高度靈敏，高度可重復的激光誘導熒光檢測系統(tǒng)摘要本研究，我們已經(jīng)開發(fā)出一種新型激光誘導熒光檢測（LIF）系統(tǒng)，這是特別好，比如在毛細管電泳和微芯片為基礎的分離和微反應器裝置，如微流體過程測量的理想選擇。為了獲得高性能的系統(tǒng)，我們作為測量探頭以及一個物鏡致動器是在一個光軸的垂直和水平方向振搗根據(jù)一個簡單的方法，市售的光學讀取頭。我們的系統(tǒng)優(yōu)于傳統(tǒng)的系統(tǒng)，因為它具有高靈敏度和高重復性，它可以在不復雜，昂貴的高精密組件和檢測探頭定位裝置實施。關鍵詞：激光誘導熒光檢測，激光頭，音圈電機，振動的方法，無需微調(diào)，靈敏度高，重現(xiàn)性高，成本低，結構緊湊，微流體設備。1 引言最近，使用小芯片生化分析性能吸引了比傳統(tǒng)的系統(tǒng)，因為它的許多優(yōu)點相當?shù)闹匾?。該芯片最具吸引力的特點是它的體積小。它的使用，確保反應快速，高效分離，減少了樣品和分析所需的試劑可觀。由于這種出色的功能，芯片也吸引了諸如環(huán)境監(jiān)測，生命科學和醫(yī)療保健領域相當重視，因為在這些領域中使用的分析樣品的數(shù)量相當小[1,2]。但是，這些芯片體積小，同時要求非常高的檢測靈敏度。 1 0957-0233/08/085404 10 $之間在微流體器件測量用于檢測計劃的不同類型的 30.00，激光誘導熒光（LIF）方法被認為是最敏感的方法[3-5 J.目前，有各種 LIF 系統(tǒng)可供選擇，包括一個單分子在液體中的敏感性LIF 顯微鏡。但是，它是非常困難的發(fā)展離不開一個快速的檢測靈敏度下降，小型和廉價的 LIF 系統(tǒng)。 ? 2008 IOP 出版印刷有限公司在英國的實際執(zhí)行，特別是在諸如醫(yī)療實驗室免疫分析技術，測試芯片必須是一次性使用的芯片。可以有兩種類型的 LIF 系統(tǒng)，一個系統(tǒng)，一個設備和一個集成芯片熒光檢測系統(tǒng)組成（“綜合型” ）[6]或微芯片和檢測系統(tǒng)（“分離式” ） 。后者的制度，如一次性使用的試紙，并使用自動化實驗室設備，保證了便于分析實現(xiàn)的簡單處理的技術優(yōu)勢。然而，在“分離式”系統(tǒng)，就很難保持相同的芯片之間以及與不同的芯片檢測系統(tǒng)測量的相對位置，這會導致大量的實驗誤差。在傳統(tǒng)的方法，高精度掃描階段是必要的，以便調(diào)整之間的芯片和檢測探頭適當?shù)南鄬ξ恢?。這一要求導致非常昂貴，大，重型設備。這種情況也使得它很難投入實際使用這個系統(tǒng)。因此有必要開發(fā)一種廉價和緊湊的系統(tǒng)，有一個簡單的機制和高靈敏度和高重復性。為了達到這個目的，我們開發(fā)了具有高靈敏度和高重復性相對便宜，緊湊的 LIF 系統(tǒng)。我們的系統(tǒng)使用了高數(shù)字化 1 光圈鏡頭作為測量探頭市售的激光頭。此外，物鏡致動器是使用，它是在沿光軸的垂直和水平方向振動駕駛在適當?shù)念l率，同時用一個簡單的方法方向的執(zhí)行機構。例如，如果我們應用在微流體器件測量我們的系統(tǒng)中，光束焦點將移動在垂直和水平方向，然后掃描整個二維的微節(jié)在高速設備。因此，人們可以看到，測量結果可以用高靈敏度，高重復性和無之間的采樣位置，芯片和檢測頭微調(diào)獲得。因此，我們的微分析系統(tǒng)具有較高的性能，成本和空間效益。圖 1 設計試驗裝置：（一）頂視圖和（b）側視圖。2 系統(tǒng)描述2.1。