一個高度敏感,高度可再生的激光熒光檢測系統(tǒng)1.介紹最近,生化分析的表現吸引了使用小的芯片人士的相當關注,因為它的許多優(yōu)勢于傳統(tǒng)的系統(tǒng)。最吸引人的特征是它的微芯片體積小。它的使用保證分離反應快速、高效和降低了相當數量的樣品和試劑要求進行分析。由于這個優(yōu)秀的特征,這種芯片也吸引了越來越多的環(huán)境監(jiān)測、生命科學和醫(yī)療保健等領域的重視水平,因為大批樣品用于分析在這些領域里是非常小的。然而,這些微晶片非常小的尺寸,同時要求非常高的檢測靈敏度。在不同種類的檢測方案用于測量激光熒光微流控設備的方法被認為是最敏感的方法之一。目前,有各種各樣的生活系統(tǒng)可用,包括一個單分子生活顯微鏡——敏感的液體。然而,很難快速發(fā)展,小和廉價的生活沒有減少系統(tǒng)的檢測靈敏度。為切實實施,特別是在分析技術,如免疫檢測法在醫(yī)學實驗室,測試芯片是需要一個一次性芯片?？梢杂袃煞N類型的生活系統(tǒng),由一個微芯片裝置和一個完整的熒光檢測系統(tǒng)。后者有技術上的優(yōu)勢,比如系統(tǒng)簡易一次性通過自動化測試帶和實施,以保證減輕實驗室設備的分析。然而,在“separation-type 的系統(tǒng),很難保持之間的相對位置相同的檢測系統(tǒng)芯片和測量的結果與不同的芯片,這導致實際實驗誤差。用常規(guī)的方法是高精度掃描。為了調整芯片和探測器之間的相對位置得體。這個要求導致必須使用很貴,又大又重的設備。這種情況也很難把這個系統(tǒng)在實際中應用。因此有必要開發(fā)一個廉價、緊湊的系統(tǒng),有一個簡單的機制和高靈敏度和高的重現性。為了實現這一目的,我們開發(fā)了一個相對廉價而緊湊的生活系統(tǒng),具有靈敏度高、重現性高。我們的系統(tǒng)利用商用貨車與一個高數字化光學鏡頭 1 -aperture 測量探針。此外,鏡頭致動器的使用,這是振動在水平和垂直兩個方向沿軸向推光致動器在合適的頻率在兩個方向上使用了一個簡單的方法。例如,如果我們運用系統(tǒng)測量微流體裝置,光束的焦斑將在水平和垂直兩個方向,然后掃描整個二維截面通道的設備在高速度。作為結果,你可以看到,測量可以獲得高靈敏度和重現性高,沒有微調的樣品間的地位,微處理器和檢測的頭。所以,我們的微型分析系統(tǒng)具有較高的性能和成本和空間都是有效的。2．系統(tǒng)描述2.1 流試驗裝置在這一節(jié)中,我們描述了微流控裝置,用來評估我們的系統(tǒng)的性能。大多數微流控設備的制造,在玻璃或硅。然而,許多當前的研究是基于聚合物微流控裝置正把注意力集中在 vdimethyl silox。由于其成本低,易于處理。此外,幾項研究已經報道了 PDMS-based 微流控裝置,是在光學透明 PDMS 波長范圍從 235跑到附近的范圍,因此紅外光學檢測在整個可見區(qū)域是可能的。這也是相當低的PDMS 比起其他聚合物。我們制造一個測試裝置,包括使用 PDMS 微通道。圖 1 顯示一個方案設計的測試裝置。芯片由地面板和蓋板(30×60×2.0 毫米,)和五種要素的流動通道十訪問端口相連在一起的渠道彈性矽管(1.6 毫米外徑:內徑:300 / xm),它是用來介紹/去除樣品測量、緩沖區(qū)和廢物。這兩個基質是由熱相互聯接空氣等離子體。