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FISH實驗步驟 一、實驗儀器： 熒光顯微鏡: 高速離心機：可達12000r/min 高壓滅菌鍋：160℃以上殺菌 恒溫箱：為雜交提供恒定溫度 恒溫水浴鍋 照相機（與熒光顯微鏡配套）：熒光捕捉圖片 二、試劑的配制： 1、0.2mol/ L (pH7.4)磷酸緩沖溶液(PB) 試劑為NaH2P042H20和Na2HP0412H2O。 -----0．2M的NaH2P04溶液: 31.2g NaH2P042H20,加蒸餾水1000mL溶解 -----0．2M的Na2HP04溶液: 71.632g Na2HP0412H2O 加蒸餾水至1000ml溶解 ----0．2M (pH7.4)磷酸緩沖溶液(PB) : 19ml的NaH2P04溶液和81ml的Na2HP04溶液充分混合 高壓滅菌，常溫保存。 2、0.03 mol/ L磷酸鹽緩沖溶液（(PBS） 試劑為NaCl和磷酸緩沖溶液PB ------0.03MPBS溶液：22.8gNaCl ，150ml磷酸緩沖溶液(PB) ，加蒸餾水至1000ml，混勻 ------0.02 MPBS溶液：取100ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至150ml ------0.01 MPBS溶液：取50ml 0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸餾水稀釋至150ml 高壓滅菌，常溫保存。 3、4%多聚甲醛溶液（1000ml）（在通風櫥內(nèi)進行操作） -----將略小于2/3體積的水（660ml）加熱到50℃， ------40g多聚甲醛PFA，邊攪拌邊加入到水中，繼續(xù)保持60℃ -------1滴2mol/LNaOH溶液，立即澄清，但仍有小顆粒。 -------1/3體積的PBS溶液， -------用Hcl將pH調(diào)至7.2，定容， -------用孔徑為0.22μm的濾膜過濾， ----4℃保存最多保存兩天，或者取少量保存在-20℃。 （加熱時溫度不宜過高，為60℃-65℃，否則PFA容易降解，配置好后應(yīng)盡快使用，否則固定效果較差）。 4、1mol/L(pH8.0)Tris-HCl緩沖液的配置 ---121.1g Tris(三羥基氨基甲烷), 加800mL蒸餾水溶解，加入大約42mL的濃HCl ---用1M的HCl或lM的NaOH將pH調(diào)至8.0，最后加蒸餾水至1000Ml 高壓滅菌，4℃冰箱保存。 5、10%SDS ---10g SDS（十二烷基硫酸鈉）于50ml滅菌水中，加水至100ml，分裝后室溫保存。滅菌，或用濾膜過濾 稱取SDS時需戴口罩！ 6、0.5M EDTA（pH8.0）溶液的配置 ---- 186.1g乙二胺四乙酸二鈉 加800mL蒸餾水溶解，劇烈攪拌(最好使用磁力攪拌機) -----用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH至8.0，然后定容至1000mL。 7、雜交緩沖液 配置2ml雜交緩沖液于2ml離心管中，各試劑的加入順序： 360μL 5M NaCl； 40μL 1MTris—HCl xμL 100％甲酰胺（見下表） yμL 無菌水（見下表） 2μL 10％SDS 0.22μm孔徑的濾膜過濾，4℃保存。 表1 配置不同甲酰胺雜交液中甲酰胺和無菌水的體積 甲酰胺濃度（%） 甲酰胺體積x（μL） 無菌水體積y（μL） 0 0 1598 5 100 1498 10 200 1398 15 300 1298 20 400 1198 25 500 1098 30 600 998 35 700 898 40 800 798 45 900 698 50 1000 598 55 1100 498 （甲酰胺有劇毒，操作時需戴手套，在通風處內(nèi)進行，廢液需要回收） 不同甲酰胺雜交液的配制 甲酰胺濃度（%） 5M NaCl溶液 （mL） 