微流體測試裝置在本節(jié)中，我們描述了微流體裝置，是用來評估我們系統(tǒng)的性能。大多數(shù)微流體器件制作在玻璃或硅。然而，許多是在聚合物基微流體器件的研究，目前正專注于寶 1 vdimethyl 氧化硅甲烷（PDMS） ，由于其成本低，易于操作。此外，一些研究報告 PDMS 為基礎的微流體裝置[7-9]，PDMS 是光學透明的波長范圍從 235 運行到近紅外范圍內(nèi)，因此在整個可見光區(qū)的光學檢測是可能的。 PDMS 的自體熒光也低比其他聚合物。該測試設備制造過程的基礎上，PDMS [11-14]副本成型技術。我們將這個過程解釋下。首先，為微流體設備主是發(fā)達國家使用標準光刻和濕法化學蝕刻技術：（1）通道的設計是由使用 Adobe Illustrator 10.0.3，然后印在透明薄膜是用作遮罩了。一個積極的光致抗蝕劑薄層（。PMER P - RZ300：東京Ohka 工業(yè)株式會社，日本神奈川縣）是在空白面具板（Cr/CrQ2，50 納米; ULVAC 設備銷售公司，日本東京。 ）表面涂層旋和隨后暴露于長波的長度約 2 UL通過與載玻片對準透明度分鐘 traviolet 燈。 （2）取得 20 / XM 厚的微結構，光致抗蝕劑被允許發(fā)展中的顯影液（PMER P - 1S;東京 Ohka 興業(yè)）的另外 2 分鐘。與渠道設計模板進一步烘烤在 85 15 熱板，以加強粘連分鐘 C 和隨后逐漸冷卻 1-2 小時至室溫在這個過程中，所有的光阻去除除了抵制在定義的渠道領域。 （3）為了確保順利脫模，玻璃幻燈片在 17％W / V 鈰（IV）二銨硝酸溶液中去除暴露鍍鉻層。漂洗后在 2 M HNO：“一個有大約 20 FTM 通道高度掌握被蝕刻在 1 M NH4F/IM HF 25 分鐘在 25℃下獲得解決方案的玻璃，在 PDMS 芯片成型對主。 （四）PDMS 預聚物溶液（Sylgard ? 184：道康寧東麗有限公司，東京，日本）澆到主用持有的解決方案框架。 （5）它是固化在烤箱在 65℃1 h 后在 100 秒 1 發(fā)彗星治愈之后。 （6）固化后的 PDMS 芯片去皮 O ：玻璃的主人，并用直徑 1.6 主席訪問孔分別到芯片打了個使用金屬管。 （7）PDMS 芯片是不可逆的鍵合 1.2 毫米等離子氧治療兩個表面厚玻璃板，然后才接觸到[9]提出。隨后硅管插入孔的訪問和 PDMS 粘。圖 2 顯示了制造測試設備。mmJL圖 2 外觀的制造測試設備。2.2．光學檢測系統(tǒng)現(xiàn)在，我們詳細解釋了光學檢測部分。對我們 LIF 系統(tǒng)原理圖描述如圖 3所示。為熒光激發(fā)光源是連續(xù) Nd：YAG 倍頻帶的 532 NRN（= AI） ，一個光束直徑為 1.2 毫米，9.75 毫瓦的輸出功率為 1％，保證功率穩(wěn)定波長的激光。在帶寬峰峰值噪聲從 DE 到 50 兆赫不超過 0.1％（MSL - 532，長春新產(chǎn)業(yè)。中國） 。激發(fā)光束穿過 25％的中性密度（ND）濾鏡（輸出功率為 2.43 毫瓦） ，并通過微型電磁機械切碎活塞行程為 5 mm（PI 105A，TDK 公司，日本東京） ，其中弧要避免熒光光漂白的樣品?；钊畲蟮臄夭l率為 60 赫茲。光束經(jīng)過束分離器和一個 1 / 4 波長板。它是那么反射前被轉移了 0.45 數(shù)值孔徑 NA（傳出）和焦距為 3.17 毫米/一個光頭物鏡二色鏡。梁，然后集中到一個小點，并預計到樣品。梁力之三值自動對焦鏡頭，通過客觀的逝世是 1.87 兆瓦，光斑大小為0.97 /。英里。