首先,主人為微流控裝置的開發(fā)利用標準光刻和濕化學腐蝕方法:(1)渠道設計是由用土坯插畫家 10.0.3 然后打印出來到一個透明膜用作面膜。一層薄薄的積極 P-RZ300 光刻膠是自旋涂的表面一個空白的面具板暴露在一個具有長度燈光大約 2 分鐘通過透明玻璃幻燈片相一致。(2)為了獲得一個20 / xm 厚結構微通道,光刻膠被允許在一個開發(fā)者開發(fā)解決方案(PMER P-1S 東京 Ohka Kogyo);另一個 2 分鐘。模板與渠道設計作了進一步的 85 C / f 的烤箱烘焙 15 分鐘在熱板加強的粘著力和當時的逐漸冷卻到室溫 1 - 2 小時。在這個過程中,所有的光阻除了抵抗被定義在該地區(qū)的渠道。(3)以確保順利脫模,玻璃滑被放進一個(w / v(IV)鈰磷酸氫二銨溶液去除鉻層暴露。在 HNO 沖洗后 2 米大師:?的高度與渠道獲得了大約 20 個 ftm 蝕刻玻璃的1 米/我 NH4F 25 分鐘高頻解 25 度。(3)(Sylgard PDMS 溶液的制備以及東麗道康寧?:有限公司、日本東京,倒到主人)與一個框架舉辦的解決方案。(5)這是治愈入預熱 65 C / f 烤箱中 1 小時,其次是第二次治療 1 足總入預熱 100 C / f。(6)PDMS 固化芯片剝:阿玻璃主人、檢修口直徑 1.6 磁共振沖壓進薄片使用金屬管道。(7)芯片的 PDMS 不可逆轉的粘結在 1.2 毫米厚的玻璃盤子,它把兩個表面與氧氣等離子體才把他們帶進接觸[9]。硅管然后被插入2.2 光學檢測系統(tǒng)現在我們解釋光學檢測部分進行了詳細的介紹。我們的生活中用的描述系統(tǒng)如圖 3。對熒光激發(fā)光源是一個 CW 型銣雅鉻激光與第二口吃者自助組織的波長、箱梁直徑 1.2 毫米,一個輸出功率的 9.75 mW 及保證 1%的電力穩(wěn)定。peak-to-peak 帶寬的噪音從德 50 兆赫不超過 0.1%。通過激勵梁 25%的中性密度(第二濾波(輸出功率為 2.43 mW)和機械由微型電磁活塞與切碎 5 毫米中風(PI,開公司,東京,日本),必要的,可以避免熒光物弧的樣品。最大的斬波頻率的活塞是 60 赫茲。光束通過分光鏡和波長盤。然后從兩色鏡子反射之前被傳送到目標透鏡光學貨車與一個數值孔徑為 0.45(外向鈉)和焦距/ 3.17 毫米。梁是那么集中到一個小的區(qū)域并投射樣品。梁權力的價值目標,通過“房顫的鏡頭是 1.87 mW 及現場.mi 大小是 0.97。一個樣品持有人,它作為一種定位試驗裝置的向導,是擺在上面在目標透鏡的光學檢測部分。步進電機安裝在一邊的持有者和測試裝置,設置在持有者,定位和精密 40 項.im 在水平(X)的方向和 20 項在腸垂直(Z)方向英吉利海峽。對于多通道的測量,梁的運動之間的通道測試設備和客觀 drive-free 鏡頭的位置是大約 1.51 毫米。被吸收的光聚焦和發(fā)射熒光光再次在長波長(樣品= ^ 2)根據斯托克斯轉變。這是一輛熒光收集目標透鏡和一個鈉為 0.60(遷入)。光錐可以收集這個目標透鏡是 10.0%的總固體角度下,4 tt 假設發(fā)射光子輻射的四面八方。兩色的鏡子反射光波長為 550以下和傳輸光的波長,上面這只傳送熒光光譜。定位引導圖 3。我們的生活中用的描述系統(tǒng)與光學皮卡(左)。生活的外部視圖系統(tǒng)和一個測試裝置設置在樣品持有人(右)。