1M Tris-HCl (mL) 10% SDS (mL) 甲酰胺體積x（mL） 無菌水體積y（mL） 20 72 8 0.4 80 239.6 35 72 8 0.4 140 179.6 40 72 8 0.4 160 159.6 55 72 8 0.4 220 99.6 8、雜交后洗滌液的配置 配制50mL雜交洗滌液于50mL離心管中，各試劑加入的順序如下： Z μL 5M NaCl 1mL 1MTris-HCl(pH7.6) 無菌水加至50mL 50μL 10％SDS 500μL EDTA 表2 根據(jù)雜交緩沖液中甲酰胺濃度而定的探針清洗液液中NaCl體積數(shù) 甲酰胺濃度% NaCl體積z（μL） NaCl最終濃度（mM） 0 9000 900 5 6400 640 10 4600 460 15 3280 328 20 2250 225 25 1590 159 30 1120 112 35 800 80 40 560 56 45 400 40 50 280 28 55 200 20 不同甲酰胺對應(yīng)的洗滌液的配制 甲酰胺濃度（%） 1M Tris-HCl (mL) 10% SDS (mL) 0.5M EDTA （mL） 5M NaCl溶液 （mL） 無菌水體積（mL） 20 8 0.4 4 18 369.6 35 8 0.4 4 6.4 381.2 40 8 0.4 4 4.48 383.12 55 8 0.4 4 1.6 386 9、4,6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid (DAPI) 常備：1 mg l-1 需要稀釋為：1 g l-1 滅菌儲存在-20℃ (用鋁箔覆蓋管子) DAPI可誘變致癌，所以在使用時要戴手套并且收集廢液，包括早使用移液管時。 為了避免使用時對溶液造成污染，所有的溶液應(yīng)取出置于50ml管中，夠每天使用的量。 三、實驗步驟： 1、玻片的預(yù)處理： （1）玻片預(yù)處理 1）玻片清洗： 載玻片與蓋玻片用熱肥皂水刷洗干凈，在實驗室可用超聲清洗代替刷洗（4~5次 每次10 min），然后用清水浸泡過夜； 2）硅化處理： 第二天換用1%的鹽酸浸泡24小時，然后用蒸餾水清洗干凈后放入高壓滅菌鍋滅菌，60C烘干。蓋玻片用錫紙包好4C保存?zhèn)溆?。（蓋玻片干凈即可，不用處理） (2)黏附劑涂片制備 載玻片放入APES與丙酮的1:50溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）中約1min，取出用高壓滅菌處理過的蒸餾水清洗后于室溫下干燥（也可放入烘箱里25C烘干），然后置4℃保存?zhèn)溆? 2、熒光探針的選擇和標記（見fish探針的選擇表） 3、樣品的制備與固定 （1）用已滅菌的聚乙烯取樣管取反應(yīng)器內(nèi)泥水混合液1mL，加適量滅菌蒸餾水振蕩混勻，并用超聲波處理使細菌分散。取處理后的懸濁液約 0.5ml進行后續(xù)處理。 （2）將懸濁液混合均勻后，按1:1加入4%多聚甲醛，于4℃固定24小時， （3）然后置于12000r/min離心5min去除固定劑，將固定樣本加入1ml 0.0lmol/L PBS以10000r/min的速度離心漂洗兩次，棄去上清液。 （4）采用PBS與乙醇的1:1溶液稀釋定容至1ml于?20℃保存?zhèn)溆? 4、樣品的預(yù)處理 （1）用微型振蕩器將樣品混合均勻，取10μl樣品在載玻片上涂抹20mm20mm大?。ú灰螅?，37℃的烘箱熱固定2h，最高溫度不超過60℃ （2）風干后于50％、80％、95％的乙醇中各脫水3min，自然風干。 （脫水：準備三個瓷盤，然后將載玻片取出依次放入瓷盤中，用50%乙醇淹沒載玻片，脫水3min，取出放入第二、三個瓷盤，然后用80%乙醇脫水，96%乙醇脫水。脫水后的80%、96%乙醇回收。） 脫水后的玻片可以在室溫下保存幾個月，可在-20℃的條件下保存幾個月 5、原位雜交 探針濃度為50ng/μL， 在密閉的雜交盒內(nèi)鋪滿吸水紙（經(jīng)高壓滅菌烘干），用雜交液濕潤，使雜交環(huán)境保持一定的濕度。