一個樣品架，這是作為一個為測試設備定位指南中使用，是擺在上面的光學檢測部分物鏡。步進電機是安裝在持有人方和測試設備，它是在持有人設定，定位精度為 40 ?，在水平（X）的方向和 20 ° IM 在垂直（Z）IM 方向穿過通道。對于多通道測量，渠道之間的測試設備和物鏡驅(qū)動器中的無梁運動的立場是大約 1.51 毫米。聚焦光吸收和排放，從在一個較長的波長（= ^ 2）根據(jù)斯托克斯位移樣品熒光光了。這種熒光收集的一個有 0.60（遷入）NA 皮卡物鏡。在光錐可以用此物鏡收集 10.0 的總 4tt 立體角％，在假設發(fā)射光子輻射四面八方。下面的兩色鏡子，反映了 550 萬（= ^ 3）波長的光并傳送超過這個波長的光，從而只傳輸一個熒光光譜。接下來，光線過濾再次使用的排放過濾器，即一個帶通濾波器，只傳輸?shù)臒晒獍l(fā)射波長，檢測使用光電倍增管（PMT R6355; Hamamat.su 光子學株式會社，日本靜岡縣） 。在輸出路徑，一個自制的圓錐型為 2 毫米 x 4 毫米口徑光學擋板組裝，以減少在沿 X - direetion 流浪檢測的反射和散射的結果是自動控制步進在 5 毫米間隔馬達，最大速度為 20 毫米的“1。地面之間的工作距離板底部的重復執(zhí)行，并為每個通道中的所有周期的最高值的平均值作為最后的考慮測得的該通道的熒光信號值，應該指出的是，它有可能實現(xiàn)高通量的測量，因為數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析在測量過程中的往復循環(huán)執(zhí)行，在下一節(jié)中，它是觀察到的振動方法中起著重要的作用。圖 3 對我們 LIF 系統(tǒng)原理圖描述光學拾音圖 5。 開環(huán)的光學拾音物鏡致動器的動態(tài)響應特性：（一）轉讓為特征的重點方向和（b）轉移軌道的方向特性。頻率[Hz]聚焦至于執(zhí)行測量準備，第一，在物鏡致動器掃描范圍應設置檢測之間的通道要解決和玻璃板或 PDMS 蓋板的界限。之間的空白溶液和玻璃地面板或空白溶液和 PDMS 蓋板的重點方向邊界可以由 astigmatieally 檢測的重點錯誤信號 S 形曲線。之間的空白溶液和 PDMS 蓋板的軌道方向邊界可以由監(jiān)察沿地面之間的玻璃板塊與板塊邊界 PDMS 蓋反射信號的強度。因此，通過執(zhí)行此操作，可以設置在兩個軌道的重點和方向的 VCM 掃描范圍。雖然這一邊界檢測預掃描步驟是在情況下的深度和寬度的微不明有效的，它不一定需要我們的實驗，因為深度和微通道寬度是已知的，和（40 ?精度粗糙調(diào)整 IM 和 20 / X 和 Zdirections，分別和± 20 /雙向 IM 準確性 IM）已經(jīng)完成用步進電機的樣品架。因此，VCM運動范圍可以預先設定，以涵蓋所有具有足夠余量的 mierochannels 二維部分。我們采用以下方法進行振動。這種方法特別適合于微芯片為基礎的測量。在這項研究中，我們使用高精度，同步掃描三角信號，從積極的 V \以適當?shù)念l率，在焦點（Z）和跟蹤（X）方向負 V2。該信號的頻率決定的基礎上，條件是為 Z 方向(=/])振動頻率高于對 X 方向(=/:).在我們的系統(tǒng)中，信號是由一個 DA 轉換器，以 4 MHz 采樣率 16 位分辨率與來自控制單元的輸出數(shù)據(jù)進行。因此，VCM 沿 X 方向移動物鏡反復掃描，而它沿同步 Zdirection 振動。作為一個結果，光斑掃描的mierochannels 整個二維高速移動的光束的焦點部分。