其次,光是過濾后再舉一個過濾器,即發(fā)射帶通濾波器,玻璃只發(fā)射波長的熒光和檢測的光電倍增管(PMT 使用 R6355;Hamamat.su 光子 K.K.、日本),家庭。在輸出路徑,自制 conic-type 光學擋板的孔徑與一個 2 毫米×4 毫米為了減少裝配的反射和散射導致檢測的流浪光在并聯機床。當前所產生的光敏表面然后并聯放大大約 106 次乘數管內部一個電壓 700 V,然后輸入放大器電路。該電流轉換成電壓信號,又要放大大約有10 次放大電路。因此,價值的電壓信號量成正比的熒光發(fā)射抽樣綁定到流-通道。最大的輸出電壓信號范圍局限于 1.25 V 的在放大器終止登記,然后一個廣告轉換器采樣與 16 位分辨率在采樣率為 1.25 赫茲。然后通過信號是一個低通濾波器在采樣時間窗口,開出約 250 ms 在每個測量的基礎上請跟隨焊槍同步控制斬波頻率硒。然后分析了輸出數據是由一個數據處理單元。另一方面,光線的反射邊界是聚集在皮卡車鏡和反射的鏡子是兩色分光鏡和部分。光束通過柱透鏡和兩個焦點 points-one 前面和后面許多探測器探測到four-quadrant 則是一個二極管。檢測信號用于設置掃描范圍的目標透鏡致動器的基礎上,結合邊界的通道。我們的生活的關鍵特征系統(tǒng)是光學傳感器時,即客觀的鏡頭被安裝在音圈電機(VCM)。這是用來反復氯乙烯驅動物鏡處沿垂直方向和水平方向的渠道在掃描過程中,在這個系統(tǒng)中,我們采用了 dual-axis 目標透鏡(Funai 電子公司執(zhí)行。有限公司。日本的大阪),如圖 4.所示,其中有一個數值孔徑(南)0.45/0.60 / 3.17 的焦距 mm.震源深度 h 的一項 0.74±xm 和焦斑直徑 0.97 / cp,因為上述宋惠喬激光與 X \ 532 海里。自從鈉是可以選擇的根據光束半徑,我們使用了鈉對梁投影值為 0.45 到樣品和鈉值為 0.60 的熒光團有效。對冷凝利用控制信號和電壓幅值 1 V、執(zhí)行機構可以振動頻率的 640 赫茲以掃描范圍的±10 / xm 的重點發(fā)展方向和在 140 赫茲的頻率以掃描范圍的±150 / xm 在軌道方向。作為目標透鏡可以在高頻振動,我們的系統(tǒng)具有如下優(yōu)點在常規(guī)的生活體系。(1)高通量測量可以達到很高的速度掃描?在目標透鏡的焦點和跟蹤的方向。(2)一個小樣本的分布可以用高靈敏度高,因為目標透鏡鈉和一小束斑大小。也有可能,有效地提高了測量重現樣本數據進行平均。(3)一個適當的程序可以彌補振動差異之間的縫隙對不同芯片和探測器測量并能減少努力參與微調為每個測量。上述特征暗示我們的系統(tǒng)可適用于檢測,特別是在小卷過程,如微流控芯片毛細管電泳與交流——在 microreaetors 基礎。應該指出的是,我們已經適應的 epi -類型的照明系統(tǒng),在并聯機床位于側面的入射光垂直放置之上,以避免退化的設備檢測信號完整性因串擾而導致鄰近頻道之間,在測量在多通道的設備。我們估計端到端的效率的熒光檢測由考慮光路的損失:收藏熒光(10%)x 光透鏡皮卡率(88%)x 兩色鏡子(95%)x 發(fā)射濾波(90%)= 7.5%。這個結果相比一個商業(yè)生活系統(tǒng)或生活顯微鏡的 iHumiliation epi -類型的,通常用鈉為 0.2 - -0.5(= 2.5 - -6.0%)。在這個系統(tǒng)中,我們也可以采取一種發(fā)光二極管(LED)作為光源透鏡準直器和激勵設置過濾器在兩色的光通過鏡子。