用移液槍分別取24μL的雜交液和1μL探針滴入帶有樣品的載玻片上（均勻覆蓋涂片面積），（加蓋硅化蓋玻片，不用）放入雜交盒內(nèi)進行雜交反應(yīng)。雜交溫度與雜交時間如下。 所有有關(guān)探針的操作在處理時都應(yīng)避光處理！ 探針種類 溫度（℃） 時間（h） 甲酰胺濃度% 備注 EUB MIX 46 5 20 同步染色法 AOB MIX 46 3 55 重復(fù)染色法 NOB MIX 46 5 40 重復(fù)染色法 GAO MIX 46 2.5 30 同步染色法 HGC69a 46 2.5 30 同步染色法 PAO651 46 2.5 30 同步染色法 6、雜交后洗滌 從恒溫箱中取出玻片之前將盛有清洗液的容器放入到48℃的水浴中預(yù)熱20分鐘。雜交完成后取出玻片，立即放入到預(yù)熱好的容器中。注意不能讓玻片干燥，不然將很難洗去非特異性結(jié)合的信號，增加背景染色。清洗液的量應(yīng)當淹沒玻片，清洗15～20分鐘后取出，用清水洗去剩余的清洗液，然后室溫下晾干。 7、DAPI染色 每個玻片用10μL DAPI（用甲醇稀釋至1μg/μL）滴加到載玻片樣品上，在冰上染色10min，用水沖洗多次，室溫下自然晾干，鏡檢前加蓋蓋玻片。 8、熒光顯微鏡觀察 經(jīng)過以上處理的樣品，用熒光顯微鏡進行觀察。 探針 目標菌群 探針序列 甲酰胺濃度 修飾 EUB338 Domain Bacteria GCTGCCTCCCGTAGGAGT 20% HEX NSO190 Ammonia-oxidizing bacteria CGATCCCCTGCTTTTCTCC 55% HEX NIT3 Nitrite-oxidizing bacteria CCTGTGCTCCATGCTCCG 40% FITC cNIT3b CCTGTGCTCCAGGCTCCG GAOQ989 Competibacter TTCCCCGGATGTCAAGGC 35% Cy5TM HGC69a Actinobacteria TATAGTTACCACCGCCGT 25% FITC PAO651 Accumulibacter CCCTCTGCCAAACTCCAG 35% Cy3TM Denitrifier CGGGAGGCAGCAGT 35% FAM 注：a探針濃度均為50ng/μL；bcNIT3為硝酸菌探針NIT3的競爭探針。 Abbreviation maximum absorption Maximum emission Filter set FITC（綠色） 492nm 528nm 10(Zeiss) DAPI（藍色） 365 nm 418 nm 02(Zeiss) CY3（橙色/紅色） 554 nm 570 nm 15(Zeiss) CY5（紅外線檢測） 650 nm 667 nm 26(Zeiss) HEX 探針的選用 選用EUB MIX(EUB338、EUB338Ⅱ、EUB338Ⅲ)來檢測活性污泥中的全部的細菌。 選用PAOMIX來檢測活性污泥中的聚磷菌， 選用AOB MIX NOBMIX來檢測活性污泥中的硝化菌。 選用GAOMIX探針來檢測活性污泥中的聚糖菌， 選用HGC69a探針來檢測反硝化聚磷菌的優(yōu)勢菌種Actinobacteria， 用PAO651來檢測優(yōu)勢菌種Rhodocyclus，雜交后用4 ,6-diamidino-2-phenylindole dihydro-chloride (DAPI) (1:1,000稀釋)和PHB進行 復(fù)染樣品。 試劑與材料： NaH2P042H20，Na2HP0412H2O； NaCl； 多聚甲醛PFA； 150g三羥基氨基甲烷 (Tris)，濃HCl，NaOH； 十二烷基硫酸鈉（SDS）； 乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）； 100％甲酰胺； DAPI； 載玻片，蓋玻片，吸水紙，瓷盤（帶蓋）；