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1國家市場監(jiān)督管理總局中國國家標準化管理委員會ICS 07.080A 21中 華 人 民 共 和 國 國 家 標 準GB/T XXXXX—201X 微生物誘變育種致遺傳物質損傷強度檢測FACS-umu 測試法Quantification of microbial DNA damage caused by mutagenesisFACS-umu-test（征求意見稿）201X-XX-XX 發(fā)布 201X-XX-XX 實施發(fā) 布發(fā) 布GB/T ××××—201× 前 言本標準按照 GB/T 1.1—2009 給出的規(guī)則起草。本標準由中國標準化研究院提出并歸口。本標準起草單位： 本標準主要起草人： GB/T ××××—201×1微生物誘變育種致遺傳物質損傷強度測定 umu法1 范圍本標準規(guī)定了微生物誘變育種致遺傳物質損傷強度測定 umu 法的原理、試劑或材料、儀器設備、測定步驟和結果分析。本標準適用于物理誘變源和化學誘變源造成的微生物遺傳物質損傷測定。2 規(guī)范性引用文件 GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法YY/T 0588 流式細胞儀3 術語與定義下列術語和定義適用于本文件。3.1 誘變 mutagenesis通過人為的措施誘導遺傳基因產(chǎn)生變異的過程。注：常用的誘變方法包括物理誘變和化學誘變等。3.2 遺傳物質損傷 DNA damage化學或物理誘變源對遺傳物質分子結構的改變。3.2 遺傳物質損傷強度 DNA damage strength當細胞受到 DNA 損傷時會發(fā)生應急修復（SOS 修復） ，使其以突變?yōu)榇鷥r繼續(xù)存活下去。4 原理在 DNA 發(fā)生損傷時，細菌通過 lexA 和 recA 的共同作用，引起體內(nèi)的 SOS 響應。DNA 損傷程度越高，SOS 響應越強。通過將 SOS 系統(tǒng)調(diào)控基因與指示基因相融合，檢測指示基因編碼蛋白活性或信號強度，即可得到 SOS 基因的表達強度，表征 DNA 損傷強度和環(huán)境致癌物質濃度。在 umu 測試中，將編碼 DNA 聚合酶 V 中重要組分的 umuC 基因與編碼 β-半乳糖苷酶的 lacZ 基因融合，導入到Salmonella typhimurium 中，通過顯色法檢測 β-半乳糖苷酶活性來測定 SOS 誘導強度。然而，由于誘變過程會造成細胞的死亡，死細胞會對測試誘變損傷能力的評估造成影響。為排除這一影響，F(xiàn)ACS-umu 測試方法利用流式細胞分選技術測定活細胞遺傳物質損傷強度，其測試原理為：熒光素-2-β-D-半乳糖苷（FDG ）本身不具有熒光，其被 β-半乳糖苷酶水解后的產(chǎn)物熒光素具有熒光。碘化丙啶GB/T ××××—201×2（Propidium iodide，PI）是一種 DNA 熒光染料，只能進入失去細胞膜選擇通透性的細胞，即死細胞中，因此可以用于區(qū)分活死細胞。采用 FDG 作為 β-半乳糖苷酶的熒光底物，利用 PI 作為死細胞染料，通過采用流式細胞儀測定誘變后活細胞的 β-半乳糖苷酶活性，從而得到活細胞的 DNA 損傷強度。5 試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。5.1 水：GB/T6682二級。5.2 菌種：鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium），包含表達 umuC’-’lacZ 基因和氨芐青霉素抗性基因的 pSK1002 質粒。5.3 TGA 培養(yǎng)基稱取胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，HEPES 11.9 g，加入980 ml 水溶解，pH調(diào)整為7.0 ± 0.2，定溶到1000 ml。121℃，15 min高壓滅菌。溶解2g葡萄糖在20ml去離子水中單獨滅菌。滅菌后按等比例混合兩個溶液，無菌條件下每升冷卻的TGA培養(yǎng)基中加入50mg 氨芐青霉素。改溶液可以在-20℃保存4周。5.4 10×TGA培養(yǎng)基包含10倍濃度的TGA溶液，可以在4℃保存14天。