大學(xué)本科生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)理論相關(guān)問題.doc
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細(xì)胞破碎1 常用的細(xì)胞破碎的方法有哪些?機(jī)械法,酶法,化學(xué)法,物理法2 有機(jī)溶劑法破碎細(xì)胞原理,常用的有機(jī)溶劑有哪些有機(jī)溶劑溶解細(xì)胞壁并使之失穩(wěn)。比如笨、甲苯、氯仿、二甲苯及高級醇等3 酶法破碎細(xì)胞原理酶分解作用4 反復(fù)凍融法破碎細(xì)胞原理通過反復(fù)將細(xì)胞放在低溫下突然冷卻和室溫下融化達(dá)到破壁作用層析技術(shù)1.什么叫層析技術(shù)?常用的層析技術(shù)有哪些?層析技術(shù)是利用混合物中各組分理化性質(zhì)的差別(分子親和力、吸附力、分子的形狀和大小、分配系數(shù)等),使各組分以不同程度分布在兩個相,其中一個是固定相,另一個是流動相,從而使各組分以不同速度移動而使其分離的方法。常用技術(shù)有分配層析,離子交換層析,凝膠過濾層析,親和層析,吸附層析2.指出常用層析技術(shù)的應(yīng)用范圍。凝膠層析法:脫鹽;用于分離提純;測定高分子物質(zhì)的分子量;高分子溶液的濃縮離子交換層析法:主要用于分離氨基酸、多肽及蛋白質(zhì),也可用于分離核酸、核苷酸及其它帶電荷的生物分子高效液相層析法:液-固吸附層析;液-液分配層析;離子交換層析3SephadexG-100凝膠柱層析分離蛋白質(zhì)原理是什么?大小不同的分子經(jīng)過的路線長短不同而達(dá)到分離作用4.用Sephadex G25脫鹽時蛋白質(zhì)和鹽哪個先出峰? 蛋白質(zhì)5.相對分子量為8萬和10萬的蛋白質(zhì)能否在SephadexG-75柱中分開?為什么?不能,分子量差距太小6.將分子量分別為a(90 000)、b(45 000)、c(110 000)的三種蛋白質(zhì)混合溶液進(jìn)行凝膠過濾層析,正常情況下,將它們按被洗脫下來的先后排序。 c、a、b7.離子交換層析與凝膠過濾哪種分辨率高? 離子交換層析較高。8.離子交換層析的原理?根據(jù)自交換樹脂對需要分離的各種離子的親和力不同而達(dá)到分離主要依賴電荷間的相互作用,利用帶電分子中電荷的微小的差異進(jìn)行分離9.如果樣品中只有Ala和His(Ala pI=6.0,His pI=7.6),在pH4條件下,這兩種氨基酸那一種與CM(陽離子交換劑)結(jié)合的緊密?如果用pH4-7的洗脫液梯度洗脫,那種氨基酸先洗脫出來?Ala10. 柱層析時濕裝柱的注意事項(xiàng)有哪些?用水灌注、不能有氣泡11.說說離子交換層析中洗脫液的選擇原則 陰離子交換劑選用陽離子緩沖液(如氨基乙酸、銨鹽、Tris等),陽離子交換劑選用陰離子緩沖液(如乙酸鹽、磷酸鹽等),以防緩沖離子參與交換過程,降低交換劑的交換容量。緩沖液pH值的選擇要使被分離物質(zhì)的電荷與平衡離子電荷的正負(fù)性相同。選用的緩沖系統(tǒng)對分離過程無干擾。要確定一定的離子強(qiáng)度。電泳原理1.常見的凝膠電泳有哪幾種?說明其主要用途,并比較其主要優(yōu)缺點(diǎn)。A醋酸纖維素薄膜電泳。用于血清蛋白,血紅蛋白,球蛋白,脂蛋白,糖蛋白,甲胎蛋白,類固醇及同工酶等的分離分析中。優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、快速、廉價缺點(diǎn)是它的分辨力不夠高。(比聚丙酰胺凝膠電泳低)B凝膠電泳。用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和生物化學(xué),如大的DNA或者RNA分子的分離,酶譜法等。優(yōu)點(diǎn)是操作簡便快速,可以分辨用其它方法(如密度梯度離心法)所無法分離的DNA片段。C等電聚焦電泳。應(yīng)用蛋白質(zhì)和兩性分子的分離等。兩性優(yōu)點(diǎn)是分辨率高,區(qū)帶清晰、窄,加樣部位自由,重現(xiàn)性好,可測定蛋白或多肽的等電點(diǎn)。缺點(diǎn)是需無鹽溶液,不適用于在等電點(diǎn)不溶解或發(fā)生變性的蛋白。2.從分離原理和實(shí)際應(yīng)用兩方面簡單說明SDS-PAGE和PAGE技術(shù)方法有何主要區(qū)別?非變性凝膠電泳,也稱為天然凝膠電泳,與變性凝膠電泳最大的區(qū)別就在于蛋白在電泳過程中和電泳后都不會變性。