時,識別其啟動子的酶是　　　(單選)。 A.病毒的DNA聚合酶 B.宿主的DNA聚合酶 C.病毒的RNA聚合酶 D.宿主的RNA聚合酶 (4)上述子代病毒不能在正常宿主細胞中增殖,沒有致病性,因此不經(jīng)滅活或減毒即可制成疫苗。與不具侵染性的流感病毒滅活疫苗相比,該病毒活疫苗的優(yōu)勢之一是可引起　　　　免疫,增強免疫保護效果。 答案(1)PCR　多肽(或蛋白質(zhì))　(2)載體　總RNA　(3)非天然氨基酸(Uaa)　D　(4)細胞 解析本題考查基因工程、基因表達、免疫等知識。 (1)利用逆轉(zhuǎn)錄得到病毒DNA后,可利用PCR技術(shù)對該DNA進行擴增。據(jù)題意,改造后的某些基因在表達時會提前終止,不能合成改造前完整長度的多肽或蛋白質(zhì)。(2)導(dǎo)入宿主細胞的是攜帶目的基因的載體,故需將該特殊基因與載體連接。該特殊基因的表達產(chǎn)物是攜帶Uaa的tRNA,故檢測該基因是否表達時可提取宿主細胞的總RNA進行分子雜交。(3)(1)中改造基因表達時,因終止密碼子提前出現(xiàn),無法合成子代病毒的蛋白質(zhì)而不能產(chǎn)生子代病毒。經(jīng)過(2)改造的宿主細胞,在基因表達遇到終止密碼子時,因有特殊的攜帶Uaa的tRNA與之結(jié)合,故可繼續(xù)完成翻譯表達出完整蛋白?？僧a(chǎn)生子代病毒用于制備疫苗。與正常培養(yǎng)基相比,(3)中所用培養(yǎng)基需補加Uaa以完成翻譯。特殊tRNA基因轉(zhuǎn)錄形成RNA,所需的酶是宿主細胞的RNA聚合酶。(4)因正常宿主細胞不含特殊tRNA基因,也無Uaa,故子代病毒侵入正常細胞后,無法合成病毒蛋白質(zhì),不能表現(xiàn)出致病性。該病毒與不具侵染性的流感疫苗相比,因其還可侵入體細胞,故除引起體液免疫外,還可引起細胞免疫。