在此測量過程中，最大測量中的每個 Z 方向往復運動值由實時采集使用控制單元的數(shù)據(jù)分析。同樣的程序執(zhí)行為 X 方向同時具有較低的振動頻率。的往復循環(huán)，然后實現(xiàn)高通量的測量，因為數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析在測量過程中的往復循環(huán)執(zhí)行。在下一節(jié)中，我們可以觀察到的振動方法中起著重要的作用，改善測量靈敏度和重現(xiàn)性不執(zhí)行之間的 microchanncls 和我們 LIF 系統(tǒng)的檢測探頭的相對位置進行微調(diào)。3 實驗部分3.1。測量過程概要在測量過程中，我們應用我們的大綱 LIF 系統(tǒng)的微流體測試裝置在 2.1 節(jié)中所述，從而評估了我們的系統(tǒng)性能。作為評價樣本，我們使用 Resorufin。它被廣泛使用，直接或間接地為與吸收和熒光發(fā)射最大值 563 nm 和 587 nm 的熒光蛋白質(zhì)標記 DVE 分別。與 Resorufin 不同濃度樣品溶液制備稀釋用 0.1 M磷酸緩沖液，pH 7.4（1:1，V / V）混合，然后添加到系統(tǒng)的樣本庫。該試驗裝置被放置在樣品架，這是放在高于 LIF 系統(tǒng)物鏡（圖 3 右）約 1.51 毫米。該設備被連接到由 PEEK 管注射泵和樣品溶液泵在 20 流量/ IL 分鐘“從 1 到每個通道的水庫，流速穩(wěn)定性為± 0.1％，然后在熒光信號綁定到流通渠道，測定樣品溶液的 LIF 使用振動的方法在 2.3 節(jié)中描述的系統(tǒng)。在測量過程中，對流通渠道之間的連續(xù)梁的運動是由步進電機進行了 20 毫米的速度上線由控制單元，因此多渠道在測試設備的樣品進行了測量命令的基礎上很快在我們的實驗中，我們設定 V \ - 0.5 V，V2 = -0.5 V，/ J = 400 Hz 和/ 2 = 40 Hz 的考慮，測試設備是與 40 庵在 X 方向和 20 / . .在 Z 方向定位精度 IM 的檢測到的卷的最大數(shù)量，由物鏡的數(shù)值孔徑?jīng)Q定束腰的大小和通道距離計算約為 400 PL，這種小批量的檢測，是本系統(tǒng)的優(yōu)良特性之一。3.2 重復性的改善首先，我們評估在因之間的微芯片和光學檢測探頭的相對位置誤差熒光信號的測量值的變化。由于激光光斑尺寸很小，彼此之間的通道和物鏡的相對位置已經(jīng)對輸出信號的強度，因此對測量結果有相當?shù)挠绊懥Αy量結果均用五種不同的芯片和一個 1.0 × 10“7 M Resorufin 的解決方案。為了比較的目的，勢必流道 1 Resorufin 熒光信號的解決方案都是為當物鏡固定在測量的情況下初始位置和目標時的鏡頭是在/ I = 400 Hz 和/ 2 = 40 赫茲（實驗 1） 。頻率振動情況，那么，綁定到所有五個渠道 Resorufin 解決方案的熒光信號進行測量移動沿 X 方向的芯片，以評估之間的通道（實驗 2）的變化，在這些實驗中，十進行測量每個實驗采取的芯片和每個芯片之間的通道束的運動了沿 X 方向是自動控制在 5.0 毫米的步進電機的間隔，應該指出的是，每個芯片是由人的手在采樣安裝，結果如圖 6 所示（實驗 1）8 網(wǎng)圖 7（實驗 2）從圖 6（a）可以看出，在測量值的變化是大的物鏡時是固定的，即使是初步優(yōu)化，它有時會出現(xiàn)所觀察到的，通過把信號變得很弱微芯片和縮小，也就是說，重點不交 3。