最主要的有以下幾點(diǎn):A. 凝膠的配置中非變性凝膠不能加入SDS,而變性凝膠的有SDS。B. 電泳載樣緩沖液中非變性凝膠的不僅沒有SDS,也沒有巰基乙醇。C.在非變性凝膠中蛋白質(zhì)的分離取決于它所帶的電荷以及分子大小,不像SDS-PAGE電泳中蛋白質(zhì)分離只與其分子量有關(guān)。D.非變性凝膠電泳中,酸性蛋白和堿性蛋白的分離是完全不同的,不像SDS-PAGE中所有蛋白都朝正極泳動。非變性凝膠電泳中堿性蛋白通常是在微酸性環(huán)境下進(jìn)行,蛋白帶正電荷,需要將陰極和陽極倒置才可以電泳。 5. 因?yàn)槭欠亲冃阅z電泳,所有的電泳時候電流不能太大,以免電泳時產(chǎn)生的熱量太多導(dǎo)致蛋白變性,而且步驟都要在0-4度的條件下進(jìn)行,這樣才可以保持蛋白質(zhì)的活性,也可以降低蛋白質(zhì)的水解作用。這點(diǎn)跟變性電泳也不一樣。所以與SDS-PAGE電泳相比,非變性凝膠大大降低了蛋白質(zhì)變性發(fā)生的機(jī)率3.影響蛋白質(zhì)電泳分辨率的主要因素有哪些?系統(tǒng)的pH值;.電場強(qiáng)度;.溫度;電滲作用4.聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白時,使用的電泳緩沖液PH8.3,那么樣品應(yīng)點(diǎn)在哪端?為什么?在負(fù)極。因?yàn)殡娪揪彌_液PH8.3時,血清蛋白的幾種蛋白電離后都帶上負(fù)電荷,所有只有點(diǎn)樣在負(fù)極端,外加電壓后,才能向正極移動,彼此才能分開。(PH值大于等電點(diǎn)時帶負(fù)電荷 ,小于等電點(diǎn)時帶正電)蛋白質(zhì)含量測定1 紫外吸收法與Folin-酚比色法測定蛋白質(zhì)含量相比,有何缺點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)?紫外吸收法優(yōu)點(diǎn):簡單快速,靈敏度高。缺點(diǎn):核酸干擾2 若樣品中含有核酸類雜質(zhì),應(yīng)如何校正?校正:計算待測蛋白質(zhì)溶液的OD280/OD260比值后,查(紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量校正數(shù)據(jù)表)校正因子“F”值,根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式-蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=F1/dOD280D計算該溶液的蛋白質(zhì)濃度;D-溶液的稀釋倍數(shù),d比色杯的厚度(cm)3 試說明考馬斯亮藍(lán)G250法的優(yōu)缺點(diǎn)。考馬斯亮藍(lán)G250 當(dāng)該染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后為青色 ,在波長595nm有最大吸收;其吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比。靈敏度高(0-1000 g/mL ),是常用的微量蛋白質(zhì)快速測定法。缺點(diǎn):、大量的去污劑如TritonX-100,SDS等嚴(yán)重干擾測定。B、蛋白質(zhì)與改染料2min反應(yīng)達(dá)平衡,其結(jié)合 物在室溫下1h內(nèi)穩(wěn)定。時間太長,結(jié)果偏低。離心技術(shù)1.相對離心力為30,000g,轉(zhuǎn)頭平均半徑為10cm,求轉(zhuǎn)速r/min (rpm)? (兩種方法) 2.制備離心機(jī)有哪幾種類型?比較它們的特點(diǎn)和用途。A普通離心機(jī);特點(diǎn)型號很多,容量不同,轉(zhuǎn)速不同,控制不精密;用途固液沉淀分離。B高速離心機(jī);特點(diǎn)型號較多,轉(zhuǎn)速不同,有控溫裝置,控制精密(時間、轉(zhuǎn)速),用途菌體、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器等的分離。C超速離心機(jī);特點(diǎn)控制精密:時間控制、溫度控制、轉(zhuǎn)速控制、真空系統(tǒng);細(xì)胞器分級分離、病毒、DNA、RNA、蛋白質(zhì)分離提純等。3.