5.5 熒光素-2-β- D-吡喃半乳糖苷（ Fluorescein di-β-D-galactopyranoside，F(xiàn)DG）溶液在10 ml含體積比為1% DMSO和1%乙醇的水中溶解13.13 mgFDG，F(xiàn)DG終濃度為2mM，分裝后保存在-20℃冰箱中。使用前在37 ℃預熱15 min以上。5.6 碘化丙啶（Propidium iodide，PI）溶液在10 mlPBS溶液中溶解6.68 mgPI，配成濃度為1mM的PI溶液。用移液槍吸取10 ul濃度為1 mM的PI儲備液，溶于10 mlPBS溶液中，配成濃度1 uM的PI溶液，作為PI工作液。于4℃保存，使用前在冰上放置預冷。6 儀器設備6.1 恒溫水浴鍋（37±1）℃；6.2 pH 計；0.1；6.3 電子天平；0.01；6.4 高速離心機；6.5 流式細胞儀；6.6 恒溫震蕩搖床，溫度可實現(xiàn)（28±1）℃和（37±1）℃，轉速在 125r/min 到 150r/min；7 測定步驟GB/T ××××—201×37.1 測試菌過夜培養(yǎng)物制備在三角瓶中裝入2 0ml TGA培養(yǎng)基用透氣無菌瓶塞封口，滅菌儲存；融化凍存的測試菌，在凍存管中加入1 ml TGA培養(yǎng)基，3 000 g離心凍存管中的測試菌10 min，丟棄上清液，用1 mLTGA培養(yǎng)基重懸測試菌，用0.5 ml測試菌重懸液接種到含TGA培養(yǎng)基的三角瓶中，在（37±1）℃搖動培養(yǎng)過夜（不超過12 h）。7.2 誘變測試微生物樣品制備用新鮮的TGA培養(yǎng)基（37℃）將過夜培養(yǎng)的測試菌稀釋10倍。繼續(xù)在37±1）℃搖動培養(yǎng)1.5天。在（600±20）nm用1 cm比色皿檢測光密度，以TGA培養(yǎng)基作為空白對照，誘變測試微生物樣品應處于對數(shù)生長期。7.3 誘變7.3.1 化學誘變根據(jù)測試需求，宜通過文獻等資料或設置預實驗，確定化學誘變劑的種類和濃度。將10 ul不同濃度的化學誘變劑加入到1 ml誘變樣品（9.2 ）中，置于1.5 ml的EP管，在37±1℃，200 r/min震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。對照為在1ml TGA培養(yǎng)基中加入10ul DMSO。7.3.2 物理誘變根據(jù)測試需求，宜通過文獻等資料或設置預實驗，確定物理誘變條件。取100 ul 接種物（9.2）進行物理誘變處理，對照為沒有進行物理誘變處理的樣品。處理后的樣品和對照轉移到1.5 ml EP管中，在 37±1℃，200 r/min震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2 h。7.4 FDG和PI染色取化學或物理誘變后的測試樣品50 ?l置于1.5 ml的EP 管中，在37 ℃預熱5 min，加入37 ℃預熱的FDG溶液 50 ul，迅速溫和混勻后，置于 37 ℃水浴中2 min，使FDG滲透進入細胞。之后迅速加入500 ?l的PI溶液，將混合液放置于冰上反應1 h，在進行流式細胞測定前一直置于冰上。7.5 流式細胞儀測定使用流式細胞儀對染色后樣品進行流式分析。采用激發(fā)波長為488 nm，對于FDG水解產(chǎn)物熒光素的熒光強度測定接收波長為525±30 nm （FL-1通道），PI 染色熒光測定接收波長為670 nm （FL-2通道）。測定細胞總數(shù)為5000到10000個細胞。8 結果分析8.1 閾值設定通過前向角散射光FSC和側向角散射光SSC圈出目標菌體，以去除多細胞粘連對結果的影響。通過單獨的PI 染色，測定FL-1通道和FL-2通道的熒光值，其FL-1通道熒光值作為背景值，即為FDG染色GB/T ××××—201×4陰性細胞。通過單獨的FDG染色，測定FL-1通道和FL-2通道的熒光值，其FL-2通道熒光值作為背景值，即為PI染色陰性細胞。對于FDG和PI同時染色的樣品，選取FDG染色和PI染色陽性為目標細胞群，用于后續(xù)數(shù)據(jù)處理。8.2 結果計算按照式（1）進行計算：……………………………………………………………（1）????=????/????式中：Fi——SOS誘導系數(shù)；Am——誘變源處理樣品的平均FDG水解產(chǎn)物熒光素相對熒光值；Ac——對照樣品的平均FDG水解產(chǎn)物熒光素相對熒光值。_________________________________