使用一個 LED 的優(yōu)點是系統(tǒng)的大小及其價格變得非常緊湊減少較多。然而,的敏感性也可能降低系統(tǒng)相比,這樣的情形,一個激光作為光源。2.3 方法論證我們現在說明操作的執(zhí)行機構和目標透鏡實驗中所用的測量方法。開環(huán)的動態(tài)響應特性的目標透鏡光學拾驅動器:(一)傳輸特性的重點發(fā)展方向的傳輸特性和(b)為軌道方向。作為準備,首先討論了執(zhí)行測量對象的掃描范圍應將鏡頭檢測驅動器之間的界線要解決渠道和玻璃鋼板或 PDMS 蓋板。重點發(fā)展方向的邊界之間的空白溶液和玻璃地面板或空白溶液和 PDMS 蓋板可由 S-curve astigmatieally 檢測誤差信號的關注。軌道方向的邊界之間的空白溶液和 PDMS 蓋板可以確定監(jiān)測信號的強度沿邊界反射的玻璃地面板和 PDMS 蓋板。因此,由執(zhí)行該操作,你可以把掃描范圍的焦點和氯乙烯兩軌跡的方向。雖然這 prescanning 邊界檢測的第一步是行之有效的情形的深度和廣度,微通道是未知的,它都不一定需要實驗,因為我們的深度和廣度,是眾所周知的,和粗糙的模擬精度調整(40 項腸和 20 /我在 X 和 Zdirections,早、晚稻的精度±20 /腸)已經在兩個方向上進行人用樣本的步進電機。因此,氯乙烯的范圍可以設定在推進運動,能夠覆蓋整個二維區(qū)域的 mierochannels 具有足夠的利潤。我們采用了以下方法為振動。該方法尤其適合用于 microchip-based 測量。在本研究中,我們使用高精度、同步信號,由正三角形橫掃 V \負面 V2 與適當的頻率,在集中(Z)和跟蹤(X)的方向。信號頻率的基礎上,確定結構的振動頻率的情況下,為 Z 方向是高于 X 方向)。在我們的系統(tǒng)中,由一個輸入信號產生一個 16 位分辨率與達變頻器在采樣率 4 兆赫,依照的輸出數據控制單元。因此,移動目標透鏡氯乙烯沿 X 軸方向多次掃描,而振動沿 Zdirection 同步。作為一個結果,束斑掃描整個 2 -維的部分通過移動 mierochannels 梁的焦點在高速度。在這個測量過程中,最大的測量值為每個往復運動在 Z 方向是由實時采集數據的分析使用控制單元。同樣的程序被執(zhí)行的 X 方向同時用較低的振動頻率。然后執(zhí)行的互惠周期是反復的平均周期為最高值都在每條通道被視為最終衡量價值的熒光信號的渠道。值得注意的在這里,可以實現高通量測量數據采集和分析因為數據進行互惠的循環(huán)中測量。在下一節(jié)里,研究表明,該振動方法提高上扮演相當重要的角色測量靈敏度高、重現性好,沒有進行微調 microchanncls 之間的相對位置,對檢測探頭在我們的生活體系。3．實驗部分3.1 輪廓測量過程的我們運用我們的生活流試驗裝置系統(tǒng)在第 2.1 節(jié)介紹的性能進行了評價,從而我們的體系。作為一種評價樣本,我們使用它被廣泛應用 Resorufin.,直接或間接地作為熒光標記 dve 為蛋白質的吸收和熒光光譜極大值 563 海里,587 海里,分別。以不同濃度的樣品的解決方案 Resorufin 高聚碘的制備方法為 0.1 M 系列稀釋磷酸鹽緩沖,pH 值 7.4(1:1,v / v)混合,然后加入樣品系統(tǒng)。