在離心場中物質(zhì)沉降的速度與哪些因子有關(guān)顆粒的沉降速度不僅與離心力有關(guān),而且與顆粒大小、密度以及介質(zhì)黏度有關(guān)。4.差速區(qū)帶離心法和等密度離心法的區(qū)別是什么?差速區(qū)帶離心法:根據(jù)分離樣品顆粒的不同沉降速度而分層;等密度區(qū)帶離心法:根據(jù)微粒的不同密度而分層。5.常用密度梯度的材料有哪些?糖類(蔗糖)、無機(jī)鹽(氯化銫)、硅溶膠(Ludox)、有機(jī)碘化物。6.幾種離心技術(shù)的特點(diǎn)?A沉淀離心:選定一定的時間、速度進(jìn)行離心,使樣品液中的大的固型物與液體分離,從而獲得沉淀或上清夜。又稱為固液分離法。使用普通離心機(jī)。B差速分級離心:在均勻介質(zhì)中,利用各種物質(zhì)粒子沉降速度的不同而分批分離的方法。C區(qū)帶離心法:利用各種粒子的沉降速度和浮力密度差異,當(dāng)一定粒子到達(dá)與其密度相同的梯度位置時則停止沉降,不同粒子處于不同位置,則得到了分離。沉淀技術(shù)1 蛋白質(zhì)沉淀的常用方法有哪些鹽析沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法2什么是鹽析,鹽析的原理,列舉鹽析時常用的鹽一般是指溶液中加入無機(jī)鹽類而使某種物質(zhì)溶解度降低而析出的過程。原理:蛋白質(zhì)在水中的溶解度受到溶液中鹽濃度的影響。一般在低鹽濃度的情況下,蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而增加,這種現(xiàn)象稱為鹽溶。而在鹽濃度升高到一定濃度后,蛋白質(zhì)的溶解度又隨鹽濃度的升高而降低,結(jié)果使蛋白質(zhì)沉淀析出,這種現(xiàn)象稱為鹽析。在某一濃度的鹽溶液中,不同蛋白質(zhì)的溶解度各不相同,由此可達(dá)到彼此分離的目的。主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉3簡述等電點(diǎn)沉淀及原理通過調(diào)節(jié)溶液的pH值至某種溶質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)時,使其溶解度降低,沉淀析出,而與其他組分分離的方法稱為 等電點(diǎn)沉淀法。原理:在等電點(diǎn)時,蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在,其分子凈電荷為零(即正負(fù)電荷相等),此時蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥,分子相互之間的作用力減弱,其顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀,所以蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時,其溶解度最小,最易形成沉淀物。等電點(diǎn)時的許多物理性質(zhì)如黏度、膨脹性、滲透壓等都變小,從而有利于懸浮液的過濾。4什么是有機(jī)溶劑沉淀,列舉常用的有機(jī)溶劑利用要分離物質(zhì)與其他雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同,通過添加一定量的某種有機(jī)溶劑,使某種溶質(zhì)沉淀析出,從而與其他組分分離的方法稱為有機(jī)溶劑沉淀法。常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等。酶的提取純化與活力測定1. 某酶在一定條件下,5 min內(nèi)使30 mmol底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物,問該酶的活力(IU)是多少?(每分鐘能催化 1 mmol 底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物所需要的酶量定義為1個國際單位 (IU))2. 從某細(xì)胞中提取的一種蛋白水解酶的粗提液300mL含有150mg蛋白質(zhì),總活力為360單位。經(jīng)過一系列純化以后得到的4mL酶制品(含有0.08mg蛋白),總活力為288單位。請問回收率是多少?純化了多少倍?比活力=酶活力單位數(shù)/酶蛋白質(zhì)量純化倍數(shù) =純化后的比活力 / 粗抽提液比活力產(chǎn)率(回收率) =純化后的總活力單位 / 粗抽提液總活力單位3.