實驗部分 3.1 測量過程我們采用的 LIF 系統(tǒng)的微流體測試裝置在 2.1 節(jié)中所述，從而評估了我們的系統(tǒng)性能大綱，作為一種評價樣本中，我們使用Resorufin，因而被廣泛使用，直接或間接地為與吸收和熒光發(fā)射最大值 563 nm 和 587 nm 的熒光蛋白質(zhì)標記 DVE，分別與不同濃度的 Resorufin 樣品溶液是由串行準備用 0.1 M 磷酸緩沖液，pH 值 7.4（1:1 ，V / V）混合，然后稀釋添加到樣品庫系統(tǒng)，測試設備是在樣品架，它被放在上面放置約 1.51 毫米物鏡的LIF 系統(tǒng)（圖 3 右） 。設備被連接到由 PEEK 管注射泵和樣品溶液泵在 20 流量/ IL 分鐘“，從水庫到每個通道 1。流速穩(wěn)定性為± 0.1％。然后，必將對流通渠道的樣品溶液的熒光信號進行測量振動的 LIF 使用方法在 2.3 節(jié)中描述的系統(tǒng)。在測量過程中，對流通渠道之間的連續(xù)梁的運動是由步進電機進行了有關命令，由控制單元的基礎上速度為 20 毫米 s 和因此多通道測量在測試設備的樣本表現(xiàn)非常迅速。在我們的實驗中，我們設定 V \ - 0.5 V，V2 = -0.5 V，/ J = 400 Hz 和/ 2 = 40 Hz 的考慮，測試設備是與 40 庵在 X 方向和 20 /精密定位，IM 在 Z 方向。對檢測到的卷的最大數(shù)量，由物鏡束腰尺寸和數(shù)值孔徑的通道距離確定計算約為 400 PL。這種小批量的檢測，是本系統(tǒng)的優(yōu)良特性之一。3.3.測量結果接下來，我們顯示了我們的 LIF 檢測系統(tǒng)特性的測量結果。該測量均對不同濃度的 Resorufin 解決方案。該 LIF 系統(tǒng)響應 Resorufin 不同濃度見圖 8。我們可以觀察到的 Resorufin 響應曲線覆蓋超過四個數(shù)量級，并在測量線性范圍 0.1 - 100 納米。而測量精度為 0.99 K2 超過了便攜式測量儀器的標準值0.95。測量時間，不計時間收拾在 PDMS microehannel 樣品溶液，只需不到 10秒。檢測限約為 800 分在 3 信號的信噪比。絕對的樣品檢出量為約 320 zmol，從樣本估計雖然在 Resorufin 響應曲線的測量，得到來自五個不同的渠道和五個不同的芯片，在這個范圍內(nèi) RSD 值表示的重復性非常好：1.4 不同渠道和芯片至芯片測量，在測量進行十次（N - 10）2.1％的單芯片測量％。結果更令人印象深刻的考慮，每個芯片為 F abricated 單獨和每個芯片是手工安裝在實驗裝置。因此，我們的系統(tǒng)可以分析具有高靈敏度和振動不定位 microehannel 恰恰是一個光頭物鏡高重復性的樣品溶液。因此，我們開發(fā)了一個相對較小的高性能和廉價的分析系統(tǒng)。我們的系統(tǒng)可以方便地實現(xiàn)實際，特別是在醫(yī)學實驗室等，其中的測試芯片必須是一次性使用的芯片，即免疫分析技術，該系統(tǒng)包括一個一次性芯片和光學檢測系統(tǒng)。在這些“分離式”系統(tǒng)，它是難以執(zhí)行高重復性由于在芯片之間和不同的測量檢測探頭位置誤差高度敏感的測量。這意味著我們的 LIF 系統(tǒng)非常適合的“分離式”系統(tǒng)，因為它可以提供成本，時間和空間，有效的測量和高性能由于簡化測量過程與激光頭的使用。這也是必要的?？紤]的 effect.of.，色分散在我們的光學系統(tǒng)。我們的光學拾音鏡頭是專為 650 nm/780 波長。