水庫測試裝置是放置在試樣夾,大約 1.51 毫米以上被放置在目標透鏡的生活系統(tǒng)(圖 3,右)。設備被連接到微泵靜脈推注法的樣品聚醚醚酮管和解決方案,在流量泵 20 / iL 旻”從水庫 1 到每一個頻道。流量穩(wěn)定性±0.1%。然后,熒光信號的樣品的解決方案會流動通道主要通過測量系統(tǒng)使用振動方法求醫(yī),在第 2.3節(jié)介紹。在測量、運動梁之間的信道,連續(xù)流由步進電機的速度 20 毫米年代的基礎上,通過控制單元的命令,因此在多通道的觀測樣本進行了試驗裝置非常迅速。在我們的試驗中,我們將 V \ - 0.5 V,V2 = -0.5 V / m = 400 赫茲和/ 2 = 40 赫茲被考慮到試驗裝置和精密定位的 40 微米在 X 方向和 20 / .im 在 Z 方向移動。檢測到的最大體積的體積,由數值孔徑的物鏡處腰圍和梁的距離計算出頻道約有400 的質量。這是一個小的量檢測的優(yōu)越特性本系統(tǒng)。3.2 再現性改進首先,我們評估了變化的熒光信號的測量數據由于錯誤的微通道之間的相對位置和光學檢測芯片探針。從現場尺寸的激光很小,相對位置在每個通道和目標透鏡有影響的力量,從而輸出信號的測量結果。進行了測量和五種不同的芯片和 1.0×10“7 米 Resorufin 的解決方案。為了比較,Resorufin 溶液的熒光信號的約束來測量這兩個流道第一的目標透鏡情況就固定在初始位置和情況是在目標透鏡的振動頻率/ i = 400 赫茲和/ 2 = 40 赫茲(實驗 1)。然后,Resorufin 溶液的熒光信號的所有五頻道會用移動芯片沿 X 軸方向為了評價實驗渠道之間的變化(2)。在這些實驗中,十個測量每個實驗進行了以芯片和芯片和運動每束渠道之間的沿X 軸方向是自動控制每隔 5.0 毫米的步進電機。應該指出的是,每一片安裝按手在采樣持有人。因此,很明顯,利用光學貨車與振動方法,我們可以彌補錯誤而產生的安裝和運動的薯片,能有效地提高測量系統(tǒng)的結果的重現性相對位置沒有微調。這就提供了一個相當的優(yōu)勢在實際使用,因為它不需要發(fā)展復雜和昂貴的儀器對高精度定位。3.3。測量結果接下來,我們顯示測量的結果檢測特點的生活體系。測量不同濃度進行了Resorufin 的解決方案。生活的反應系統(tǒng),不同濃度的 Resorufin 如圖 8。我們可以看到,為Resorufin 響應曲線面積超過四個數量級,線性的測量范圍為 100 ~ 0.1 奈米。K2 的測量精度為 0.99 超過 0.95 標準的價值的便攜式測量儀器。測量時間,不包括時間包裝樣品溶液的 PDMS microehannel,需時不到十元的鈔票。檢測極限是大約 800 點在信噪比 3 種。絕對數量的樣品檢出率,估計大約有 320 zmol 抽樣注入體積大約 400 的質量。背景信號,即缺乏空白的程度上,是認定為22.23。檢測極限 800 點是與以前報道的結果,為大型 high-NA 熒光顯微鏡系統(tǒng)目標透鏡和激光熒光。因此,我們的系統(tǒng)能夠分析示例解決方案,具有靈敏度高、重現性高的振動目標透鏡光學拾定位準確。microehannel 沒有因此,我們已經發(fā)展了一種相對較小的廉價的分析系統(tǒng)具有優(yōu)良的性能。我們的系統(tǒng)可以容易實現的實踐,特別是分析技術在醫(yī)學實驗室免疫測定法等測試片,須芯片的單次,即系統(tǒng)包括一個一次性的微芯片以及光學檢測系統(tǒng)。