簡述酶分離純化的基本過程A抽提:破碎細(xì)胞,動植物組織一般可用組織搗碎器;或者加石英砂研磨,將材料做成丙酮粉或進(jìn)行冰凍融解 ;對細(xì)菌,常采用加砂或加氧化鋁研磨和超聲波振蕩方法破碎。 B濃縮:(常用的濃縮方法)加中性鹽或冷乙醇沉淀后再溶解,膠過濾濃縮以及超過濾濃縮法等。C純化:利用各種分離方法(鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、層析純化法、等電點(diǎn)法吸附分離法)進(jìn)行純化。D結(jié)晶:濃縮液經(jīng)過各種方法的純化,可得到較純的結(jié)晶產(chǎn)品。4 酶的制備及提取過程中應(yīng)注意哪些事項(xiàng)5 常用的酶活力單位?U(指在特定條件(25,其它為最適條件)下,在1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1微摩爾底物的酶量)、Kat(在最適條件下,1秒鐘能使1摩爾底物轉(zhuǎn)化的酶量)。1 Kat=6107U, 1U=16.67n Kat6 比活力概念及意義比活力用每毫克蛋白所含的酶活力單位數(shù)表示。比活力=酶活力單位數(shù)/酶蛋白質(zhì)量酶的比活力比活力代表酶制劑的純度。對于同一種酶來說,比活力愈大,表示酶的純度愈高。蛋白質(zhì)電泳1.簡述醋酸纖維薄膜電泳分離人血清蛋白基本原理。醋酸纖維薄膜電泳是用醋酸纖維素薄膜作為支持物的電泳方法。帶電顆粒在電場力作用下,向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象稱為電泳。由于各種蛋白質(zhì)都有特定的等電點(diǎn),如將蛋白質(zhì)置于pH值低于其等電點(diǎn)的溶液中,則蛋白質(zhì)將帶正電荷而向負(fù)極移動。反之,則向正極移動。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子在電場中移動的速度與其帶電量、分子的形狀及大小有關(guān),所以,可用電泳法將不同的蛋白質(zhì)分離開來。2.PAGE是現(xiàn)代生物科學(xué)研究中主要用來分離分析蛋白質(zhì)、酶等生物大分子的核心技術(shù)之一,該技術(shù)分辨率較高的主要因素有哪幾種?簡要說明。A.聚丙烯酰胺凝膠是一種透明而不溶于水的韌性凝膠,其在電泳中除了具有電泳的分離外,還具有分子篩的作用,故而提高了分辨率B聚合物分子中含有許多酰胺基,所以凝膠具有良好的親水性,能在水中溶脹但不溶解。.3.簡要說明SDS-PAGE技術(shù)方法原理及在科研中的應(yīng)用?原理:僅根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同就可以分開蛋白質(zhì)應(yīng)用:蛋白質(zhì)純度分析、蛋白質(zhì)濃度測定、蛋白質(zhì)水解分析、蛋白質(zhì)修飾的鑒定、顯示小分子多肽。4.影響電泳分離效果的主要因素有哪些?電泳介質(zhì)PH、緩沖溶液的離子強(qiáng)度、電場強(qiáng)度的影響、電滲、支持物選擇、電壓5.濃縮效應(yīng):在進(jìn)行SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)中由于凝膠孔徑的不連續(xù)性(2種孔徑)、緩沖液離子成分的不連續(xù)性(2種緩沖體系)、PH值(3種PH)和電位梯度的不連續(xù)性使得蛋白質(zhì)分子在濃縮膠和分離膠的界面處濃縮成一條狹小的縫帶,成為濃縮效應(yīng)。6.電泳技術(shù)涉及其主要儀器或設(shè)備有哪些?電泳槽、烘干機(jī)7.醋酸纖維薄膜電泳分離人血清實(shí)驗(yàn)方法中,透明液成分是什么?透明液:95%乙醇80ml,冰醋酸20ml混合。8.醋酸纖維薄膜電泳分離人血清實(shí)驗(yàn)方法中,染色液成分是什么?染色液:氨基黑10B0.5g 甲醇50ml 冰醋酸15ml 蒸餾水40ml 混勻9.醋酸纖維薄膜電泳分離人血清實(shí)驗(yàn)方法中,漂洗液成分是什么?漂洗液:95%乙醇4.5ml,冰醋酸 5ml,蒸餾水50ml混合。10. 醋酸纖維薄膜電泳分離人血清實(shí)驗(yàn)方法中,電壓正常范圍是多大?電壓過大會造成什么樣的結(jié)果?電泳電壓的大小,時間的長短與緩沖液的離子強(qiáng)度都有一定的關(guān)系。一般電流約0.40.6mA/cm,電壓110160V,通電時間4060min。