因此，讀寫頭造成軸向激發(fā)和熒光的波長，這是（縮短焦距）重點轉移的結果色差。然而，這種轉變并不影響我們的掃描結果的方法和我們曾經(jīng)是物鏡掃描范圍是為激發(fā)波長決定的。因此，色散不會導致在出LIF 系統(tǒng)性能嚴重退化和。我們能獲得高靈敏度和重復性的結果。我們現(xiàn)在考慮所取得的成果時，LED 作為光源的采用。在我們的研究中，我們使用的最大排放 myjdengtfa 為 525 納米，40 納米半帶寬，15 個方向性的角度和一個 3.10毫瓦的輸出功率 LED 綠色（NSPG500S; Niehia 公司，日本德島） 。后通過物鏡近光功率為 0.15 兆瓦，約為總功率的 4.8％。圖 9 顯示了在這種情況下，為Resorufin 校準曲線。人們可以看到，檢測限為在 3 信號與噪聲的比例，這是約 20 分貝外，在圖 8 所示的情況下少約 11 海里。雖然靈敏度相對較低的情況相比，使用激光作為光源，它必須考慮到，這個替換提供了一個優(yōu)勢，該系統(tǒng)的規(guī)模變得非常緊湊，因此它的價格大幅降低。這可能是有益的，比較單位的激光功率的靈敏度和 LED.結論LIF 一種新型系統(tǒng)，用來作為測量探頭市售的激光頭的開發(fā)。該系統(tǒng)的性能進行了評價 LIF 通過使用 20 / IM 渠道深度 Resorufin 解決方案和測試芯片：芯片是由粘接 PDMS 和玻璃制造。據(jù)證實，通過使用一個光頭和一個簡單的振動的方法，測量系統(tǒng)的重復性，可以大幅度提高，而且足以彌補從安裝位置和運動而產(chǎn)生錯誤的芯片。我們研究了不同濃度的微芯片使用相同的方法對Resorufin 振動系統(tǒng)的響應。所獲得的響應曲線是在測量范圍 0.1-100 nM 的線性，檢測限被發(fā)現(xiàn)為 3 信號與噪聲的比例約為 800 分（320 zmol） 。這相當于常規(guī)系統(tǒng)。在重復測量的 RSD 值（N - 10）表示的重復性為 1.4％的單芯片測量和 2.1 芯片到芯片的測量％。這些結果是非常令人印象深刻的考慮，每個芯片單獨制作，每個芯片是手工安裝在實驗裝置。它表明，LIF 系統(tǒng)特別適合于在其靈敏度和重復性查看微流體器件測量的理想選擇。因此，該系統(tǒng)可以有效地用于微芯片化學，這就需要對極少量樣品的準確檢測分析。我們的系統(tǒng)是有用的，不僅對研究和發(fā)展的目的，而且，如環(huán)境監(jiān)測，生命科學和醫(yī)療的實際應用可取的，因為它比較便宜，結構緊湊，執(zhí)行快速測量。目前，我們正在開展一項關于一種利用熒光蛋白質(zhì)類型的診斷分析研究。我們應用我們的系統(tǒng)的免疫化學檢測分析的定性測定。在我們的下一個文件，我們將報告對我們的 LIF系統(tǒng)應用到這樣的例子詳細的分析。References[1] Kr?mer P M 1996 Biosensors for measuring pesticide residuesin the environment: past, present, and future AOAC Int. 79 1245-54[2] Morgan C L, Newman D J and Price C P 1996Immunosensors: technology and opportunities in laboratory medicine Clin. 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