在這些很難執(zhí)行高度敏感的測量由于具有較高的重現性誤差間的地位和探測器芯片的不同測量。這意味著我們的生活體制符合“分離式的系統(tǒng),因為它能提供成本、時間和空間——高效測量和高性能因使用一個簡化的測量方法與光學的獵物。把色散考慮在我們的光學系統(tǒng)中也是有必要的。我們的光學透鏡皮卡是專為 650 海里/ 780 海里波長的光。因此,小貨車頭軸彩色畸變引起的興奮和熒光波長,結果轉移重點(簡稱焦距)。然而,這種轉變并不影響我們的掃描的方法和結果一旦掃描范圍確定目標透鏡激發(fā)波長。因此,色散不引起嚴重的退化的生活體系和績效結果。我們可以獲得高靈敏度和重現性。我們現在考慮的結果被采納為當一個 LED 光源。在我們的研究中,我們使用一個綠色 LED 最大排放的myjdengtfa 525 納米,半帶寬的 40 海里,一個指向性的角度和輸出功率的 15 Niehia 3.10 mW(NSPG500S;公司,Tokushima。日本)。光束功率經過目標透鏡是0.15 mW,大約 4.8%的總功率。雖然靈敏度較低比情況下使用激光作為光源,它必須考慮更換提供了一個優(yōu)勢,這在該尺寸的系統(tǒng)變得非常緊湊的,因此其價格降低大幅度降低。它可能是有意義的比較敏感的單位功率激光和 LED。檢測極限時使用了 800 點激光在信噪比 3 種。因此,檢測靈敏度的 LED 系統(tǒng)幾乎是與生活。它們的區(qū)別在于光功率的有效性集中在通道。有效功率 LED 的通道僅為 4.8%,而總功率的激光輸出功率 77.0%(計算 2.43 mW 濾波,用一個日后過濾)。如果一個領導提供了較大的輸出功率和更有效的完成了橫向光的靈敏度 LED 系統(tǒng)可以進一步改進。4。結論生活系統(tǒng),使用一種商用光學測量探頭控制方法。這個系統(tǒng)的性能并利用求醫(yī),一個 Resorufin 溶液和芯片測試與一個通道,深度:20 /我是虛構的 PDMS 芯片由粘接和玻璃。實例證明,利用光學貨車和一個簡單的方法、結果的重現性與振動測量系統(tǒng)的劇烈,可以提高這足以補償位置誤差引起的安裝和運動的籌碼。研究了不同濃度的系統(tǒng)響應 Resorufin 在通道芯片使用相同的振動的方法。所得到的響應曲線的線性測量范圍 0.1 -100 海里和檢出限被發(fā)現大約 800 點(320 zmol)為 3.,信噪比與傳統(tǒng)的系統(tǒng)。結果的重現性相對標準偏差值表示為重復測量(n - 10)是 1.4%,2.1%,chip-to-chip 單片機測量尺寸。這些結果是非常令人印象深刻的考慮,每個芯片是虛構的,每個單獨芯片安裝按手在實驗的建立。這表明生活系統(tǒng)也特別適合微流控裝置測量針對其靈敏度和重現性。因此,該系統(tǒng)可有效地用于分析化學在芯片的檢測,這就需要非常少量的樣品準確。我們的系統(tǒng)是有用的,也是理想的不僅為研究和發(fā)展的宗旨也為實際使用如環(huán)境監(jiān)測、生命科學和醫(yī)療保健的水平,因為它是相對低廉,結構緊湊,能夠執(zhí)行快速測量。我們正在從事一項研究分析一種蛋白應用熒光診斷。我們已申請了我們對系統(tǒng)的定性的分析檢測。免疫在我們的下一篇論文中,我們將報告在詳細分析應用我們的生活系統(tǒng),這樣的例子。