電壓高,電流大,電泳速度加快,時間縮短,但薄膜上蒸發(fā)嚴(yán)重,因此不能無限增大電流。維生素C的測定1.指出本實(shí)驗(yàn)采用的定量測定維生素C的方法有何優(yōu)缺點(diǎn)?優(yōu)點(diǎn):簡便易行,快速,比較準(zhǔn)確。 缺點(diǎn):易受其它還原物質(zhì)干擾,滴定終點(diǎn)難以確定。2. 2,6-D的作用是什么?A.氧化劑的作用。還原抗壞血酸。B作為指示劑,判斷滴定終點(diǎn),以計算樣品含量3.滴定管的使用洗滌、裝液、計數(shù)、滴定紙層析分離氨基酸1為什么苯丙氨酸的Rf值大于賴氨酸因?yàn)樗c濾紙的吸附性很強(qiáng),故擴(kuò)散的慢,郵寄溶劑與濾紙吸附性差,故擴(kuò)散的快。苯丙氨酸是非極性氨基酸,其易隨著有機(jī)溶劑一起擴(kuò)散,而賴氨酸正好相反。故最后苯丙氨酸走的更遠(yuǎn)些,因而使苯丙氨酸Rf較大些。2為什么脯氨酸和茚三酮加熱后是黃色斑點(diǎn)脯氨酸等伯胺氨基酸與茚三酮反應(yīng)可生成黃色化合物。3說明紙層析和離子交換層析分離氨基酸混合物的方法是根據(jù)氨基酸的什么性質(zhì)?4紙層析和柱層析的一般操作步驟紙層析:點(diǎn)樣、層析、標(biāo)記前沿、烘干、顯色、得到層析圖譜、標(biāo)記色斑柱層析:裝柱、平衡、上樣、洗脫、收集、檢測、測定雙縮脲法測蛋白質(zhì)含量1 雙縮脲法定量測生物材料中蛋白質(zhì)是否適合所有樣品,如植物塊莖等不是。在生物實(shí)驗(yàn)中,雙縮脲是用來測蛋白質(zhì)的,現(xiàn)在是出現(xiàn)紫紅色。選材時要注意蛋白質(zhì)含量要高,材料顏色為白色或接近白色。故并非適用所有樣品。2.比色測定時為什么要設(shè)計空白管?通過溶液的光主要被吸光物質(zhì)吸收,但同時溶液、溶劑及比色杯對光也有少量的吸收和反射,從而引起誤差,此時,測定時常采用空白試驗(yàn)做參比。3.比值法雙縮脲法定量測定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)缺點(diǎn)?優(yōu)點(diǎn):快速,蛋白質(zhì)特異性影響小。缺點(diǎn):準(zhǔn)確度差,蛋白質(zhì)樣品被破壞,干擾因素不易排除。淀粉酶活力的測定1如何正確繪制和使用標(biāo)準(zhǔn)曲線?在制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時,標(biāo)準(zhǔn)液濃度一般可選擇5種濃度梯度,測其吸光值,以濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)繪制曲線,需要至少有三個點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線才可用,繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線只能供以后相同條件下操作測定相同物質(zhì)時使用。2.淀粉酶原液和1%的淀粉溶液置于40水浴中保溫的作用酶反應(yīng)需要適宜的溫度。只有在一定的溫度條件下才表現(xiàn)出最大活性。40C是淀粉酶的最適溫度,所以將酶液和底物先分別保溫至最適溫度,然后再進(jìn)行酶反應(yīng),這樣才能使測得的數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確。3.3,5二硝基水楊酸作用:提供堿性環(huán)境,使酶失去活性;做氧化劑,與還原糖反應(yīng),起到顯色作用。4.淀粉酶的最適溫度為40C,最適PH為5.6.5.如何操作能減小標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果誤差?A:標(biāo)準(zhǔn)液濃度的選擇:在制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時,標(biāo)準(zhǔn)液濃度選擇一般應(yīng)能包括待測樣品的可能變異最低和最高指,一般選擇5種濃度。濃度差距最好是成倍增加或等級增加,并應(yīng)與被測液同樣條件下顯色測定。B標(biāo)準(zhǔn)液的測定:在比色時,讀取光密度至少讀23次,求其平均值,以減少儀器不穩(wěn)定而造成的誤差。- 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